ניתוח cytometry זרימת פרוטוקולים למשטח והתאי Antigen של סוגי תאים עצביים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הביטוי של אנטיגנים פני השטח והתוך-תאיים על תאים עצביים באמצעות ציטומטריית זרימה. זה מושג על ידי קצירת תאים עצביים תחילה מתרביות מבחנה או מרקמה עצבית ראשונית. לאחר מכן, כתם תוך-תאי אופציונלי לא ספציפי מוחל על התאים.

לאחר מכן האנטיגנים הרצויים על פני השטח מסומנים מיד בנוגדנים ראשוניים, ואילו האנטיגנים התוך-תאיים הרצויים מסומנים לאחר קיבוע וחדירה תאית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות על ידי שימוש בניתוח זרימה ציטומטרי לביטוי משותף של אנטיגנים פני השטח על תת-אוכלוסיות עצביות ספציפיות מעניינות כפי שהוגדרו על ידי תווית תוך-תאית. פרוטוקול זה ידגים כיצד להכין תאים עצביים שמקורם בתרבית רקמה לחקירת אנטיגנים פני השטח והתוך-תאיים עם ציטומטריית זרימה צבעונית.

כדי להתחיל לקצור, תאים עצביים דבקים הגדלים בצלוחיות T 75 על ידי שטיפת התאים בעדינות פעם אחת עם חמישה מיליליטר מגנזיום ו-PBS נטול סידן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן נתק את התאים מהבקבוק על ידי הוספת שלושה מיליליטר של תחליף טריפסין ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות. להרוות את העיכול האנזימטי על ידי הוספת שישה מיליליטר של מאגר זרימה לאחר שחרור גושי התאים על ידי פיפטינג של תרחיף התא למעלה ולמטה כמה פעמים, להעביר את כל תרחיף התא לצינור טרי של 15 מיליליטר כדי לבודד את התאים.

הנח את הצינור בצנטריפוגה, סובב את התאים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ושאף את ה-snat כהכנה לתיוג צבע תוך תאי. השהה מחדש את גלולת התא עם חמישה מיליליטר PBS בתוספת 0.1% BSA. אחרת, הוסף חמישה מיליליטר של מאגר זרימה בשילוב עם פרוטוקול הצביעה הכחול הסטנדרטי.

השתמש בציטומטר המו כדי להעריך את ספירת התאים האפקטיבית הקיימת. התאם מחדש את ריכוז התאים של התרחיף הקיים למיליון תאים ברי קיימא למיליליטר עם אותו מאגר ששימש בשלב הקודם. תאים אלה מוכנים כעת לשתי אפשרויות צביעה, כתם נוגדן אנטיגן פני השטח, או כתם תוך-תאי פלואורסצנטי אופציונלי עם קרבוקסי פלואורסצאין ואחריו כתם האנטיגן פני השטח שהוזכר לעיל.

כדי לבצע שלב תיוג תוך-תאי עם צבע אסתר CIN קרבוקסי פלואורסצאין, הוסף תחילה 10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי CFSE. על כל מיליליטר אחד של תרחיף תאים, הניחו את הצינור על שייקר ב-200 סל"ד ודגרו על התערובת למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, מנע פוטוהלבנה על ידי הגנה על הצינור מפני חשיפה ישירה לאור.

הרוו את כל הצבעים הלא מגיבים על ידי הוספת חמישה נפחים של סרום המכיל חוצץ זרימה ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב. לאחר מכן סובבו את התאים במשך חמש דקות בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ושאבו את הסופרנטנט כדי להסיר שאריות של צבעים לא מגיבים. שטפו את כדור התא על ידי החייאה, השעיה עם חמישה נפחים של מאגר זרימה.

לאחר מכן התאים מסובבים שוב בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפני שהם משליכים את ה-SUP natant. לבסוף, השעו מחדש את כדור התא עם מאגר זרימה כך שריכוז התא הסופי הוא מיליון תאים ברי קיימא למיליליטר. לניסוי מרובה, הוסף מספר שווה של תאים לא מוכתמים מעניין ממצב ניסוי אחר לתרחיף התאים המוכתמים CFSC.

התאים מוכנים כעת לתיוג אנטיגן פני השטח עם נוגדנים כדי להתחיל לצבוע את פני התא. העבר 100 מיקרוליטר של תרחיף התא עם או בלי תוויות CFSC לצינור טרי של 1.5 מיליליטר. הוסף נוגדנים מצומדים פלואור ארבעה לתרחיף התא בכמות שנקבעה בעבר על ידי בדיקות טיטרציה של נוגדנים.

הנח את הצינור על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר ב-100 סל"ד ודגרו על התערובת למשך 30 דקות. בהיעדר אור, יש לדלל את תערובת הנוגדנים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר זרימה. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב ולסובב את התאים במיקרו צנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס מקוררת מראש למשך ארבע דקות.

שאפו את השכיבה כדי להסיר את הנוגדנים הלא קשורים וחזרו על צנטריפוגת הכביסה והשאיפה. צעד עוד פעם אחת. ראוס משהה את כדור התא ב-100 מיקרוליטר, מאגר זרימה לתאים שהוכתמו קודם לכן.

הוסף 500 מיקרוליטר ממאגר הקיבוע ל-100 מיקרוליטר של מתלה התא. הנח את הצינור על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר ב-100 סל"ד ודגר במשך 15 דקות בחושך. הפורמלדהיד יצליב את כל מיני החלבון וה-DNA הנמצאים בסמיכות זה לזה ויניב תרחיפי תאים שאינם ברי קיימא.

מדללים את תערובת הקיבוע על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כמה פעמים לערבוב. לאחר מכן סובב את התאים הקבועים בצנטריפוגה מקוררת מראש של ארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. שאפו את הספינאט כך שיישארו 100 מיקרוליטר נוזל מעל גלולת התא כדי לחלחל את קרום התא לתיוג אנטיגן תוך תאי לאחר מכן.

הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר חדירה ל-100 מיקרוליטר של תרחיף תאים. הנח את הצינור על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר ב-100 סל"ד ודגר במשך 15 דקות בחושך. מדללים את תערובת החלחול על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS בעדינות למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב ולסובב את התאים הקבועים בצנטריפוגה מקוררת מראש של ארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

שאפו את ה-SUP natant לחלוטין לפני הדגירה. הכן מלאי עבודה ראשוני של נוגדנים על ידי דילול הנוגדן ב-PBS בתוספת 0.5% בין 20 מאגר. זה מועשר עוד יותר בסרום חמורים 1% BSA 10% או 10% סרום עיזים.

לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא החדירה לממברנה עם 100 מיקרוליטר ממלאי הנוגדנים הראשוני. הנח את הצינור על שייקר אורביטלי בטמפרטורת החדר ב-200 סל"ד ודגר במשך 30 דקות בחושך. יש לדלל את תערובת הנוגדנים העיקרית על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר זרימה.

פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב ולסובב את התאים בצנטריפוגה מקוררת מראש של ארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות. שאפו את השכיבה לחלוטין כדי להסיר את הנוגדנים הלא קשורים. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה עם 100 מיקרוליטר ממלאי הנוגדנים המשני.

חזור על הדגירה בטמפרטורת החדר המוגנת באור למשך 30 דקות. באותו שייקר, יש לדלל את תערובת הנוגדנים המשנית על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר זרימה. חזור על אותו ערבוב היפוך צינורות, סיבוב והסרת סופרנטנט כדי לחסל את כל הנוגדנים הלא קשורים.

חזור על אותם שלבי צנטריפוגת כביסה של מיליליטר אחד והסרת סופרנטנט פעמיים נוספות, אך עם PBS טרי כמאגר הכביסה. במקום זאת, התוצאה הסופית תהיה גלולת תא נקייה המסומנת בנוגדנים פלואורסצנטיים ממוקדים חוץ-תאיים או תוך-תאיים או כל שילוב של שלושת ההשעיה, גלולת התא המסומנת ב-150 מיקרוליטר של מאגר זרימה. העבר את מתלה התאים לציטומטר הזרימה והתחל בניתוח עם הגדרות עירור הלייזר ומסנן הפליטה המתאימות לכל קומה של ארבע.

שימוש בנתוני הפיזור קדימה והצד כמדריך, הגדר פיזור ראשוני קדימה לעומת פיזור צדדי בתוך תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה כדי לא לכלול נקודות נתונים לא ספציפיות כגון פסולת תאים ותאים מתים. לאחר מכן, תוך שימוש בנתונים גולמיים מתרחיף תא לא מוכתם כבקרה שלילית, הגדר מספר שערי אינטגרציות פלואורסצנטיות הבוחרים אותות פליטה חיוביים מתוויות אנטיגן חוץ-תאיות ותוך-תאיות כאחד כדי להסביר פלואורסצנט רקע מצבעוניות. השפעות חפיפה ספקטרליות מתאימות מחדש את השערים הפלואורסצנטיים באמצעות נתונים גולמיים מבקרות מוכתמות של נוגדנים בודדים.

בניסוי פקס מרובה, תגי פלואורסצאין קרבוקסי יכולים לשמש כאות בסיס שיכול להבחין בין תאים משתי שושלות שונות או תנאי ניסוי ללא שימוש בנוגדן. לדוגמה, בתרחיף תאים הטרוגני, ניתן להבדיל באופן מיידי בין תאים עצביים המתויגים ב-CFSC לעומת פיברובלסטים לא מתויגים רק על ידי התבוננות בנוכחות או היעדר פלואורסצנטיות בערוץ הירוק. יתר על כן, בשילוב עם תיוג אסתר CFSE, ניתן להשתמש בנוגדנים פלואורסצנטיים בצבעים שונים כדי לקבוע את הביטוי הדיפרנציאלי של אנטיגנים פני השטח בין תת-קבוצות CFSE המסומנות לעומת תת-קבוצות לא מסומנות בתוך מדגם מעורב.

לדוגמה, תאי נוירובלסטומה SHSY חמישה Y המסומנים ב-CFSE בתעלת הקרינה הירוקה, ביטאו במשותף רמות גבוהות של אנטיגן פני השטח CD 24, אך לא של סמן הפיברובלסטים CD 54. לעומת זאת, פיברובלסטים BJ שליליים של CFSC חיוביים ל-CD 54 עם רמות נמוכות יותר של CD 24. ניתוח של אנטיגנים על פני השטח העצביים יכול להתבצע גם בשילוב עם זיהוי מבוסס נוגדנים של אנטיגנים תוך-תאיים.

הכללת דגימות לא מוכתמות ובקרות מוכתמות בודדות עבור אנטיגנים פני השטח ואנטיגנים תוך-תאיים היא קריטית כחלופה לתיוג מבוסס נוגדנים ראשוניים ומשניים של אנטיגנים תוך-תאיים כגון מפת הסמן העצבי השנייה המוצגת כאן. תיוג פלואורסצנטי לא קוולנטי של הנוגדן הראשוני יכול להניב תוצאות דומות בניתוח ביטוי משותף ולקצר את הפרוטוקול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תאים עצביים לניתוח ציטומטרי זרימה בסיסי באמצעות גישות תיוג חלופיות שונות ושילובים שלהן.