Name: תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: חקור אפיון תאי גזע מהונדסים באמצעות מערכת סקרינינג High Content Screening לצילום תאים חיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח התנהגות תאית ושיעורי התמיינות לפני שימוש in vivo בחולדות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון למחקר זה ניתן על ידי פיקוד המחקר והציוד הרפואי של צבא ארה"ב (חשבון מענק מס' W81XWH-11-1-0700) והקרן לחקר תאי גזע. PAB ו-EMP זכו בהתמחות קיץ במעבדה לתואר ראשון של מעבדת איימס (SULI).

1. הכנת תשתית לצלחות 96-היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מפה של הצלחת 96-היטב המתארת ​​את מצעים השונים ותא-סוגים להיבדק (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את מניית הפתרונות של מצעים שונים [poly-L- ליזין, פיברונקטין, קולגן סוג אני, laminin, וIV-laminin entactin-קולגן (ECL)], צלחת ו96-היטב multiwell להכין תחנת עבודה בתרבית תאים סטריליים מכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מצעים בודדים על ידי דילול מניות בפוספט סטרילי שנאגרו (PBS) לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מיליליטר (ריכוז זה נקבע בעבר על בסיס assay תלוי ריכוז מצע לצמיחה והתפשטות של תאים). מערבבים בעזרת מערבולת לפני המזיגה למאגר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון מצע 100 μl היטב לתוך כל אחד על פי מפת 96-היטב (איור 1) (micropipette 12 או ערוץ 8-נוח לmicropipetting לתוך צלחת 96-היטב). לאטום את המכסה לצלחת 96-היטב באמצעות רצועה של Parafilm ולאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> הדמיה ציפוי והזמן לשגות 2. תא הערה: עכבר MSCs היו מבודד ממוח העצם של מבוגרים C57BL / 6 עכברים ומתוחזק כקו תא חסיד. MSCs היו נגוע באמצעות וקטורי lentiviral להנדס אותם להפריש המופק במוח גורם neurotrophic (BDNF; cDNA אדם) וגורם נוירוטרופי שמקורן בתאים גליה (GDNF; cDNA אדם) באמצעות של וקטור lentiviral BDNF (LV-BDNF קידוד; CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), וירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). הערה: תקשורת תרבות לתאי גזע mesenchymal העכבר (MSCs) היא השינוי בינוני של Iscove של Dulbecco המכיל 10% בסרום hybridoma מוסמך שור עוברי, 10% בסרום סוסים, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, ו10,000 U / פניצילין מיליליטר, 10 מ&quot;ג / סטרפטומיצין מיליליטר . חמישה סוגים שונים של תאי גזע של עכבר (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-Mמאמנים וBDNF / GDNF-GFP-MSCs) היו מצופים בנקודת מפגש כ -30% בצלוחיות תרבית תאי T75. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, להסיר את פתרונות מצע על ידי שאיפה ולשטוף היטב כל אחד עם כ -200 μl של PBS סטרילי, פעמיים. הוסף מדיה תרבית תאים (200 μl / טוב) זה טוב אחרי שטיפת PBS הסופית. מניחים את צלחת 96-גם לתרבית תאי חממה נקבעה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לאיזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הצלחת 96-היטב היא equilibrating בחממה, לקצור את התאים (תאי גזע בצלוחיות T75 צריך להיות כ 70% ומחוברות בזמן קציר / ציפוי) על ידי איסוף תקשורת הצמיחה (המכונה בתקשורת מותנית כ) מהבקבוק T75 ו אחסון בצינור חרוטי 15 מיליליטר בתנאים סטריליים (תקשורת מותנית זה תשמש בשלב 2.1.4 להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מיליליטר של PBS סטרילי לבקבוק ועדינות מערבולת ואז פיפטה את PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של טריפסין 0.05% ושל 0.01%פתרון EDTA לנתק את התאים ממשטח התרבות של בקבוק T75. צג ניתוק תא על ידי צפייה בבקבוק באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת באופטיקה בניגוד שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים יש מנותקים, להוסיף באופן מיידי 8 מיליליטר של התקשורת המותנה (שנאסף בשלב 2.1.2) לבקבוק. אסוף את ההשעיה התא ולהעביר לצינור 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה ו צנטריפוגות למשך 4 דקות ב 450 XG לגלולת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 200 μl של טרי וחימם תקשורת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר התאים בהשעית התא על ידי ביצוע ספירת תאי trypan כחולה קיימא באמצעות hemocytometer. צלחת התאים בצפיפות של כ -300 תאים / גם לתוך הבארות המתאימות של 96 גם הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים אלה עבור כל אוכלוסייה של תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן לשגות הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל MSCs כבר מצופה, מקוםצלחת 96-היטב לחממה עבור שעה 2 כדי לאפשר לMSCs לצרף המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את מערכת HCS ולהמתין לשעה 2 למערכת כדי לאזן. הגדר את בקר הסביבתי עד 37 מעלות צלזיוס ולהתחבר בלון גז מעורב המכיל 5% CO 2 באוויר לתא הסביבתי מערכת HCS אספקת מקור אוויר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת 96-היטב מן החממה לאחר תקופת איזון שעה 2 ומקום ישירות לתוך תא צמיחת תאים של מערכת HCS. לאפשר 30 דקות לאיזון לדין וחשבון על כל הרחבה הקשורות לחום של הצלחת ולאחר מכן להפעיל את תוכנת רכישת תמונה וניתוח כדי לקבוע את הגדרות הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מטרת 20X להדמיה. בחר שתי בארות לכל מצב [כלומר, GFP-MSCs על פיברונקטין וכו &#39;(6 מצעים x 5 תת MSC עבור הסכום כולל של 30 תנאים x 2 משכפל = 60 בארות בסך הכל)] להקמת הדמיה הזמן לשגות. בחר שני אתרים להדמיה עםבכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אורכי גל האור הנכונים להדמיה. הערה: שני אורכי גל שונים (בניגוד שלב וקרינת GFP), שנבחרו לזמן לשגות הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בתחתית גם באמצעות פוקוס אוטומטי לייזר ולקחת תמונות מבחן למספר רבים של אתרים ובארות רבות למצוא מישור מוקד מותאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוקד כבר נקבע, להתחיל בלכידת תמונות כל 5 דקות במשך 48 שעות לכל 60 בארות (120 אתרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את התאים בכל שעה 24 על ידי הסרת הצלחת 96-היטב ממערכת HCS. הסר 75 μl של תקשורת מכל טוב ולהוסיף תקשורת טרי 100 μl היטב כל אחד (לאזן תקשורת טרי זה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של ניסוי הזמן לשגות, להסיר את הצלחת 96-היטב ממערכת HCS. בתנאים סטריליים, לאסוף דגימות התקשורת המותנות מכל טוב ולהעביר דגימות אלה למשנהו צלחת 96-היטב. הערה: דגימות אלה יכולים לשמש לanalys נוסףהוא על ידי ביצוע ELISA לגורמי neurotrophic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחת 96-היטב עם MSCs התרבותי למבחנים נוספים, כגון assay התפשטות תאי Ki67 או יודיד propidium החי assay צביעה מת / (ראה פירוט בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח הזמן לשגות הדמיה למעקב הגירה / תא תא כאמור בסעיף 5 להלן. </li></ol></li></ol> התפשטות תאי 3. Ki67 ויודיד Propidium Live / Assay המלח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cell Ki67 הפצת הנשק Assay (Immunocytochemistry) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תרביות תאים עם 0.1 פוספט M (4 PO) חיץ לרגע אחד שתי פעמים. תקן את התרבות עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את PFA ולשטוף את הבארות עם PBS במשך שבע דקות, שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית, להוסיף פתרון של חוסם 100 μl (מלוח חיץ פוספט, 5% בסרום חמור רגיל, 0.4% בסרום אלבומין שור, ו -0.2% Triton X-100) לכל אחד גםnd דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. הכן את הנוגדן הראשוני, ארנב נגד Ki67, על ידי דילול בפתרון חוסם ביחס עבודה של 1: 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון חוסם וליישם את פתרון הנוגדן הראשוני 100 μl היטב כל אחד. מכסה את צלחת 96-היטב דגירה הדגימות ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, להסיר את פתרון הנוגדן ולשטוף עם PBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנוגדנים משני, חמור נגד הארנב Cy3 בחסימת פתרון ביחס עבודה של 1: 500. להוסיף כתם גרעיני DAPI לפתרון נוגדנים משני בדילול של 1: 100. לאחר הסרת שטיפת PBS האחרונה, חל מפתרון הנוגדן / DAPI המשני לכל 100 μl היטב. דגירה בטמפרטורת חדר בחושך במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן / פתרון DAPI המשני ולשטוף היטב עם כל PBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. מכסה את צלחת 96-היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Propidium יודיד Live / Assay המלח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד מוות של תאים על ידי יודיד propidium assay הדרה (PI) כפי שיתואר להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון כתם יודיד propidium בריכוז של 1.5 מיקרומטר בתקשורת ובתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של 70% אתנול 100 μl ולאחת מMSCs 2 דקות עם הכוונה להרוג תאים אלה. גם זה משמש כביקורת חיובית לכתם לצרכן. רוב MSCs יהיה המציין מוות של תאים מוכתמים PI. הסר את פתרון אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון כתם יודיד propidium 100 μl לכל היטב דגירה במשך 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים עם חיץ פוספט 0.1 M דקות 1, 2 פעמים. תקן את התאים עם 4% PFA ב 0.1 חיץ M P0 4 במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את PFA ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם פתרון DAPI (01:50) בדילול מלא בפתרון חוסם עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. יש לשטוף את כל הבארות עםPBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון DAPI ולשטוף היטב עם כל PBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. מכסה את צלחת 96-היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה. </li></ol></li></ol> ניתוח 4. אוטומטי הדמיה וMultiwavelength ניקוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון צלחת 96-היטב (מעובד בעבר עבור immunolabeling Ki67 או מוכתם יודיד propidium) למערכת HCS ולאפשר את הצלחת לאזן במשך 20 דקות פתחו את תוכנת רכישת תמונת מערכת וניתוח HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הגדרות רכישה למטרת 10X באמצעות המצלמה binning ליום 1 ובהגדרת רווח של 2. מצא את Z-המטוס שבו התאים מתגוררים על ידי ניצול פונקצית החשיפה האוטומטית ולחשב את הקיזוז לכל אורך גל של עניין. בניתוח זה, ללכוד תמונות לDAPI (W1), Cy3 (W2), וFITC (W3). בחר את רמת העצמה המקסימלית שבבארות השליטה השליליות להראות שום אות לרכישת תמונה. לאשר הגדרה זו מתאים לקופהבארות itive. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש צלחת. צלם תמונות ולאחסן אותם ברכישת התמונה ותוכנה באתר של ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתמונות נרכשו, תוכנת תמונה פתוחה רכישה וניתוח לא מקוונת וצלחת סקירת נתונים מהתמונות שנרכשו לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ניתוח ניקוד Multi-גל. הגדר את המינימום ומקסימום עוצמות לכל אורך גל. הערה: זיהוי DAPI אמור לסמן את ההכתמה מסביב לכל גרעין גלוי. Cy3 אמור לזהות את התאים החיוביים עם immunoreactivity Ki67 (IR) ולא צריך לזהות IR תחת הבקרה השלילית. לCy3 Ki67 IR, הרוחב המינימאלי המשוער היה 7 מיקרומטר, רוחב מרבי משוער היה 30 מיקרומטר, העצמה מעל הרקע המקומי הייתה 150 רמות אפורות, ואת האזור המוכתם המינימאלי היה 50 מיקרומטר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח לרוץ לכל העמדות. לייצא את הנתונים כדי להציג בגיליון אלקטרוני. </li></ol> מעקב 5. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> acquisitio תמונה פתוחהn ותכנית ניתוח ולחץ על &quot;נתונים פלייט הסקירה [DB] ...&quot;, בחירת הצלחת של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את הנתונים כ&quot; זמן לעומת ובכן &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אחד מהאתרים מהמדור &quot;האתרים&quot; על ידי הקלקה על הבחירה הרצויה. בחר באפשרות &quot;מועבר ...&quot; תחת &quot;אורכי הגל:&quot;. לחץ לחיצה ימנית על היעד גם בתבנית צלחת 96-היטב ולחץ על &quot;תמונות טען&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר התאים על ידי לחיצה על &quot;Apps&quot; ולאחר מכן &quot;אובייקטי מסלול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;Dynamic Data Exchange (DDE)&quot; לבחור את הפורמט כדי לייצא את הנתונים, למשל, Microsoft Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את נתוני מעקב ליצוא, למשל, זמן שחלף, מספר אובייקט, מרחק, מרווח זמן, מהירות, זווית מוחלטת, מרחק למקור, x ו- y דלתא הדלתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתייג כל תא של עניין עם &quot;מקש Ctrl + לחיצה השמאלית&quot; על תאי יעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מסלול. אם יש צורך, להפסיק / לשנות מעקב לא תקין של תאים עם המקש &quot;Esc&quot; ולאחר מכן להתאים את ההגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מעקב התא הוא מלא, לשמור את הנתונים עם &quot;יומן נתונים&quot;. </li></ol>

<ol><li>Thoenen, H., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins%3A+from+enthusiastic+expectations+through+sobering+experiences+to+rational+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches.</a> Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).</li>
<li>Park, H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+regulation+of+neural+circuit+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin regulation of neural circuit development and function.</a> Nature reviews. 14, 7-23 (2013).</li>
<li>Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLin%2C+LF+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 260, 1130-1132 (1993).</li>
<li>Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+and+migration+of+human+bone+marrow+stromal+cells+implanted+in+the+brains+of+albino+rats--similarities+to+astrocyte+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).</li>
<li>Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+strategy+for+cell+and+gene+therapy%3A+harnessing+the+power+of+adult+stem+cells+to+repair+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).</li>
<li>Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+the+spinal+cord+following+intravenous+delivery+of+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells.</a> Glia. 39, 229-236 (2002).</li>
<li>Hofstetter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+stromal+cells+form+guiding+strands+in+the+injured+spinal+cord+and+promote+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).</li>
<li>Chopp, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+neural+injury+with+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Treatment of neural injury with marrow stromal cells.</a> Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+marrow+stromal+cells+restores+cerebral+blood+flow+and+reduces+cerebral+atrophy+in+rats+with+traumatic+brain+injury%3A+in+vivo+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study.</a> Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).</li>
<li>Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+into+acid+sphingomyelinase-deficient+mice+delays+the+onset+of+neurological+abnormalities+and+extends+their+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).</li>
<li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+BDNF-secreting+mesenchymal+stem+cells+provides+neuroprotection+in+chronically+hypertensive+rat+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).</li>
<li>Arnhold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirally+transduced+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+pigment+epithelial+cells+and+induce+rescue+effects+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).</li>
<li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+delays+retinal+degeneration+in+the+RCS+rat+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration.</a> Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).</li>
<li>Xia, X., Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+a+high-content+screening+approach+to+stem+cell+research+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+histochemistry+%3A+official+publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 41-49 (2002).</li>
<li>Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+and+human+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).</li>
<li>Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+therapeutic+agents+and+potential+targeted+gene+delivery+vehicle+for+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).</li>
<li>Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+features+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Haematol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective features of mesenchymal stem cells.</a> Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).</li>
<li>Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mesenchymal+stromal+cells+in+spinal+cord+injury%2C+regenerative+medicine+and+possible+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications.</a> Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).</li>
<li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+lentivirus-mediated+TH+and+GDNF+genetic+engineering+mesenchymal+stem+cells+on+Parkinson%27s+disease+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+sciences+%3A+official+journal+of+the+Italian+Neurological+Society+and+of+the+Italian+Society+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model.</a> Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).</li>
<li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+released+from+engineered+mesenchymal+stem+cells+attenuates+glutamate-+and+hydrogen+peroxide-mediated+death+of+staurosporine-differentiated+RGC-5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells.</a> Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).</li>
<li>Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+human+embryonic+stem+cell-derived+hN2+cells+using+automated+high-content+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis.</a> Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).</li>
</ol>

עמלות פרסום למאמר זה וידאו נתמכו על-ידי התקנים מולקולריים, LLC.

תאים בוגרים mesenchymal גזע (תאי גזע) הם סוג תא אטרקטיבי לפיתוח אסטרטגיה ניסיונית שילוב טיפול מסירה סלולארי וגן מבוסס. MSCs הוא multipotent, מסוגל להבדיל לתוך תאים של שושלת mesodermal, ולהציג גמישות רבה, הבחנה / transdifferentiating לשושלות עצביות וגליה עם האינדוקציה המתאימה פרדיגמות 17,18. יתר על כן, MSCs הושתל והוכח כיעיל במחקרים פרה-קליניים למספר ההפרעות, לרבות תנאים ניווניות 19. היעילות הטיפולית של MSCs ידוע בשל אנטי-השגשוג מועיל, פעילות אנטי-דלקתית ואנטי-האפופטוזיס 20. MSCs ידוע גם לייצר ולהפריש גורמי neurotrophic וצמיחה שונים, שסביר להניח תורמים לאיכויות neuroprotective הקשורים MSCs הנאיבי לאחר השתלה באתרים של פציעה או מחלה 21. Importantly, MSCs ניתן מהונדס גנטי לאספקה ​​רצופה של גורמי neurotrophic עבור יישומים מבוססי ריפוי גנטי סלולארי ומשולבים והיה בשימוש במספר המודלים של בעלי החיים של פציעה או מחלה ל11,19,22 CNS. בפיתוח אסטרטגיה המבוססת על טיפול תאי וגנטי בשילוב, חשובה שבריאותם של התאים מוערכת בזהירות, ובמיוחד בלפני השימוש הנרחב שלהם במבחנת יישומי vivo. כהוכחה של מושג, שחקרנו אוכלוסיות מרובות של קווים מהונדסים וMSC שליטה כדי ללמוד את ההשלכות של השינויים הגנטיים על בריאות תא וכושר באמצעות גישת הקרנת תוכן גבוהה (HCS). באופן כללי, HCS מתייחס להקרנת תפוקה גבוהה סלולרית מבוסס תמונה 14. גישה זו מאפשרת הקרנת הערכה כמותית של פנוטיפים סלולריים במספר הרמות של מרחבי (תא subcellular) ובזמן (אלפיות השניה לימים) מילolution פני תנאי ניסוי שונים. שימוש בגישה זו אנו ניגשים הבדלים אפשריים בהעדפת מצע על הפרמטרים הבאים: התפשטות תאים, ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מוות של תאים, ותנועתיות תא / הגירה. ניסויים תוכננו בפורמט צלחת תרבית תאי 96-היטב. בתוך צלחת אחת חקרנו באופן שגרתי הבדלים הקשורים למצע האפשר ביחס לכל אחד מפרמטרים לאוכלוסיות השונות של תאי MSC-transduced lentiviral והשוואת MSCs המהונדס עם המקורי MSCs, שאינו transduced. זה סיפק אמצעים כדי להשוות ישירות את התוצאות עבור תת-הסוגים השונים MSC עם סוללה של מבחני במבחנה כגון התפשטות תאים באמצעות immunolabeling Ki67, assay כדאיות תא חי / מת באמצעות מכתים יודיד propidium, והתנהגות תא על ידי ביצוע הדמיה דיגיטלית זמן לשגות . כשלוחה של HCS זה ניתן גם לבצע ELISAs על דגימות שנאספו מתקשורת מותנית w הבודדאמות כדי לקבוע כמותית הפרשה של גורמי neurotrophic. גם תקשורת אוויר מתת MSC שונה ניתן להשתמש במבחנת bioassays כדי לקבוע פעילות ביולוגית של גורמים מופרשים 11,23. גם זה סוג של פלטפורמת HCS עשוי לשמש למדידות במבחנה של תולדת neurite מתרבויות עצביות עיקריות ושורות תאי גזע עצביות 24. בסך הכל, התוצאות שלנו הראו כי תת-האוכלוסיות של תאי הגזע המהונדסים הגנטית המוצגות התנהגויות דומות בהשוואה לתאי הגזע מהונדס-אי. ההשפעה של מצעי תרבות מגוונים על צמיחת תאים ונדידת תאים לא הייתה שונה באופן דרמטי בין תת MSC, כמו גם מצעי תרבות. ככזה, מצעי המטריצה ​​תאיים נבדקו לא הופיעו לשחק תפקיד קריטי בויסות היבטים של התנהגות תא אלה לMSCs המהונדס השונים הללו. מחקר זה מדגים את השימוש במערכת HCS לניתוח בידולהיבטי t של התנהגות תא. עם זאת, אין זה נדיר להיתקל במגבלות הקשורות לניתוח תמונה. בהזדמנות, תוך ניתוח תמונות הקרינה, זה היה קצת קשה לקבוע את ערך הסף הנכון שמעליו immunolabeled או תאים מוכתמים יהיו נספר שכותרתו חיובית / מוכתם. לכן, כדי למזער את ההטיה סובייקטיבית, קביעת ערכי סף הייתה תלויה השוואה לבקרה (בקרה שלילית להדמית הקרינה בוצעו במקביל בכל העיבוד על ידי ההשמטה של ​​הנוגדנים הראשוניים או משניים). מגבלה נוספת הייתה נתקלה במהלך הניתוח של נדידת תאים באמצעות הדמיה דיגיטלית לשגות-זמן. בחלק מהמקרים, תוכנת ההדמיה לא הייתה מסוגלת להבדיל בין התנועה בראונית האקראית של תא מול תא למעשה הנודד רק במרחק קצר מאוד. מגבלות נוספות ניכרו במצבים שבם תוכנת הניתוח לא הייתה מסוגלת להבחין בנוכחות של multipתאי le הסמוך מאוד לאחד אחר. כדי להתגבר על בחירת תא מדריך להגבלה נדרשה זה במהלך הניתוח ולא ניתוח אוטומטי לחלוטין. צפיפות ציפוי תא יכולה גם לגרום לעיקום נתוני נדידת תאים בין האוכלוסיות של תאים המציגים העדפה גדולה יותר לגדול בגושים לעומת תאים שגדלים בבידוד זה מזה. הבדלים אלו סוגים בחלק סביר השתקפות של תא-מצע לעומת העדפות תאי תאים. שימוש במערכת HCS לרכוש תמונות ולבצע ניתוח נתונים מספקת אמצעי יעיל ומהיר על מנת להעריך פרמטרים תאים מרובים. בנוסף, קטעי וידאו דיגיטליים הזמן לשגות במשך 30 תנאים שונים (6 מצעים ו 5 תת MSC שונה) נרכשו באופן שיגרתי לתקופות הנעות בין שעות עד ימים (48 שעות) בעת השימוש בתא הסביבתי. נתונים אלה היו לאחר מכן שימשו לחישוב ולקבוע הבדלים בשיעורי נדידת תאים על פני שורות תאים שונות בECM שונהמולקולות. בדוח זה אנו מדגישים את היישום של פלטפורמת הקרנת תוכן גבוהה כדי להעריך את בריאות תא ותפקודו. סוג זה של ניתוח הוא שימושי לפיתוח אסטרטגיות הגיוניות לעיצוב תא-סוגים, כמו גם מצעי פולימר כדי להקל על צמיחת תאים ביימה והתחדשות עצבית. זהו צעד חיוני לקראת יישום של משלוח מבוסס תאי גזע של גורמים טיפוליים לפני נרחב במחקרים פרה-קליניים vivo באמצעות אסטרטגיות השתלת תאים.

נושא מרכזי ביישום טיפולים יעילים לטיפול בהפרעות במערכת עצבים הוא בפיתוח שיטות יעילות המונעות ניוון נוסף וגם להקל על התאוששות של תפקוד. אסטרטגיה חדשנית היא גנטי בתאי גזע מהנדס לשעבר vivo, לייצור של גורמי הגנה עצביים, לפני ההשתלה שלהם. זה שילוב של טיפול מבוסס תאים, בשילוב עם סוג של ריפוי גנטי, מספק שיטה רבת עוצמה לטיפול במחלה או מוות עצבי הנגרם על-פגיעה במערכת העצבים. גורמי neurotrophic חיוניים לצמיחה והישרדות של תאי עצב בפיתוח, כמו גם תחזוקה ופלסטיות של נוירונים בוגרים. מספר המחקרים הראו תפקידים משמעותיים של גורמי neurotrophic בקידום צמיחה והתמיינות ראשוניות של תאי עצב במערכת העצבים המרכזית והיקפית (CNS וPNS) והם יכולים גם לעורר התחדשות במבחנה ובמודלים nimal של פגיעה עצבית 1. גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF) בא לידי ביטוי ביותר במערכת העצבים המרכזית והיא ממלאת תפקידים חשובים בויסות התפתחות עצבית, פלסטיות הסינפטית ותיקון 2. תא גלייה גורם neurotrophic (GDNF) המופק מקו מקדם הישרדות של סוגים רבים של תאי עצב הכוללים דופאמין וmotorneurons 3. לפיכך, אסטרטגיה חשובה לתיקון עצבי היא לספק מקורות אקסוגניים של גורמי neurotrophic לאזורים הפגועים או חולים של מערכת העצבים. תאי עצם multipotent-נגזר מח גזע mesenchymal (MSCs) מחזיקים פוטנציאל גדול עבור משלוח של חלבונים תרופתיים לטיפול במערכת העצבים הפגועה או חולה. השתלה של תאי גזע משכה תשומת לב רבה במאמצים לפתח טיפולים מבוססי תאים תואמים מטופל כן יש להם מספר היתרונות כוללים, 1) קלות היחסית של בידוד ותחזוקה, 2) קיבולת multipotential, 3) חששות אתיים קטנים, 4) יכולת לשרוד ולהעביר לאחר השתלה ו -5) פוטנציאל להשתלה עצמית 4,5. תוצאות מבטיחות כבר דיווחו עם שימוש בתאי גזע נאיבי ומהונדסים גנטי במודלים של בעלי חיים למספר תנאים ניווניות שונים, כוללים פגיעה בחוט השדרה 6,7, שבץ 8,9, המיאלין חסר 10, וניוון רשתית 11-13. צימוד השתלת תאים עם משלוח של גורמי neurotrophic מתאי גזע מהונדסים גנטי הוא רומן ואסטרטגיה תיקון עצבי חשובה. צעד חיוני בפיתוח מערכות אספקת גורם טיפולי המבוסס על תאים הוא לקבוע את הבריאות הנורמלית של התאים המהונדסים. ככזה, המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה להעריך פרמטרים צמיחה כלליים של תאי גזע בוגרים מהונדסים גנטי. גישה חשובה להעריך במהירות פרמטרים תאים מרובים היא להעסיק screenin גבוה דרך תמונה מבוססת סלולאריg (HTS), המכונה לעתים קרובות הקרנת תוכן גבוהה כמו נהלים (HCS) 14. טכנולוגיה זו מאפשרת רכישת תמונה אוטומטית וניתוח וגישה זו היא גם מתאימה במיוחד ליישומי מחקר בתאי גזע. בפרויקט זה פיתחנו פלטפורמה ליצירת פרופילים המאפשרת אפיון המהיר ואופטימיזציה של העדפות מצע תא ותפקודים תאיים בתאי גזע בוגרים מהונדסים גנטי המעסיקים מערכת HCS.

<table><tbody><tr><td>96 צלחות באר</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>96 צלחות באר שנבחרו לשימוש</td></tr><tr><td>באלבומין סרום בקר של ImageXpress (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ארנב נגד Ki67</td><td>Abcam (קיימברידג', מסצ'וסטס)</td><td>Ab16667</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>קולגן מסוג I</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)</td><td>C7661</td><td>קולגן מזנב</td></tr> <tr>עכברוש<td>DAPI</td><td>Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב Cy3</td><td>Jackson Immuno Res Lab (ווסט גרוב, פנסילבניה)&nbsp;</td><td>711-165-152</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>ECL (אנטקטין-קולגן-למינין)</td><td>Millipore/Chemicon (טמקולה, קליפורניה)</td><td>08-110</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>היקלון (לוגן, יוטה)</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Hyclone (לוגן, יוטה)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr>חנות כימיה<td>אתנול</td><td>(איימס, IA)</td><td>12003510</td><td>100%, 200 הוכחה</td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>פישר סיינטיפיק (המפטון, ניו המפשייר )</td><td>CB-40008</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific (המפטון, NH)</td><td>P285</td><td>עבור מאגר PO4</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher Scientific (המפטון, NH)</td><td>P288</td><td>עבור מאגר PO4</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco/Invitrogen (גרנד איילנד, ניו יורק)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>למינין (עכבר)</td><td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>MSCs של עכברי C57BL/6 בוגרים</td><td>Tulane Cent לטיפול גנטי (ניו אורלינס, לוס אנג'לס)</td><td></td><td>מבודד ממח עצם</td></tr><tr><td>MSCs מהונדסים גנטית (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/ GDNF)</td><td>תאים אלה התקבלו מהמחקר הקודם שלנו: Ye et. al. (בהכנה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל (NDS)</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&nbsp;</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>פישר סיינטיפיק (המפטון, ניו המפשייר )</td><td>O4042</td><td>4% PFA ב-0.1 מ' PO<תת>4 מאגר</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide (PI)</td><td>Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (סנט לואיס, מיזורי)</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין 0.05% (EDTA 1x)</td><td>Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen הבינוני של Iscove's Modified Dulbecco</td><td>(קרלסבד, קליפורניה)</td><td>12440&ndash; 046</td><td></td></tr><tr><td>היקלון FBS מוסמך היברידומה</td><td>(לוגן, יוטה)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>היקלון סרום סוסים</td><td>(לוגן, יוטה)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>מכשירים מיקרו</td><td>מולקולריים של ImageXpress (סאניווייל, קליפורניה)</td><td>ImageXpress מיקרו</td><td>מערכת סינון תוכן גבוה</td></tr><tr><td>MetaXpress 4.0</td><td>מכשירים מולקולריים (סאניווייל, קליפורניה)</td><td>MetaXpress 4.0</td><td>רכישת וניתוח תמונות תוכנה</td></tr></tbody></table>

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) שמקורם במח עצם הם משאב תאי רב עוצמה ושימשו במחקרים רבים כמועמדים פוטנציאליים לפיתוח אסטרטגיות לטיפול במגוון מחלות. מטרת מחקר זה הייתה לפתח ולאפיין MSCs ככלי רכב תאיים המהונדסים להעברת גורמים טיפוליים כחלק מאסטרטגיית הגנה עצבית להצלת מערכת העצבים הפגועה או החולה. במחקר זה השתמשנו ב-MSCs של עכברים שעברו שינוי גנטי באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים, שקידדו גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF) או גורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה (GDNF), יחד עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). 
לפני שממשיכים במחקרי השתלות in vivo, היה חשוב לאפיין את התאים המהונדסים כדי לקבוע אם השינוי הגנטי שינה היבטים של התנהגות תאים נורמלית. מצעי תרבית שונים נבדקו על יכולתם לתמוך בהידבקות תאים, שגשוג, הישרדות ונדידת תאים של ארבע תת-אוכלוסיות של MSCs מהונדסים. נערך סקר בעל תוכן גבוה (HCS) ובוצע ניתוח תמונה. 
המצעים שנבדקו כללו: פולי-L-ליזין, פיברונקטין, קולגן מסוג I, למינין, אנטקטין-קולגן IV-laminin (ECL). תיוג חיסוני Ki67 שימש לחקירת התפשטות תאים וצביעה של פרופידיום יודיד שימשה לחקירת כדאיות התאים. הדמיית זמן-lapse בוצעה באמצעות מערכת תא אור/סביבה משודרת במערכת סינון התוכן הגבוה.
התוצאות שלנו הראו כי תת-האוכלוסיות השונות של MSCs מהונדסים גנטית הראו התנהגויות דומות שהיו באופן כללי דומות לזו של MSCs המקוריים, הלא מהונדסים. ההשפעה של מצעי תרבית שונים על צמיחת התאים ונדידת התאים לא הייתה שונה באופן דרמטי בין הקבוצות שהשוו בין תת-הסוגים השונים של MSC, כמו גם מצעי תרבית. 
מחקר זה מספק אסטרטגיה ניסיונית לאפיון מהיר של תאי גזע מהונדסים והתנהגויותיהם לפני יישומם במחקרי השתלה ארוכי טווח in vivo להצלה ותיקון של מערכת העצבים.

פרמטרים צמיחת MSC נבדקו על ידי culturing האוכלוסיות השונות של תאי גזע על מצעים שונים. חמש האוכלוסיות שונות של תת MSC (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs, וBDNF / GDNF-GFP-MSCs) היו מצופות לתוך צלחות 96-היטב בתרבית רקמה טרום מצופה עם שונה מצעים כפי שמודגמים באיור 1. לאחר ארבעה ימים של culturing, הצלחות קבועות וimmunolabeled ו / או מוכתמים בחומרים הכימיים המתאימים ולאחר מכן נבחנו באמצעות מערכת HCS וניתוחים שנערכו עם רכישת התמונה ותוכנת ניתוח תכנית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> איור 1:. תבנית 96, גם צלחת לעיצוב ניסיוני 96-גם צלחות היו מצופים עם מצעים ובארות שונים היו זרע עם תאי גזע מהונדסים כפי שמוצגת בתבנית. כדוגמא, רק wells בBF שורות שימש בניסוי זה. שורות, G ו- H נותרו ריקים. קיצורים - MSCs: תאי גזע mesenchymal; GFP-MSCs: MSCs להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק; BDNF-GFP-MSCs: המוח נגזר MSCs גורם-להביע GFP neurotrophic; GDNF-GFP-MSCs; גליה תא הנגזר MSCs גורם-להביע GFP neurotrophic; BDNF / GDNF-GFP-MSCs; MSCs להביע GFP BDNF וGDNF-; ECL: Entactin-קולגן IV-Laminin). immunolabeling אנטי-Ki67, ואחריו counterstaining DAPI, שימש כדי להעריך אם מצעים השונים השפיעו על התפשטות של האוכלוסיות השונות של תאי גזע מהונדסים (איור 2 א). ביטוי של אנטיגן Ki67 מתרחש באופן מועדף בשלבים מאוחר 1 G, S, G 2 וM של מחזור התא, ולא זוהה בתאים בשלב המנוחה (G 0), ולכן הוא שימושי כסמן סלולארי להתפשטות 15 . 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) הוא נו נפוץcounterstain ברור וכרומוזום שפולט הקרינה כחולה על מחייב לAT אזורים של DNA 16. המספר הכולל של תאים בתחום יכול להיקבע על ידי ספירת מספר גרעיני DAPI מוכתם. כפי שמודגם באיור 2, אם כי לא היה שינוי באחוזים של MSCs מתרבים, כל מצעים בכל זאת נתמך התפשטות תאים רבה לכל אחד מתת MSC. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2: assay התפשטות תאי Ki67. () מוזגו, תמונה כפולה ניאון של immunolabeling Ki67 (אדום) וDAPI מכתים גרעיני (כחול). רבים מMSCs היו immunolabeled עם נוגדן Ki67 (אדום). בר סולם = 50 מיקרומטר. (ב) גרף בר הממחיש את אחוזי Ki67 immunolabeled תת MSC גדל על פוליסטירן (PS), poly-L- ליזין (PLL), פיברונקטין, קולגןהקלד אני, laminin, או IV-laminin entactin-קולגן מצעים (ECL) במשך 5 ימים במבחנה (DIV). N = ניסוי אחד. כל עמודה מייצגת ממוצעת של נתונים שנאספו מאתרים 8 צילמו מ2 בארות עבור כל תנאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יודיד צביעת Propidium (PI) שימשה כדי להעריך אם מצעים שונים השפיעו על הישרדות תא (איור 3). יודיד Propidium הוא counterstain גרעיני וכרומוזום אדום-ניאון נפוץ. יודיד Propidium הוא impermeant קרום ובדרך כלל מתאי קיימא, ובכך הוא שימושי כדי לזהות תאים מתים באוכלוסייה. חלקם של תאים מתים בתוך מצב נתון ניתן לקבוע בשילוב עם תווית גרעינית כללית כגון DAPI לזהות את כל התאים בתוך שדה. אחוז תאי PI-החיובי היה נמוך בכל מצעים שנבדקו (איור 3). כביקורת חיובית למגיב PI, כמה בארות המכילות MSCs הודגרו באתנול 70%, מצב המכונה להרוג רוב התאים, וכתוצאה מכך אחוז גבוה של תאים שכותרתו PI כפי שמודגם באיור 3 ו3C (אתנול טופל חיובי שליטה). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> איור 3: assay המוות של תאי יודיד Propidium. () מוזגו, תמונת ניאון כפולה ליודיד propidium (אדום) וDAPI צביעה (כחולה). למרות שהגרעינים של כל תאי קיימא הוכתמו DAPI (כחול), לא מכתים יודיד propidium התגלה בMSCs. (B) כמעט כל MSCs היו מוכתמים ביודיד propidium בעקבות חשיפה לאתנול 70%. ברים בקנה מידה A ו- B = 100 מיקרומטר. תת סוג MSC (C) גרף בר הממחיש את האחוזים של יודיד propidium (PI) מוכתםs גדל על פוליסטירן (PS), poly-L- ליזין (PLL), פיברונקטין, אני, laminin, או IV-laminin entactin-קולגן מצעי סוג קולגן (ECL) במשך 5 ימים במבחנה (DIV). אתנול בקרה: מצב זה שימש כביקורת חיובית עבור מגיב מכתים לצרכן. רוב התאים נתון לטיפול באתנול כתם PI הבא מתים ובכך מוכתם באופן חיובי למגיב לצרכן. N = ניסוי אחד. כל עמודה מייצגת ממוצעת של נתונים שנאספו מאתרים 8 צילמו מ2 בארות עבור כל תנאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כדי לחקור את ההשפעה האפשרית של מצעים שונים על התנהגותם של תאי גזע מהונדסים, נדידת תאים נותחה באמצעות מערכת מועברת האור / הסביבתית הקאמרית במערכת HCS מיקרוסקופיה ודיגיטלית זמן לשגות (ראה וידאו נוסף 1). מספר אתרים / גם הם צילמו זמן לשגותומשמש לחישוב שיעורי נדידת תאים לאוכלוסיות השונות של תאי גזע גדלו על מצעים השונים באמצעות רכישת תמונה וניתוח התוכנה. באופן כללי, כפי שמוצג באיור 4C, כל תת-הסוגים של תאי הגזע הראו שיעור ההגירה המהיר ביותר על פני השטח תאיים מצופה מטריצה ​​(פיברונקטין, קולגן, Laminin וECL) והאיטיים ביותר על משטחי קלקר מצופים שאינם. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> איור 4:. מעקב סלולארי וההגירה MSCs מעקב עם רכישת תמונה ותוכנת ניתוח. תמונות overlayed של משודרות תמונות אור וקרינה מ() תחילת הזמן לשגות הדמיה ו- (ב) בשעה 29 שעות מאוחר יותר בסוף פגישת ההדמיה הזמן לשגות (ראו וידאו נוסף 1). מסלולי נדידת תאים מסומנים על ידי li בצבע<html> נס. בר סולם:. 50 גרף מיקרומטר בר (C) הממחיש את שיעורי הגירה הממוצע (המבוטא מיקרומטר / hr) לתת MSC גדל על פוליסטירן (PS), poly-L- ליזין (PLL), פיברונקטין, קולגן סוג אני, laminin, מצעים או IV-laminin entactin-קולגן (ECL) עבור 2 ימים במבחנה (DIV). N = ניסוי אחד. כל עמודה מייצגת הממוצעת של לפחות 10 תאים צילמו מ2 בארות עבור כל תנאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יחדיו, תוצאות אלה מספקות ראיות ראשוניות לכך שאוכלוסיות של תאי גזע מהונדסים גנטי אלה להציג מאפייני צמיחה דומים. תוצאות אלה מספקות ראיות משכנעות לכך lentiviral בתיווך שינויים גנטיים של תאי הגזע אלה מושרה אין השפעות מזיקות לגילוי דרמטיות על הפרמטרים הצמיחה נחקרו תוך שימוש בפלטפורמת הקרנה זו. = &quot;Jove_content&quot;&gt; וידאו נוסף וידאו 1. זמן לשגות דיגיטלי של מעקב MSC באמצעות רכישת תמונה וניתוח התוכנה. נתיב הנדידה של לשני MSCs [מצויינים כמו 1 (קו ירוק מעקב) ו- 2 (קו הכחול מעקב)] מומחשים. וידאו שנתפס במשך תקופת 29 שעות. תמונות שנתפסו כל 5 דקות. תמונות הקרינה של MSCs להביע GFP שימשו לזמן לשגות הדמיה בהכנת הווידאו. בר כיול = 50 מיקרומטר. סוג זה של ניתוח הוא שימושי חוקר התנהגויות תא, כולל נדידת תאים וחלוקת תא.

מחקר זה מתאר פלטפורמה ניסיונית לאפיון מהיר של תאי גזע מהונדסים והתנהגויותיהם לפני יישומם במחקרי השתלה ארוכי טווח in vivo להצלה ותיקון של מערכת העצבים.

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין במהירות תאי גזע מהונדסים גנטית באמצעות מערכת סינון בעלת תכולה גבוהה או מערכת HCS. זה מושג תחילה על ידי תכנון והכנת ניסויים לצלחת של 96 בארות, ולאחר מכן ציפוי האוכלוסיות השונות של תאי גזע מהונדסים. לאחר מכן, מערכת הסינון בעלת התוכן הגבוה מוכנה להדמיית תאים חיים ולאחר מכן מופעלת הדמיית זמן-lapse לפרק הזמן הרצוי.לאחר מכן, לאחר השלמת הדמיית הזמן-lapse, לוחית התרבית מוכנה להליכי צביעת תאים כגון פרופידיום יודיד, צביעה למוות תאי או תיוג חיסוני KI 67 כדי לאפיין את התפשטות התאים. לבסוף, לוחית 96 הבארות נטענת מחדש למערכת סינון התוכן הגבוה להדמיה פלואורסצנטית ורכישת תמונה. בסופו של דבר, תוכנת ניתוח התמונה משמשת לביצוע ניתוח נתונים לקביעת פרמטרים שונים של צמיחת תאים.מתודולוגיה זו יכולה לסייע בטיפול בסוגיות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי גזע, כגון זיהוי ואפיון של גורמים המעוררים התמיינות של תאי גזע. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אסטרטגיות טיפוליות מבוססות תאים בגלל החשיבות של אפיון סוגי התאים לפני השימוש בהם in vivo. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התנהגויות תאים וניתן ליישם אותה כמעט על כל סוג תא אחר שגדל היטב בתרבית.בנוסף, ניתן להשתמש בגישות אלו על אורגניזמים שלמים כגון זחל דג הזברה. כדי להתחיל, צור מפה כפי שמוצג כאן של לוח 96 הבארות המתאר את המצעים וסוגי התאים השונים שיש לבחון מתחת למכסה המנוע הסטרילי. הכן תחנת עבודה עם מצעים שונים וצלחת 96 בארות.הוסף 100 מיקרוליטר תמיסת מצע לכל אחד, היטב על פי המפה. לאחר מכן השתמש ברצועת פרפיל כדי לאטום את המכסה ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה לאחר בידוד תאי גזע מזנכימליים של עכבר והדבקתם בווקטורים לנטי-ויראליים על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את תמיסות המצע מצלחת 96 הבארות והשתמש בכ-200 מיקרוליטר PBS סטרילי כדי לשטוף את הבארות פעמיים. לאחר הסרת השטיפה הסופית ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים ואיזון הצלחת בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.בינתיים, בתנאים סטריליים, קצרו את ה-MSCs על ידי איסוף מצע הגידול, המכונה כיום המדיום המותנה מהבקבוק לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסף שמונה מיליליטר PBS סטרילי לבקבוק וסובב בעדינות לפני שאיבת המאגר כדי לנתק את התאים מהבקבוק, הוסף מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין ו-0.01% תמיסת EDTA. כאשר התאים מתנתקים, הוסף שמונה מיליליטר של המדיום המותנה לפני איסוף תרחיף התאים וציפוי מחדש של התאים בכ-300 תאים לבאר.על פי פרוטוקול הטקסט, דגרו את הצלחת למשך שעתיים כדי לאפשר ל-MSCs להיצמד למצע בזמן שהתאים דגורים. הפעל את מערכת ה-HCS והמתן שעתיים עד שהיא תתאזן. הגדר את הבקר הסביבתי ל-37 מעלות צלזיוס והפעל בזהירות את בלון הגז המעורב המכיל 5% פחמן דו חמצני באוויר למערכת HCS, תא סביבתי המספק מקור אוויר קבוע.לאחר מכן, לאחר תקופת הדגירה של שעתיים, הסר את צלחת 96 הבאר מהחממה והנח אותה ישירות לתא הסביבתי של מערכת HCS. לאחר שאפשרת לצלחת להתייצב למשך 30 דקות, הפעל את התוכנה כדי להגדיר את הגדרות הצלחת. לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפוקוס אוטומטי בלייזר כדי להתמקד בתחתית הבאר ולצלם תמונות בדיקה ממספר אתרים ובארות מרובות כדי למצוא מישור מוקד אופטימלי.לאחר קביעת המיקוד, התחל לצלם תמונות כל חמש דקות למשך 48 שעות עבור כל 60 הבארות. בסיום הניסוי, הסר את צלחת 96 הבאר ממערכת HCS בתנאים סטריליים, אסוף דגימות מדיום מותנות מכל באר והעביר אותן לצלחת 96 באר טרייה. דגימות אלו יכולות לשמש מאוחר יותר עבור ELIZA לביצוע בדיקת התפשטות תאים KI 67.השתמש במאגר פוספט מולרי 0.1 כדי לשטוף את תרביות התאים למשך דקה אחת. לאחר חזרה על הכביסה, השתמש ב-4%para formaldehyde או PFA בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לתקן את התרביות לאחר הקיבוע. הסר את ה-PFA והשתמש ב-PBS כדי לשטוף את הבארות שלוש פעמים במשך שבע דקות כל אחת.לאחר חסימת התאים על פי פרוטוקול הטקסט, יש למרוח 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית על כל אחד מהם. מכסים היטב את הצלחת ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים במשך שבע דקות.עבור כל שטיפה, יש למרוח נוגדן משני. מניחים את התאים בחושך ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות לאחר שלוש כביסות נוספות. מכסים את הצלחת ושומרים אותה בארבע מעלות צלזיוס עד להדמיה.כדי לבצע הדמיה אוטומטית, טען את הצלחת עם התווית החיסונית למערכת HCS ואפשר לצלחת להתייצב למשך 20 דקות. פתח את תוכנת רכישת וניתוח התמונות של מערכת HCS. בחר את הגדרות הרכישה עבור המטרה פי 10 באמצעות כיפוף מצלמה באחד והגדרת רווח של שתיים.השתמש בפונקציית החשיפה האוטומטית כדי למצוא את מישור Z שבו שוכנים התאים ולחשב את ההיסט עבור כל אורך גל מעניין עבור הניתוח המודגם כאן. צלם תמונות עבור DAP, EGFP ו-S3. בחר את רמת העוצמה המקסימלית שבה בארות הבקרה השליליות אינן מראות אות לרכישת תמונה. השתמש באותן הגדרות סף עבור בארות חיוביות.לבסוף, צלם תמונות ושמור אותן במסד נתונים לפני ביצוע ניתוח תמונה. על פי פרוטוקול הטקסט, כפי שמוצג כאן, חמש אוכלוסיות שונות של תת-סוגים של MSC צופו ל-96 לוחות תרבית רקמות באר מקודדים מראש עם מצעים שונים באיור זה, אנטי KI 67, המזהה תאים מתרבים, ו-DAPI שימש כדי להעריך אם המצעים השונים השפיעו על התפשטות האוכלוסיות השונות של MSCs מהונדסים כפי שמוצג כאן, למרות שהייתה שונות באחוזי ה-MSCs המתרבים, כל הסובסטרטים תמכו בהתפשטות תאים ניכרת עבור כל תת-סוג MSC. תרשים זה מראה כי אחוז התאים עם צביעת פרופידיום יודיד או PI, המזהה תאים מתים באוכלוסייה נמוך בכל הסובסטרטים שנבדקו תאים שטופלו באתנול 70%, שהורג את רוב התאים, הראו שיעור גבוה של תיוג PI ומשמש כבקרה חיובית לחקירת התנהגות MSCs על מצעים שונים.נדידת תאים על פני תקופה של 29 שעות נותחה באמצעות מיקרוסקופיה דיגיטלית של זמן-lapse. נתיב הנדידה עבור תא אחד ותא שני מסומנים על ידי הקו הירוק והכחול בהתאמה. כפי שמוצג כאן, כל תת-הסוגים של MSCs הראו את קצב הנדידה המהיר ביותר על המטריצה החוץ-תאית, משטחים מצופים, והאיטי ביותר על משטחי פוליסטירן לא מצופים.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתכנן ולעצב בקפידה את הניסוי לפורמט צלחת מרובת בארות, כגון צלחת 96 בארות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו Eliza S על גבי מדיה מותנית על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לייצור והפרשת גורמים טיפוליים על ידי תאי הגזע המהונדסים לאחר פיתוחו. הליכי סינון בעלי תוכן גבוה סללו את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה של תאי הגזע וגילוי תרופות לחקור מערכות ביולוגיות מורכבות בתפוקה גבוהה.

high-throughput-characterization-adult-stem-cells-engineered-for

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

מקור: Sharma, A. D., et.al. אפיון תפוקה גבוהה של תאי גזע בוגרים שהונדסו להעברת גורמים טיפוליים לאסטרטגיות נוירו-פרוטקטיביות. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את תהליך האפיון של תאי גזע מזנכימליים טרנסגניים שהונדסו לבטא גורמים נוירוטרופיים טיפוליים. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בתיקון, חדירה וצביעה של התאים בנוגדנים ראשוניים ומשניים המכוונים לסמן התפשטות תאים, ולאחר מכן ניתוח באמצעות מערכת סינון בעלת תוכן גבוה כדי ללכוד אותות פלואורסצנטיים בגרעינים. ביטוי מוגבר של סמני התפשטות מאשר את התאמתם של...

אפיון תאי גזע מזנכימליים מהונדסים גנטית ליישומים נוירותרפיים

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

כאן אנו מציגים את שיטת מודל אנושי במבחנה של פציעה מתיחה בתבנית 96-ובכן בציר הרלוונטי לפגיעה טראומה. זה כולל שיטות בדיית לוחות מתיחה, לכימות את העלבון מכני culturing, ופצעו תאים, הדמיה, ניתוח תוכן גבוהה לכמת פגיעה.

שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

אנו מציגים שיטה ללא הנדסה גנטית (ללא GM) כדי להשיג תאים עם פנוטיפ עצבי מתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש. הפעלה של מסלול איתות המקושר לחלבון חדשני הקשור ל- GPI אנושי חושפת שיטה יעילה ללא GM להשגת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

דור ללא GM של תאים עצביים שמקורם בדם

אנו מתארים את הייצור של תרבויות מעורבות של אסטרוציטים ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים הנגזרים מתאי גזע עצביים עובריים או בוגרים המתבדלים לאוליגודנדרוציטים בוגרים, ומודלים במבחנה של גירויים מזיקים. הצימוד עם טכניקת סינון תוכן גבוהה מבוססת תא בונה מערכת סינון סמים אמינה וחזקה.

בידול וניתוח התבגרות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים שמקורם בתאי גזע עצביים

אנו מתארים פרוטוקול לתכנת מחדש פיברובלסטים אנושיים שמקורם בעור לתאי אב עצביים המושרים (iNPCs), ואת הבידול הבא שלהם לאסטרוציטים המושרים (iAs). שיטה זו מובילה לייצור מהיר וניתן לשחזור של iNPCs ו- iAs בכמויות גדולות.

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדסת תאי גזע שתוכנתו מחדש כימית כדי להשיג אפנון עצבי מדויק על ידי התמיינות תאים אלה לתאים קודמים דופמינרגיים, השתלתם במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון, והערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כדי לאשר את האינטגרציה המוצלחת והיעילות התפקודית של התאים המושתלים.

ויסות כימוגנטי בתאי קודמן שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מחדש בטיפול במחלות נוירודגנרטיביות

חקור אפיון תאי גזע מהונדסים באמצעות מערכת סקרינינג High Content Screening לצילום תאים חיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח התנהגות תאית ושיעורי התמיינות לפני שימוש in vivo בחולדות.

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

גלה סרטונים נוספים