פלזמה מהירה ובידוד של מרכיבי דם שלמים בדגימות שהתקבלה מהגדרה מבוססת-קהילה
30 בנובמבר 2015
אנו מתארים מתודולוגיה לעיבוד דם מלא כדי להשיג מגוון רכיבים להמשך ניתוח. ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול יעיל המאפשר עיבוד מהיר ותפוקה גבוהה בו-זמנית של דגימות דם מלא בסביבה לא קלינית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק פרוטוקול יעיל המאפשר תפוקת עיניים מהירה, עיבוד סימולטני של דגימות דם מלאות. בסביבה לא קלינית, עיבוד הוואקטיינר מתבצע בצורה חופפת כדי לאפשר בידוד יעיל של שברים באיכות גבוהה של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי D-N-A-R-N-A או סרום pbmc ושברים שיוריים של פלזמה ותאי דם אדומים. העיבוד מתחיל בצנטריפוגה של שואב האבק בסרום, הסרת אליקוט מאחד הכלים המכיל וואקוטיינר לבידוד DNA של צינורות הפיאל.
לאחר מכן יכול להתרחש השלמת בידוד ה- DNA לאחר בידוד DNA לויקוציטים שמקורו ב- K two EDTA. הדם מכל שואב אבק מועבר דרך מסנן מתאים ונשטף עם PBS, ולאחר מכן מטופל בחומר מייצב RNA החוזר לשואבי האבק המכיל פיאל. שאריות הפלזמה נשאבות והשכבה החד-גרעינית נשטפת ב-PBS.
בזמן שהצינורות מסתובבים, שאריות כדוריות הדם האדומות נאספות והסרום המופרד הוא aliquot. לבסוף, pbmc נשמרים במדיום הקפאת תאים. בסופו של דבר, ניתן לייצר שברים באיכות גבוהה של דם טרי תוך שעתיים מרגע האיסוף וכל הדגימות המוכנות לבדיקה יכולות להיות זמינות תוך יומיים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שניתן לבצע את ההליכים בו זמנית בסביבה לא קלינית, ובכך לייצר חומר התחלתי תוך יומיים עבור מספר רב של יישומים במורד הזרם, כולל ניתוחי R-T-P-C-R אפיגנטיים בזמן אמת וניתוחי ציטומטריית זרימה. מי שתדגים את ההליך תהיה איימי וקל, מנהלת המעבדה שלי שתתחיל בעיבוד דגימות דם מלאות. ודא שהמאגרים, הצנטריפוגה ובלוק החום הוכנו כולם.
תעד את זמן אספקת השואב בגיליון המעקב לדוגמה. לאחר קבלת הדגימות, יש לתעד את בידוד הסרום. זמן התחלה ביומן הדגימה התחל מיד בעיבוד על ידי צנטריפוגה של שואב הסרום של שבעה מיליליטר כשהבלם והתאוצה כבויים.
שימוש ברוטור דלי מתנדנד עם מכסי אירוסול למשך 20 דקות ב-1300 GS ארבע מעלות צלזיוס בזמן ששואב האבק בסרום עובר צנטריפוגה. תעד את שעת ההתחלה של בידוד ה- DNA במכסה מנוע של תרבית תאים BSL שני תאים. הפוך את מיכלי הוואקיו המכילים את ג'ל הפיאל חמש פעמים והוסף 200 מיקרוליטר של דם מלא מהחלק העליון של אחד השואבים לכל אחד משני 20 המיקרוליטרים של פרוטאז.
השאירו את צינורות הפרוטאז והמיקרו צנטריפוגות במכסה המנוע והמשיכו לצנטריפוגה של השיחה המכילה מיכלי ואקו. לפני צנטריפוגה. תעד את שעת התחלת הבידוד של PBMC, שחייבת להיות תוך שעתיים מרגע לקיחת הדם.
הפוך את קריאת ה-FI המכילה מיכלי vacu שכבר נמצאים במיכלים אטומים לתרסיס שמונה עד 10 פעמים. לאחר מכן צנטריפוגה את השואב עם ההפסקה וההאצה למשך 30 דקות ב-1600 Gs 22 מעלות צלזיוס. חזור לדגימות בידוד ה-DNA במכסה המנוע והוסף 200 מיקרוליטר של חיץ אל לכל אחד מצינורות הפרוטאז והמיקרו-צנטריפוגות בדם.
כסו את הצינורות והוציאו אותם ממכסה המנוע. ואז מערבל אותם למשך 15 שניות. לאחר המערבולת מהבהבת מיד, סובב את הדגימות.
המשך בבידוד ה-DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה עד שה-DNA נרמז מהעמודה על Ellucian. איגמנו את ה-DNA משתי העמודות לכל משתתף לתשואה כוללת של 800 מיקרוליטר למשתתף. תעד את זמן ההתחלה של בידוד RNA לויקוציטים.
פירסו את מחיצת הגומי של שואב האבק K two EDTA בעזרת ספייק העברה. שמור את הנדן ואת מכסה הבורג לשימוש מאוחר יותר לאחר הרכבת מערכת הצינורות K two EDTA. השתמש בקצה של מרית מתכת כדי לשחרר את המחט בבטחה והכנס את המחט לצינור איסוף דם ריק של 10 מיליליטר.
הפוך את מכלול צינור מקלט מסנן הוואקטיינר K two EDTA כדי להשלים את ההתקנה לאחר סינון ושטיפת PBS, משוך שלושה מיליליטר של חומר ייצוב ה-RNA באמצעות מזרק חדש של 10 מיליליטר. שטוף את המסנן וודא שחומר ייצוב ה-RNA יישאר מחובר. לאחר מכן נתק את המזרק מהפילטר מבלי להחזיר את הבוכנה.
אטום את כניסת ויציאת המסנן עם הנדן ומכסה הבורג שנשמר מספייק ההעברה והשאיר את המסנן רווי בחומר ייצוב ה-RNA. אחסן את המסנן במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות עד שהזמן יאפשר השלמת בידוד RA. לאחר החזרת השואב למכסה המנוע BSL two, הסר את הפקק והשתמש בפיפטה סרולוגית כדי למשוך 1.5 מיליליטר משכבת הפלזמה העליונה מבלי להתקרב לשכבה החד-גרעינית.
העבירו את הפלזמה משני השואבים לבקבוקון קריו של חמישה מיליליטר. לאחר מכן רשום את אמצעי האחסון שנאסף. העבירו את הפלזמה שנותרה ואת השכבה החד-גרעינית באמצעות פיפטה סרולוגית לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
לאחר מכן הוסף מספיק XPBS אחד שהוכן בעבר כדי להביא את הנפח הכולל בצינור החרוטי עד 15 מיליליטר. מכסה את הצינור והפוך אותו חמש פעמים. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור עם ההפסקה וההאצה למשך 15 דקות ב-300 GS 22 מעלות צלזיוס.
חזור למיכלי הוואקו המכילים במכסה המנוע ואסוף את כדוריות הדם האדומות או RBCs. השתמש בפיפטה של חמישה ושלושת רבעי אינץ' כדי להסתובב ולשחרר את החלק החיצוני של שכבת הג'ל ולהסיר אותה. השתמש בפיפטה סרולוגית כדי לאסוף ולהעביר את ה-RBCs לבקבוקון קריו של חמישה מיליליטר.
לאחר מכן רשום את אמצעי האחסון. לאחר מכן, העבירו את בקבוקוני הפלזמה וה-RBC קריו למיכל הקפאה בקצב מבוקר ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. לאחר 24 שעות, העבירו את הדגימות לקופסת קריו והחזירו אותן למינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח הארוך.
בסיום הצנטריפוגה, החזירו את הצינור החרוטי למכסה המנוע ושאבו את הנוזל, והשאירו 500 מיקרוליטר PBS מבלי להפריע לגלולה. הוסף XPBS אחד כדי להעלות את הנפח ל-10 מיליליטר ולהשעות מחדש את הגלולה. מכסים בעדינות את הצינור והופכים אותו חמש פעמים.
לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה עם הבלם ותאוצה כבויה למשך 10 דקות ב-300 GS 22 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, יש להוציא את שכבת הסרום העליונה מהשואב לשני בקבוקוני קריו של מיליליטר ולתעד את הנפח. השתמש בארבעה בקבוקוני קריו והכניס 200 מיקרוליטר לבקבוקון קריו.
אחד 1000 מיקרוליטר לתוך בקבוקון קריו שניים. לאחר מכן חלקו את הנפח הנותר לבקבוקוני קריו שלוש וארבע. העבירו את בקבוקוני הקריו לקופסת קריו ושמרו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
ותעד את שעת ההתחלה של המקפיא. המשך בבידוד PBMC. החזרת הדגימות למכסה המנוע לאחר צנטריפוגה, שאפו כמה שיותר סופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
אנו משעים את הגלולה ב -2.5 מיליליטר PBMC. בינוני. הוסף 2.5 מיליליטר PBMC, בינוני הקפאה שניים המכיל DMSO ו-RPMI.
בינוני לתמיסת התאים שהוכנה בעבר, ומערבל בעדינות את הדגימה. לאחר מכן הוציא 10 מיקרוליטר מתמיסת התא לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה. הוסף 10 מיקרוליטר של כתם כחול של 0.4% לתוך צינור המיקרו צנטריפוגה וערבב את התמיסה על ידי פיפטינג מספר פעמים.
לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר מהתערובת לתא ספירת תאים. החלק והנח את השקופית לדלפק התאים תוך שלוש דקות מרגע הערבוב. הגדל את התצוגה והתמקד בתאים.
לאחר מכן בחר לספור תאים כדי לקבל ספירת A-P-B-M-C. אם מספר ה-PBMC הבר-קיימא הוא מעל 3 מיליון תאים למיליליטר, יש להקצות את הדגימה למקסימום חמישה בקבוקוני קריו בריכוז של לפחות 3 מיליון תאים למיליליטר. כל אחד מהם מתעד את ספירת התאים לכל בקבוקון קריו ביומן הדגימות.
עיין בפרוטוקול הטקסט המצורף כיצד להמשיך אם מספר ה-PBMC הבר-קיימא נמוך מ-3 מיליון תאים למיליליטר. לבסוף, העבירו את בקבוקוני הקריו למיכל הקפאה בקצב מבוקר והניחו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. לאחר 24 שעות, העבירו את בקבוקוני הקריו לקופסת קריו והניחו את הקופסה בשלב האדים של מיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח הארוך.
תעד את שעת ההתחלה של המקפיא ביומן הדגימות. שיטות בידוד ועיבוד ה-RNA של לויקוציטים הניבו תמונת ג'ל זו הנובעת מאלקטרופורזה נימית. שתי רצועות נפרדות יוצרו עם השפלה מינימלית המייצגת ATT s ו-28 s RNA ריבוזומלי
.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ששמירה על רשומות מדויקות היא קריטית. אנו ממליצים לפתח מסד נתונים לאחסון כל המידע על בקבוקון הקריאו, כולל נפח, ריכוז, איכות, ברקוד ומיקום האחסון בתחילת הדרך. והמלצות נוספות על ארגון המדגם ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתווה מתודולוגיה יעילה לעיבוד דגימות דם מלא לצורך השגת רכיבים שונים לניתוח. הפרוטוקול מאפשר עיבוד מהיר בהספק גבוה בסביבה שאינה קלינית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- עיבוד דם
- בידוד תאים
- ניתוח דגימות ביולוגיות
רקע
- דם מלא מכיל רכיבים שונים שניתן לבודד לצורכי מחקר.
- עיבוד יעיל הוא קריטי לניתוח דגימות באיכות גבוהה.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות גוזלות זמן ופחות יעילות.
- מחקר זה מציג פרוטוקול מותאם להשגת יעילות גבוהה יותר.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהיר לעיבוד דגימות דם מלא.
- אפשרות לבידוד סימולטני של מרכיבי דם מרובים.
- שיפור איכות הפראקציות המבודדות לצורך ניתוחים המשכיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צנטריפוגציה של מבחנות ואקום לסרום (vacutainers).
- הוצאת אליקוט לצורך בידוד DNA.
- טיפול לייצוב RNA של דגימות דם.
- שטיפת השכבה המונונוקליארית באמצעות PBS.
תוצאות עיקריות
- בידוד יעיל של DNA, RNA ופלזמה מדם מלא.
- השגה של פרקציות איכותיות של תאים מונונוקלאריים של דם פריפריאלי (PBMCs).
- עיבוד יעיל המקצר את הזמן ומגדיל את התפוקה.
- פרוטוקול שניתן ליישום במסגרות שאינן קליניות.
מסקנות
- הפרוטוקול המותאם משפר את היעילות של בידוד רכיבי דם.
- הוא תומך בניתוח בספיקה גבוהה (high-throughput) בסביבות מחקר.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול מחקרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שבירה מהירה ואיכותית של דם שלם בסביבות מבוססות קהילה מאפשרת גישה ניתנת להרחבה למגוון דגימות ביולוגיות לצורך מחקר תרגומי וגילוי סמנים ביולוגיים. פרוטוקול זה תומך בשמירה חזקה על שלמות הדגימה ובתוצרים כמותיים החיוניים לניתוחים מולטי-אומיים, תוך הפחתת שונות פרה-אנליטית והרחבת הייצוגיות של האוכלוסייה. גישה זו מחזקת תהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת DNA, RNA, PBMCs וסרום המוכנים לבדיקה מקבוצות שאינן קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר איסוף של דגימות ביולוגיות באיכות גבוהה מאוכלוסיות המיוצגות בחסר לצורך מחקר מונחה-השערה.
- תומך במחקרי גנומיקה פונקציונלית ואפיגנטיקה על ידי אספקת DNA ו-RNA באיכות גבוהה מכל נבדק.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לניתוח מקבילי של מרכיבי דם מרובים מדגימה אחת.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספקת הכנה סטנדרטית וניתנת לשחזור של דגימות עבור בדיקות מולקולריות ותאיות המשך.
- מבטיחה תנובה כמותית ועקבית של PBMC וחומצות גרעיניות לצורך כיול ותיקוף של הבדיקה.
- מאפשרת תהליכי סריקה בקנה מידה רחב על ידי מזעור דגרדציית הדגימות ומקסימום של תפוקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- משפר את הרציפות התרגומית על ידי התאמת עיבוד הדגימות לקבוצות (cohorts) מבוססות קהילה בעולם האמיתי.
- תומך בגילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים באמצעות תוצרי דגימות איכותיים בעלי אנליטים מרובים.
- מפחית את הסיכון לגורמים מתבלים (confounders) פרה-אנליטיים במחקרי אוכלוסין ובמחקרים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
פרוטוקול זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר תרגומי על ידי מתן אפשרות לעיבוד מהיר וניתן לשחזור של דגימות ביולוגיות מאוכלוסיות מגוונות שאינן קליניות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת DNA, RNA ו-PBMCs באיכות גבוהה לבדיקת השערות וניתוח מסלולים.
- סריקה: סטנדרטיזציה של קלטי דגימות לפיתוח בדיקות מולקולריות ותאיות.
- אנליטיקה: מספקת פראקציות כמותיות המוכנות לבדיקה התומכות בהשוואות סטטיסטיות חסונות.
- מחקר תרגומי: משפרת את ייצוגיות האוכלוסייה ואת התאמת הביומארקרים במחקרי פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור מחקרים רב-מרכזיים ואורכיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות ביולוגית בשלבי מחקר מוקדמים.
- ערך תפעולי: מייעל את הלוגיסטיקה, מקצר את זמן העיבוד ומבטיח הדירות (reproducibility) בין אתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הכללה של קהל ניסוי רחב יותר וקבלת החלטות מושכלות יותר לגבי המשך הפרויקט (go/no-go).
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי שיפור איכות הנתונים והרלוונטיות התרגומית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית בטיפול בדגימות ביולוגיות ובתיעודן.
- דורש גישה לצנטריפוגה, לאחסון בקירור ולתשתית למעקב אחר דגימות.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לגבי זמנים ושלבי עיבוד.
- ניתן להתאמה למערכות גביהה של דם שונות ולסביבות קהילתיות.
- תלוי בתחילת עבודה מהירה לאחר הגבירה כדי לשמר את איכות הדגימה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:09
Serum, DNA, and PBMC Isolation Stage 1
3:49
DNA Isolation Stage 1
4:36
Leukocyte RNA Isolation Stage 1
6:02
PBMC Isolation Stage 2
8:06
Serum Isolation Stage 2 and PBMC Isolation Stage 3
10:30
Results: Ideal Leukocyte RNA Processing Yields
10:50
Conclusion
