תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין במהירות תאי גזע מהונדסים גנטית באמצעות מערכת סינון בעלת תכולה גבוהה או מערכת HCS. זה מושג תחילה על ידי תכנון והכנת ניסויים לצלחת של 96 בארות, ולאחר מכן ציפוי האוכלוסיות השונות של תאי גזע מהונדסים. לאחר מכן, מערכת הסינון בעלת התוכן הגבוה מוכנה להדמיית תאים חיים ולאחר מכן מופעלת הדמיית זמן-lapse לפרק הזמן הרצוי.

לאחר מכן, לאחר השלמת הדמיית הזמן-lapse, לוחית התרבית מוכנה להליכי צביעת תאים כגון פרופידיום יודיד, צביעה למוות תאי או תיוג חיסוני KI 67 כדי לאפיין את התפשטות התאים. לבסוף, לוחית 96 הבארות נטענת מחדש למערכת סינון התוכן הגבוה להדמיה פלואורסצנטית ורכישת תמונה. בסופו של דבר, תוכנת ניתוח התמונה משמשת לביצוע ניתוח נתונים לקביעת פרמטרים שונים של צמיחת תאים.

מתודולוגיה זו יכולה לסייע בטיפול בסוגיות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי גזע, כגון זיהוי ואפיון של גורמים המעוררים התמיינות של תאי גזע. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אסטרטגיות טיפוליות מבוססות תאים בגלל החשיבות של אפיון סוגי התאים לפני השימוש בהם in vivo. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התנהגויות תאים וניתן ליישם אותה כמעט על כל סוג תא אחר שגדל היטב בתרבית.

בנוסף, ניתן להשתמש בגישות אלו על אורגניזמים שלמים כגון זחל דג הזברה. כדי להתחיל, צור מפה כפי שמוצג כאן של לוח 96 הבארות המתאר את המצעים וסוגי התאים השונים שיש לבחון מתחת למכסה המנוע הסטרילי. הכן תחנת עבודה עם מצעים שונים וצלחת 96 בארות.

הוסף 100 מיקרוליטר תמיסת מצע לכל אחד, היטב על פי המפה. לאחר מכן השתמש ברצועת פרפיל כדי לאטום את המכסה ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה לאחר בידוד תאי גזע מזנכימליים של עכבר והדבקתם בווקטורים לנטי-ויראליים על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את תמיסות המצע מצלחת 96 הבארות והשתמש בכ-200 מיקרוליטר PBS סטרילי כדי לשטוף את הבארות פעמיים. לאחר הסרת השטיפה הסופית ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים ואיזון הצלחת בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

בינתיים, בתנאים סטריליים, קצרו את ה-MSCs על ידי איסוף מצע הגידול, המכונה כיום המדיום המותנה מהבקבוק לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסף שמונה מיליליטר PBS סטרילי לבקבוק וסובב בעדינות לפני שאיבת המאגר כדי לנתק את התאים מהבקבוק, הוסף מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין ו-0.01% תמיסת EDTA. כאשר התאים מתנתקים, הוסף שמונה מיליליטר של המדיום המותנה לפני איסוף תרחיף התאים וציפוי מחדש של התאים בכ-300 תאים לבאר.

על פי פרוטוקול הטקסט, דגרו את הצלחת למשך שעתיים כדי לאפשר ל-MSCs להיצמד למצע בזמן שהתאים דגורים. הפעל את מערכת ה-HCS והמתן שעתיים עד שהיא תתאזן. הגדר את הבקר הסביבתי ל-37 מעלות צלזיוס והפעל בזהירות את בלון הגז המעורב המכיל 5% פחמן דו חמצני באוויר למערכת HCS, תא סביבתי המספק מקור אוויר קבוע.

לאחר מכן, לאחר תקופת הדגירה של שעתיים, הסר את צלחת 96 הבאר מהחממה והנח אותה ישירות לתא הסביבתי של מערכת HCS. לאחר שאפשרת לצלחת להתייצב למשך 30 דקות, הפעל את התוכנה כדי להגדיר את הגדרות הצלחת. לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפוקוס אוטומטי בלייזר כדי להתמקד בתחתית הבאר ולצלם תמונות בדיקה ממספר אתרים ובארות מרובות כדי למצוא מישור מוקד אופטימלי.

לאחר קביעת המיקוד, התחל לצלם תמונות כל חמש דקות למשך 48 שעות עבור כל 60 הבארות. בסיום הניסוי, הסר את צלחת 96 הבאר ממערכת HCS בתנאים סטריליים, אסוף דגימות מדיום מותנות מכל באר והעביר אותן לצלחת 96 באר טרייה. דגימות אלו יכולות לשמש מאוחר יותר עבור ELIZA לביצוע בדיקת התפשטות תאים KI 67.

השתמש במאגר פוספט מולרי 0.1 כדי לשטוף את תרביות התאים למשך דקה אחת. לאחר חזרה על הכביסה, השתמש ב-4%para formaldehyde או PFA בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לתקן את התרביות לאחר הקיבוע. הסר את ה-PFA והשתמש ב-PBS כדי לשטוף את הבארות שלוש פעמים במשך שבע דקות כל אחת.

לאחר חסימת התאים על פי פרוטוקול הטקסט, יש למרוח 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית על כל אחד מהם. מכסים היטב את הצלחת ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים במשך שבע דקות.

עבור כל שטיפה, יש למרוח נוגדן משני. מניחים את התאים בחושך ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות לאחר שלוש כביסות נוספות. מכסים את הצלחת ושומרים אותה בארבע מעלות צלזיוס עד להדמיה.

כדי לבצע הדמיה אוטומטית, טען את הצלחת עם התווית החיסונית למערכת HCS ואפשר לצלחת להתייצב למשך 20 דקות. פתח את תוכנת רכישת וניתוח התמונות של מערכת HCS. בחר את הגדרות הרכישה עבור המטרה פי 10 באמצעות כיפוף מצלמה באחד והגדרת רווח של שתיים.

השתמש בפונקציית החשיפה האוטומטית כדי למצוא את מישור Z שבו שוכנים התאים ולחשב את ההיסט עבור כל אורך גל מעניין עבור הניתוח המודגם כאן. צלם תמונות עבור DAP, EGFP ו-S3. בחר את רמת העוצמה המקסימלית שבה בארות הבקרה השליליות אינן מראות אות לרכישת תמונה. השתמש באותן הגדרות סף עבור בארות חיוביות.

לבסוף, צלם תמונות ושמור אותן במסד נתונים לפני ביצוע ניתוח תמונה. על פי פרוטוקול הטקסט, כפי שמוצג כאן, חמש אוכלוסיות שונות של תת-סוגים של MSC צופו ל-96 לוחות תרבית רקמות באר מקודדים מראש עם מצעים שונים באיור זה, אנטי KI 67, המזהה תאים מתרבים, ו-DAPI שימש כדי להעריך אם המצעים השונים השפיעו על התפשטות האוכלוסיות השונות של MSCs מהונדסים כפי שמוצג כאן, למרות שהייתה שונות באחוזי ה-MSCs המתרבים, כל הסובסטרטים תמכו בהתפשטות תאים ניכרת עבור כל תת-סוג MSC. תרשים זה מראה כי אחוז התאים עם צביעת פרופידיום יודיד או PI, המזהה תאים מתים באוכלוסייה נמוך בכל הסובסטרטים שנבדקו תאים שטופלו באתנול 70%, שהורג את רוב התאים, הראו שיעור גבוה של תיוג PI ומשמש כבקרה חיובית לחקירת התנהגות MSCs על מצעים שונים.

נדידת תאים על פני תקופה של 29 שעות נותחה באמצעות מיקרוסקופיה דיגיטלית של זמן-lapse. נתיב הנדידה עבור תא אחד ותא שני מסומנים על ידי הקו הירוק והכחול בהתאמה. כפי שמוצג כאן, כל תת-הסוגים של MSCs הראו את קצב הנדידה המהיר ביותר על המטריצה החוץ-תאית, משטחים מצופים, והאיטי ביותר על משטחי פוליסטירן לא מצופים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתכנן ולעצב בקפידה את הניסוי לפורמט צלחת מרובת בארות, כגון צלחת 96 בארות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו Eliza S על גבי מדיה מותנית על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לייצור והפרשת גורמים טיפוליים על ידי תאי הגזע המהונדסים לאחר פיתוחו. הליכי סינון בעלי תוכן גבוה סללו את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה של תאי הגזע וגילוי תרופות לחקור מערכות ביולוגיות מורכבות בתפוקה גבוהה.