Name: דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למד לבודד ולשכפל תאי T ספציפיים לאלואנטיגן מדם היקפי באמצעות מיון ציטומטרי זרימה וגירוי נוגדנים. שיטה זו מאפשרת חקר תגובות חיסון ספציפיות ויישומים בטרנספלנטציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר רוצה להודות למתקן הליבה של ה-NIH Tetramer על ייצור הטטרמר. המחבר רוצה גם להודות ל-E.D. O'CONNOR ו-K.E. Marquez במעבדה לזרימה ציטומטרית של מתקן ליבת תאי גזע עובריים אנושיים ב-UCSD על הסיוע במיון תאים. עבודה זו מומנה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות K08AI085039 (GPM).

הערה: פרוטוקול זה דורש שימוש בדגימות דם היקפיים ממתנדבים אנושיים. כל המחקר עם בני אדם צריך להיבדק ואושר על ידי דירקטוריון סקירה מוסדית אדם מחקרים כדי להבטיח עמידה בהצהרת הלסינקי (2013) וביטוח בריאות טלטלות הדין והחשבון Act משנת 1996. 1. בידוד של תאי T מדם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל, לחמם את מדיום שיפוע הצפיפות לטמפרטורת חדר. Aliquot 4 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטי 2-4 15 מיליליטר סטרילי (צינור 1 ישמש לכל 10 מיליליטר נפח כולל של דם מדולל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 10-20 מיליליטר של דם בתרסיס הפרין 1-2 נתרן מצופה (ירוקה עליונה) צינורות איסוף דם ורידים. לאסוף דגימות אנושיות תחת הפיקוח של אנשים מאומנים ובהתאם למועצה לביקורת מוסדית פרוטוקול שאושר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את החלק החיצוני של הצינורות עם 70% אתנול. מוציא בזהירות את החלק העליון של fiמלא צינורות איסוף ולמזוג את הדם לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) על צינור אחד איסוף דם. לאסוף את PBS, להוסיף לכל הדם יצק, ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl קוקטייל / 2 מיליליטר העשרת תא T האנושי נפח כולל. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, שכבה של עד 10 מיליליטר של 1: הדם המדולל 1 בעדינות על גבי מדיום שיפוע צפיפות. להיות זהיר כדי לא לשבש את פני השטח של מדיום שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם צנטריפוגה שכבתי ובינוני שיפוע צפיפות של 1,200 XG במשך 20 דקות ב -20 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות בצנטריפוגה, נזהר שלא לשבש את הממשק בין מדיום שיפוע צפיפות והשכבה של לויקוציטים בממשק שבין מדיום שיפוע צפיפות והפלזמה בדילול מלא. בעזרת פיפטה 5 מיליליטר, לאסוף בזהירות את השכבה לויקוציטים ולהעביר לאמבטית סטרילי חדשה 50 מיליליטר חרוטידואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף PBS להביא את הנפח של PBL נאסף 50 מ&quot;ל ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend pelleted תאים בזרימת סטרילי 10 מיליליטר cytometry מיון חיץ (PBS-מסונן סטרילי המכיל 1% BSA). לדוגמא 10 μl של השעיה תא, לדלל 01:10 (להוסיף 90 μl) trypan כחול לספור תאים באמצעות hemocytometer (תשואה צפויה 1 - 4 x 10 6 תאים / צינור של דם מלא). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר aliquot 1 מיליליטר, להעביר עד 5 צינור מיליליטר, ולשמור על קרח לניתוח של תאי T לא מסומנים על ידי tetramer. שמור השעיה תא על קרח. </li></ol></li></ol> 2. העשרה מגנטית של תאי T Alloantigen הספציפיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל tetramer pMHC alloantigen עד 1: 100 במאגר מסוג סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה תא צנטריפוגה (9 מיליליטר מצעד 1.11) ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של דילול alloantigen tetramer pMHC לpelletedתאים (עד 10 7 תאים). מערבבים על ידי pipetting העדין. מעביר צינור 5 מיליליטר סטרילי. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר סוג חיץ. צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים ב100 חיץ סוג μl. הוסף 10 μl קוקטייל יוטין בחירה ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl חלקיקים מגנטיים ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 מיליליטר סוג החיץ ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. הסר 100 aliquot μl, להעביר עד 5 צינור מיליליטר, ולשמור על קרח לניתוח של תאים טרום-העשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור 5 מיליליטר מכיל את ההשעיה התא במגנט הפרדת תאים. הכובע צריך להיות באופן רופף על גבי הצינור. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את הכובע מהצינור. מחזיק צינור ומגנט ביחד, למזוג את תוכן הצינור לתוך צינור 5 מיליליטר טרי. אין להקיש או ללחוץ את תוכן הצינור ללהסיר את הטיפות האחרונות של נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מהמגנט. הוסף 2 מיליליטר חיץ סוג קר ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. לדוגמא 10 μl של השעיה תא, לדלל 1: 2 (להוסיף עד 10 μl) trypan כחול לספור תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol> 3. הכנת תאי T לתא בודד מיון תא cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ סוג קר לכל הצינורות של תאים (tetramer ללא תווית, מועשר האו&quot;ם, ומועשר שכותרתו tetramer שכותרתו tetramer) כדי להביא את נפח 3 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות ב 4 o C וחיץ למזוג להתאושש תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי pelleted ב -25 חיץ סוג קר μl. הוסף 5 μl בלוק Fc אנושי. לדגור על קרח למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נוגדנים למיון cytometry הזרימה. מערבבים 15 חיץ μl סוג, 15 μl אנטי-CD5, 15 μl אנטי CD14, ו -15 μl אנטי-CD19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של תערובת נוגדנים על צינור אחד של תאים. לדגור על קרח למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של חיץ סוג קר על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות ב 4 o C וחיץ למזוג להתאושש תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בריכוז של x 1 -2 10 6 תאים / מיליליטר במאגר כזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של מדיום תרבות תא האנושי T Aliquot 100 μl (DMEM של Iscove בתוספת 2 מ&quot;מ Glutamax, 10 HEPES מ&quot;מ, 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 10% סרום AB אנושי חום מומת, ואדם 2.5 ng / ml רקומביננטי IL-2) היטב בכל צלחת תרבות 96 גם עגולה תא תחתון. שמור על קרח. </li></ol> 4. בידוד של תאי T שכותרתו tetramer ידי תא בודד cytometry זרימת מיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים cytometry זרימת הפרמטרים gating כדי לזהות תאי tetramer alloantigen-pMHC שכותרתו T (איור 2 א). השתמש בחלק tetramer מראש ההעשרה שכותרתו להקים gating אסטרטגיות לחסל כפילויות, שער על הלימפוציטים, להוציא CD19 להביע תאי B וCD14להביע מונוציטים, ולזהות תאי T על ידי ביטוי CD5. השתמש במדגם לא שכותרתו עם tetramer כקרינת מינוס שליטה מי שיקים את gating לזיהוי תאי T מחייב tetramer (עם 0% מCD5 + CD14 - CD19 - תאים מהמדגם לא מסומן על ידי tetramer צריכים ליפול בתוך השער הזה) . הערה: gating אסטרטגיות שאינן הולם מחמירים יגרום בידוד של תאים שאינם-T או תאי T שאינם אנטיגן ספציפי, ואילו אסטרטגיות gating מדי מגבילות תפחית את מספר תאי T המבודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת את הפרמטרים צלחת לסוג התא הבודד. כוון את סדרן למקום 1 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + תא בכל טוב. כוון את הצלחת להגדיר להכיל בקרה 1 שלילית גם (לא תאים ממוינים לתוך הבאר) ו -1 ביקורת חיובית גם (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer - תאים) בכל שורה (איור 2.ב </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזרימה הוקמה cytometry אסטרטגית gating והתקנת צלחת, בודד תאי T מחייב tetramer בודדים ישירות לתוך הצלחת 96-היטב באמצעות סדרן תא cytometric זרימה. </li></ol> 5. תרבות והרחבת שיבוטים תא T Alloantigen ספציפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת מיון תא, צלחת צנטריפוגות ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס צלחת מקום התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 גירוי מערבולת למשך 30 שניות כדי resuspend חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב נפח של חרוזים activator הנדרשים לגירוי של תאי T שנאספו (0.5 μl של microbeads activator / טוב). העבר את הנפח מחושב של חרוזים ממריץ לצינור 5 מיליליטר סטרילי. הוסף 1 מיליליטר בינוני אנושי תא T תרבות ומערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור עם תליוני microbead במגנט. הכובע צריך להיות באופן רופף על גבי הצינור. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינותהכובע מהצינור. מחזיק צינור ומגנט יחד, תוכן צינור למזוג לתוך צינור 5 מיליליטר טרי. אין להקיש או ללחוץ את תוכן הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מהמגנט. הוסף בינוני תרבית תאים אנושית T (100 בינוני μl / 0.5 μl של microbeads בתחילה הוסיף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot של השעיה חרוז activator 100 μl היטב בכל הצלחת 96-היטב. דגירה צלחת התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג תא צמיחה מדי יום על ידי בדיקה מיקרוסקופית. אשכולות קטנים של תאים מתרבים אפשר לראות במיקרוסקופ לאחר 5 - 7 ימים של התרבות (איור 3.A). הערה: ויזואליזציה של תרביות תאי T בשלב זה יכול להיות קשה, והעדרו של צבירי תאים נצפים בשלב זה לא יכול להיות אינדיקציה לחוסר בתא T גדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 14 ימים לאחר בידוד תא, תרבויות הזנה על ידי הסרת זהירות של תקשורת 100 μl הנחה של חלקו העליון של התרבות ולהחליף עם 100 μ; בינוני טרי l T האנושי תרבית תאים. המשך דוגרים צלחת התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג תא צמיחה מדי יום על ידי בדיקה והערכה של הצבע של מדיום התרבות מיקרוסקופית. צבירי תאים גדולים צריכים להיות גלויים מיקרוסקופי 2 - 3 ימים לאחר השינוי הבינוני. Macroscopically, כדורי תא צריכים להיות גלויים במהלך 14 הימים שלאחר השינוי הבינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 28 ימים שלאחר בידוד תא, לזהות שיבוטים גדלו בבדיקה מיקרוסקופית. העבר את 200 μl הנפח של תרבויות צלחת 96-היטב צמיחה חיובית לבארות בודדות של צלחת תרבית רקמת 48-היטב המכילה 200 מדיום תרבות תא μl אנושי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl מכיל 12.5 μl של microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 גירוי (שהוכן כמפורט בסעיפים 5.2-5.6). דגירה צלחת התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על צמיחת התרבות יומית על ידי לשעבר מיקרוסקופיamination והערכה של הצבע של מדיום התרבות. כאשר תרבית תאי T מגיעה&gt; 2x10 מיליליטר 6 / (בדרך כלל 3-5 ימים לאחר מחדש גירוי, יכול להיות מוערך על ידי ביום שהתקשורת מתחילה להפוך קש צהוב), תרבות העברה גם צלחת תרבות 24 גם רקמה ולהוסיף 500 מדיום סלולארי μl אנושי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב10-14 ימי מעקב מחדש גירוי, לאסוף 200 μl של תרבית תאי T להעריך alloantigen ספציפי על ידי cytometry זרימת ניתוח tetramer pMHC מחייב (באמצעות אסטרטגית התיוג וgating המתוארת בסעיפי 3 ו 4.1). </li></ol> 6. לטווח ארוך מחדש גירוי והתרבות של שיבוטים תא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא הרף מחדש לעורר ולהרחיב תרביות תאי T משובטים עם סגוליות הרצויות יכול להיות בכל 14 ימים. לאסוף תרביות תאי T לתוך צינור 5 מיליליטר סטרילי ביום 14 הבא גירוי microbead אנטי CD3 / CD28 האחרון. לשלב בארות מרובות של אותו שיבוט תאי T בצינור אחד, עד נפח של 2.5 מיליליטר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני להביא את הנפח הסופי של 2.5 מ&quot;ל ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור 5 מיליליטר מכיל תרבית תאי T לתוך מגנט הפרדת תא כדי להסיר microbeads הישן מהתרבות. הכובע צריך להיות באופן רופף על גבי הצינור. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את הכובע מהצינור. מחזיק צינור ומגנט ביחד, למזוג את ההשעיה התא לתוך צינור 5 מיליליטר טרי. אין להקיש או ללחוץ את תוכן הצינור כדי להסיר את הטיפות האחרונות של נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני להביא את הנפח הסופי 4 מיליליטר. לדוגמא 10 μl לספור תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר תאי T על ידי צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant למזוג. תאי Resuspend T ב 10 6 תאים / בינוני תרבית תאי T האנושי מיליליטר. העברת 1 מיליליטר aliquots היטב בכל צלחת תרבית רקמת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש לעורר תאי T על ידי הוספת 100 מדיה μl מכילה 12.5 μl של אנטי CD3 / גירויmicrobeads NTI-CD28 (כמפורט בסעיפים 5.2-5.6). לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב-6% CO 2 באינקובטור. </li></ol>

<ol><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).</li>
<li>Morris, G. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+TCR+balances+sensitivity+and+specificity+for+the+recognition+of+self+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens.</a> Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).</li>
<li>Arstilla, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+estimation+of+the+human+%CE%B1%CE%B2+T+cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity.</a> Science. 286 (5441), 958-961 (1999).</li>
<li>Robbins, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+T-cell+receptor+%CE%B2-chain+diversity+in+%CE%B1%CE%B2+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells.</a> Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Felix, N. J., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+T-cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of T-cell alloreactivity.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).</li>
<li>Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloreactivity+is+limited+by+the+endogenous+peptide+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).</li>
<li>Suri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+APCs%2C+the+autologous+peptides+selected+by+the+diabetogenic+I-Ag7+molecule+are+unique+and+determined+by+the+amino+acid+changes+in+the+P9+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket.</a> J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).</li>
<li>Yssl, H., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+maintenance+of+cloned+human+T+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and maintenance of cloned human T cell lines.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Moon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%2B+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).</li>
<li>Chicz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+promiscuity+among+naturally+processed+peptides+bound+to+HLA-DR+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles.</a> J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).</li>
<li>Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+to+rearrange+dual+TCRs+enhances+positive+selection%2C+leading+to+increased+allo-+and+autoreactive+T+cell+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires.</a> J. Immunol. In press, (2014).</li>
<li>Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+receptor+T+cells+mediate+pathologic+alloreactivity+in+patients+with+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease.</a> Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).</li>
<li>Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+functional+peptide+complexes+of+class+II+major+histocompatibility+complex+proteins+from+subunits+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פעילות תאי T היא תופעה שנחקרה זמן רב ורלוונטית מבחינה קלינית. התגובות החזקות של תאי T לגירוי אלוגני אפשרו ניתוחים נרחבים של תגובות תאי T אנושיים במבחנה באמצעות תגובות לימפוציטים מעורבות פשוטות יחסית של תאי T בדם היקפי כנגד תאים אלוגניים מושבתים. עם זאת, תגובות תאי T אלוראקטיביות ראשוניות אלה הן אוליגוקלונליות, המורכבות ממספר רב של תאי T בודדים המגיבים לאלואנטיגנים ספציפיים. גיוון זה בתגובת תאי T פוגע ביכולת לבחון את הביוכימיה של זיהוי ליגנד pMHC המניע תגובות תאי T אלוראקטיביות. הפתרון הסטנדרטי לאתגר זה היה ליצור...

לימפוציטים מסוג T הם רכיבים קריטיים של המערכת החיסונית אדפטיבית. תאי T אחראים ללא רק ישירות תיווך תגובות חיסוניים הגנתיות לפתוגנים באמצעות מגוון רחב של מנגנוני מפעיל, אלא גם באופן פעיל שמירה על סובלנות עצמית חיסונית ומכוון את התגובות של תאים אחרים במערכת החיסונית. פונקציות אלה מופנות דרך מספר האותות משולבים, כולל קולטן תא T קשירה (TCR), ציטוקינים וכמוקינים, ומטבוליטים 1. האותות הללו, TCR הוא בעלת חשיבות מיוחדת, כפי שהוא מספק את הספציפיות האופייניות שמגדירה את התפקיד של תאי T בחסינות אדפטיבית. TCR אינטראקציה עם אנטיגנים פפטיד ליניארי שהוצגו על ידי MHC (HLA ortholog אדם) מולקולות (מתחמי pMHC) באופן ספציפי ורגיש מאוד לתת את האותות שליזום פונקצית מפעיל של תאי T. הפרמטרים ביוכימיים של אינטראקציות TCR עם הליגנדים pMHC לספק לא רק את הספציפיות לTהפעלת תא, אלא גם יש לו השפעה איכותית על תפקוד תאי T שלאחר מכן 2. כך, תפקוד התא T לומד לעתים קרובות דורש שבוחן את התגובות של תאי T המשובט עם סגוליות אנטיגני מוגדרות. התא האנושי T התא, המכיל כ 10 12 תאי T αβ, מכיל 10 7 מוערך - 10 8 αβTCRs שונה 3-4. רפרטואר מגוון זה מספק הזדמנות להכרה במגוון הרחב של פפטידים מפתוגנים פוטנציאליים שיחייב תגובה של תאי T לחסינות. ההערכה היא כי התדירות של תאי T מגיבה לאנטיגן הזר נתון שהוצג על ידי עצמי MHC היא בסדר הגודל של 10 -4 - 10 -7 בהעדר תגובה חיסונית לפני אנטיגן כי 5. הרפרטואר של תאי T הנאיבי מעוצב על ידי בחירת הרתי כדי להבטיח את היכולת לזהות עצמי MHC הצגת אנטיגנים פפטיד ומגבלה להגיבivity נגד אנטיגנים עצמי פפטיד, למקסם את התועלת הפוטנציאלית לתיווכם חסינות 2. עם זאת, בניגוד לזו שנועד תגובתיות, תדירות גבוהה יחסית, 10 -3 - 10 -4, תאי T מאנשים מערכת חיסון נאיביים להגיב לגירוי עם תאים אלוגנאית, הכרת שתי מולקולות MHC הזרות, כמו גם פפטידים אנדוגני שהם מציגים 6. ההכרה של הליגנדים pMHC אלוגנאית דומה מבנית להכרה של אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי עצמי MHC; TCR עושה אינטראקציות ביוכימיים קריטיות עם שתי מולקולת MHC אלוגנאית, כמו גם את הפפטיד מוצג 7. הטבע חזק של התגובה של תאי T לתוצאות גירוי אלוגנאית מהמגוון של pMHC קומפלקסים קיימים על פני השטח של תאים אלוגנאית 8. הערכה היא כי כל MHC מציג כ 2 x 10 4 אנטיגנים פפטיד אנדוגני שונים 9. ב זהreadth של תגובה לגירוי אלוגנאית הוא היבט משמעותי של פתולוגיה הקלינית הרלוונטית, כגון דחיית שתל או שתל לעומת המחלה מארח (GVHD), כתוצאה מalloreactivity תא T. מחקר של תגובות תא אנושיות T alloreactive הסתמך באופן מסורתי על בחינת תגובות polyclonal של תאי T נאיביים בעקבות גירוי עם תאים אלוגנאית. גירוי חוזר ונשנה עם אותו קו התא אלוגנאית בשילוב עם הגבלת דילול מנתח הוא מסוגל לייצר תאי T משובטים עם הכרה מוגדרת של אלוגנאית HLA 10. עם זאת, גישה זו היא בעייתית לבחינת תגובות לליגנד pMHC אלוגנאית הבודד, כרפרטואר הרחב והמגוון של pMHC אנדוגני קומפלקסים נוכחי לאלוגנאית נתון HLA מגרה רפרטואר רחב של תאי T. גירוי האוכלוסייה בתפוצה רחבה וגישת דילול מגבילה ידרשו הקרנה של מספר הגדול של שיבוטים לבודד תאי T עם Reacti הרצויvity נגד יגנד pMHC יחיד. בנוסף, התדירות של תאי T מגיבים ליגנד pMHC אלוגנאית בודד היא נמוכה יחסית בקרב אוכלוסיות נאיביות תא T, המציגה מחסום לדור יעיל של שיבוטים תא T אנושיים מגיבים לאנטיגן נתון. זיהוי ובידוד של תאי T אנטיגן ספציפי מאוכלוסיות polyclonal שהופעלו על ידי הפיתוח של multimers pMHC fluorophore שכותרתו 11. גישה זו משתמשת אנטיגנים פפטיד ספציפיים נטענים לתוך מולקולות מסיסה רקומביננטי biotinylated MHC, שמסומנים על ידי ההיקשרות לfluorophore שכותרתו streptavidin. Multimerization של pMHC מגביר את הלהיטות, מפצה על זיקת מיסוד נמוך (מיקרומטר) של TCR להליגנדים pMHC מסיסים. ניתן לזהות תאים שכותרתו ומבודדים על ידי cytometry זרימה. עם זאת, גישה זו עדיין מוגבלת על ידי התדירות הנמוכה של תאי אנטיגן הספציפי T בין אוכלוסיות תאי T נאיביות, אשר בדרך כללסדרי הגודל פחות מהמגבלה של זיהוי וכימות מדויקים ברוב הזרימה cytometers. כדי לתת מענה למגבלה זו, שיטת תיוג pMHC tetramer והעשרת חרוז מגנטית שלאחר מכן לתאים שכותרתו tetramer פותחה 12. שיטה זו הוכיחה זיהוי אמין, ספירה, ובידוד של תאי T אנטיגן ספציפי בתדירות נמוכה. פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול יעיל לייצור השיבוטים תא T האנושיים שדווקא מגיבים לליגנד pMHC אלוגנאית הבודד. הפרוטוקול חל pMHC (HLA) תיוג והעשרת multimer לבידוד של תאי T האנושיים alloantigen הספציפי עם cytometry זרימת תא מיון ושיטה חזקה לתרבות במבחנה של תאי T אנושיים כדי לאפשר ייצור של שיבוטים תא T מהתאים ממוינים אחת ( סקירה באיור 1).

<table><tbody><tr><td>צינור איסוף דם ורידי נתרן הפרין 16 x 100 מ"מ</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS, 1x ללא Ca או Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין</td> <td>סרום בקרSigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Fluorophore-Label-pMHC tetramer</td><td>מתקן NIH Tetramer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Biotin Selection Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Selection magnet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Human Fc חסימת פתרון</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (שיבוט UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (שיבוט HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 FITC (שיבוט HIB19)</td><td>Biolegend</td><td>302205-DMEM</td><td></td></tr><tr><td>של Iscove, ללא b-ME או L-גלוטמין</td><td>קורנינג</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>ב-מרקפטואתנול&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate (50 מ"ג/מ"ל)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>סרום AB אנושי, תורם זכר</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr>מאגר <td></td><td></td><td></td><td>מיון תאי</td></tr><tr><td>מדיה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>1 ליטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 גרם</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 מ')</td> <td>2 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאי T אנושיים מדיום</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM של Iscove</td><td>351.6 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום AB אנושי מומת בחום</td><td>40 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 מ')</td><td>4 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלוטמקס (100x)</td><td>4 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ג'נטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)</td><td>0.4 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-מרקפטואתנול (14.3 מ')</td><td>1.4 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-2 אנושי רקומביננטי (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>1 מ"ל</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דור של תאי t האנושי alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

חקר הביולוגיה של לימפוציטים מסוג T אנושי כרוך לעתים קרובות בבחינת תגובות להפעלת ליגנדים. תאי T מזהים ומגיבים לאנטיגנים פפטידיים מעובדים המוצגים על ידי מולקולות MHC (HLA אורתולוגי אנושי) דרך קולטן תאי T (TCR) בצורה רגישה וספציפית ביותר. בעוד שתפקידם העיקרי של תאי T הוא לתווך תגובות חיסוניות מגנות לאנטיגנים זרים המוצגים על ידי MHC עצמי, תאי T מגיבים בעוצמה להבדלים אנטיגניים ברקמות אלוגניות. ניתן לתאר את תגובות תאי T לאלואנטיגנים כפעילות ישירה או עקיפה. בפעילות אלוראטיבית, תא ה-T מגיב באמצעות זיהוי ספציפי ביותר הן של הפפטיד המוצג והן של מולקולת ה-MHC. התגובה האוליגוקלונלית החזקה של תאי T לגירוי אלוגני משקפת את המספר הגדול של אלואנטיגנים בעלי פוטנציאל לגירוי הקיימים ברקמות אלוגניות. בעוד שרוחב התגובות של תאי T אלוראקטיביים הוא גורם חשוב בייזום ותיווך הפתולוגיה הקשורה לתגובות אלוראקטיביות רלוונטיות מבחינה ביולוגית כגון מחלת השתל נגד המארח ודחיית אלוגרפט, זה יכול למנוע ניתוח של תגובות תאי T לליגנדים אלוגניים. לשם כך, פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת תאי T אלוראקטיביים מלויקוציטים נאיביים של דם היקפי אנושי (PBL) המגיבים לאלואנטיגנים ידועים של פפטיד-MHC (pMHC). הפרוטוקול מיישם תיוג מולטימר pMHC, העשרת חרוזים מגנטיים וזרימה ציטומטרית על שיטות תרבית תא בודד במבחנה ליצירת שיבוטים של תאי T ספציפיים לאלואנטיגן. זה מאפשר מחקרים על הביוכימיה והתפקוד של תאי T המגיבים לגירוי אלוגני.

פרוטוקול זה מתאר את הדור של תרביות תאי T אנושיות משובט עם מוגדר alloantigen ספציפי באמצעות העשרה מגנטית חרוז וזרימת תא בודד cytometry מיון אסטרטגיה. איור 1 מספק קווי המתאר של התהליך. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> איור 1: סקירת פרוטוקול הפרוטוקול מתואר כאן מספק שיטה אמינה לייצור של שיבוטים של תאי ...

מאמר זה מתאר שיטה ליצירה והתפשטות של שיבוטי תאי T אנושיים המגיבים באופן ספציפי לאלואנטיגן מוגדר. ניתן להתאים פרוטוקול זה לשיבוט תאי T אנושיים ספציפיים למגוון ליגנדים של פפטיד-MHC.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות, לבודד ולשכפל תאי T אנושיים עם ספציפיות מוגדרת של אנטיגן אלו. זה מושג על ידי בידוד ראשון של לימפוציטים מסוג T מדם היקפי שלם על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. בשלב השני, תאי ה-T הספציפיים לאנטיגן אלו מסומנים בפפטיד מצומד פלואור ארבע, HLA, טטרמרים ומועשרים בהפרדה מגנטית.לאחר מכן, תאי ה-T המסומנים מבודדים על ידי מיון תאים ציטומטריים בזרימה של תא בודד. לבסוף, תרביות התאים הבודדים מגורים עם נוגדנים נגד CD 3 ואנטי CD 25. בסופו של דבר, ניתן להעריך את תגובתיות ה-allo של תאי ה-T הספציפיים לאנטיגן על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות אחרות כגון גירוי לימפוציטים בתפזורת ודילול מוגבל הוא שטכניקה זו מאפשרת יצירת שיבוטים של תאי T עם תגובתיות ספציפית לאנטיגנים מוגדרים היטב. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להתקשות בתרבות ובהרחבה של שיבוטי תאי T. זה דורש ניטור יומיומי קפדני של התרביות לפני תחילת ההליך.בחר ארבעה מיליליטר של שיפוע צפיפות טמפרטורת החדר לשניים עד ארבעה צינורות צנטריפוגה חרוטיים סטריליים של 15 מיליליטר משתמשים ב-70% אתנול כדי לנגב את החלק החיצוני של אחד עד שניים צינורות איסוף דם עליונים ירוקים מלאים המכילים דם ממתנדב בריא ואז להסיר בזהירות את החלק העליון, לשפוך את הדם לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר, ולאחר מכן כל צינור איסוף עם 10 מיליליטר PBS. אסוף את השטיפות עם הדם המלא המוזרם וערבב תמיסה בעדינות ואז דגר על התאים עם 25 מיקרוליטר קוקטייל העשרת תאי T אנושיים לכל נפח כולל של שני מיליליטר של הדם המדולל. לאחר 20 דקות, השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להניח בעדינות עד 10 מיליליטר מהדם על גבי מדיום שיפוע הצפיפות, תוך הקפדה לא לשבש את פני השיפוע.צנטריפוגה של התאים למשך 10 דקות ולאחר מכן השתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי להעביר בזהירות את שכבת הלויקוציטים מהממשק של שיפוע הצפיפות והפלזמה המדוללת לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. הביאו את נפח לימפוציטי הדם ההיקפי שנאספו עד 50 מיליליטר בעזרת PBS וערבבו בעדינות את תרחיף התאים. לאחר מכן ספור את התאים והסר מיניקוט של מיליליטר אחד לניתוח.לאחר מכן, לאחר סיבוב התאים, השעו את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר ציטומטריית זרימה וערבבו 50 מיקרוליטר של טטרמר פפטיד אנטיגן MHC מדולל לתוך תרחיף התא. העבירו את התאים לצינור סטרילי של חמישה מיליליטר, ולאחר 30 דקות, שטפו את התאים בשני מיליליטר של מעין חיץ מגן. השעו את החך במאגר של 100 מיקרוליטר מיון, ולאחר מכן דגרו את התאים ב-10 מיקרוליטר קוקטייל בחירת ביוטין למשך 15 דקות.לאחר מכן, דגרו את התאים בחמישה מיקרוליטרים של חלקיקים מגנטיים למשך 10 דקות, ולאחר מכן ערבבו בעדינות את תרחיף התא עם 2.5 מיליליטר של מאגר מיון. הסר כמות של 100 מיקרוליטר של ניתוח תאי העשרה מוקדמת ולאחר מכן הנח את הצינור לתוך מגנט הפרדת התאים. לאחר חמש דקות, החזיקו את הצינור והמגנט יחד ושפכו את התכולה לתוך שפופרת טרייה של חמישה מיליליטר.לאחר מכן הסר את הצינור מהמגנט ושטוף את התאים בשני מיליליטר של מאגר מיון, השהה מחדש את הגלולה במאגר מיון קר וחלק את התאים בשני מיליליטר של מאגר מיון קר לכל סוג דגימה. לאחר סיבוב הדגימות שוב, השעו מחדש את הכדורים ב-25 מיקרוליטר של מאגר קר ודגרו את התאים בחמישה מיקרוליטרים של בלוק FC אנושי על קרח למשך 20 דקות. לאחר מכן, דגרו את הצינורות עם 20 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המתאים.לאחר 20 דקות, שטפו את התאים בשני מיליליטר נוספים של מאגר קר והשעו את הכדורים ב-1 עד 2 מיליון תאים למיליליטר. במאגר נוסף, יש לשים 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי T אנושיים לכל באר של צלחת תרבית תאים תחתונה עגולה של 96 בארות ולאחסן את הצלחת על קרח עד להשלמת המיון. לאחר המיון, צנטריפוגה את הצלחת ולאחר מכן הנח את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 6% CO2.לאחר מכן, ערבבו את הנפח המתאים של חרוזי המפעיל על ידי מערבולת והעבירו את נפח החרוזים המתאים לצינור סטרילי של חמישה מיליליטר. לאחר שטיפת החרוזים על המגנט, יש לשפוך את תמיסת הכביסה ולהוסיף 100 מיקרוליטר של תרבית תאי T אנושיים, בינוני לכל 0.5 מיקרוליטר מיקרו-חרוזים לשפופרת. לאחר מכן יש להוציא 100 מיקרוליטר של תרחיף חרוז המפעיל לכל באר בצלחת 96 הבאר ולהחזיר את התאים לחממה.ניתן להבחין באשכולות קטנים של תאים מתרבים במיקרוסקופ לאחר חמישה עד שבעה ימים של תרבית, 14 יום לאחר בידוד התאים. החלף בזהירות 100 מיקרוליטר מדיה מהחלק העליון של התרביות ב-100 מיקרוליטר של תרבית תאי T אנושית טרייה. אשכולות תאים בינוניים גדולים צריכים להיות גלויים במיקרוסקופ יומיים-שלושה לאחר ההאכלה מבחינה מקרוסקופית כדורי תאים אמורים להיות גלויים במהלך 14 הימים שלאחר השינוי הבינוני.לאחר 28 ימים לאחר בידוד התאים, העבירו את כל נפח 200 המיקרוליטר של תרביות הגידול החיוביות לבארות בודדות של צלחת תרבית רקמה של 48 בארות המכילה 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי T אנושיים. לאחר מכן הוסיפו 12.5 מיקרוליטר של המיקרו-חרוזים הממריצים נגד CD 3, אנטי CD 28 ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי T אנושיים, והחזירו את הצלחת לאינקובטור שלושה עד חמישה ימים לאחר הרסטימולטור. המדיום אמור להתחיל להפוך לצהוב קש.בשלב זה, העבירו את התרביות לבארות בודדות של צלחת תרבית רקמה של 24 בארות והוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום תאי T אנושיים לכל תרבית. לבסוף, 10 עד 14 ימים לאחר הרסטימולציה, אספו 200 מיקרוליטר מכל תרבית תאי T כדי להעריך את ספציפיות האנטיגן שלהם על ידי ניתוח זרימה ציטומטרית של הפפטיד שלהם. קשירת טטרמר MHC: התשואה הצפויה של תאי T ספציפיים לאנטיגן אלו תהיה תלויה בתורם, באנטיגן האלו, בו נעשה שימוש ובתדירות המקבילה של תאי T תגובתיים בתורם.לדוגמה, לתורם בריא ממוצע יהיו 4,500,000 עד 10 מיליון לויקוציטים למיליליטר דם, כ-20% מהם הם לימפוציטים מסוג T. תרשימי נקודות אלה ממחישים את התוצאות של מדידת הקישור של תאי T מתורם HLAD 4 שלילי לאנטיגן אלו ספציפי. לדוגמה, בניסוי זה, שכיחות של אחד מכל 4,776 תאי T ספציפיים לאנטיגן אלו נספרו מתוך מספר התחלתי של 20 מיליון לויקוציטים מאוכלוסיית תאים התחלתית זו.88 תאי טמר בודדים המסומנים ב-T הצליחו להיות מבודדים ואז לאחר שני סבבים של גירוי ותרבית מיקרו-חרוזים, זוהו שתי תרביות חיוביות לגידול על ידי בדיקה מיקרוסקופית וספציפיות האנטיגן האלו-אנטיגן שלהן הוערכה על ידי בחינת הקישור שלהן ל-A 2 30 48 HLA DR. ארבעה טטרמרים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר תרביות התאים מדי יום כדי למנוע מוות תאים וצמיחת יתר של התרביות. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בשיבוטי תאי T כדי לענות על שאלות נוספות כגון בחינת הביוכימיה של זיהוי ליגנד אלוגני וכיצד זה מתורגם לתגובות חיסוניות יעילות.

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לגרום alloantigen ספציפי anergy בבני אדם בתאי הדם ההיקפיים mononuclear. הטכניקה ניתן ליישם קלינית כדי ליצור אי - alloreactive תאים התורם. עירוי של תאים אלה יכול לשפר את הכינון מחדש החיסון ולהפחית רעילות לאחר השתלה אלוגנאית גזע hematopoietic התא.

אינדוקציה של Anergy Alloantigen ספציפיים בתוך האדם תאים דם היקפיים mononuclear על ידי גירוי Alloantigen עם המצור Co-גירוי אותות

אנו מתארים שיטה להפקת תאים T זיכרון הרגולציה, ואת נאיבי מתורם דם אחת האדם. Tregs מקוטב ניתן להשוות ואז תת אחרים במגוון רחב של יישומים גנטיים פונקציונלי עם הומוגניות גנטית, כולל assay דיכוי מפורטים גם כאן.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

אנו מתארים assay אבחון יקר שעלולים לשמש כדי להחליט הנסיגה של דיכוי חיסוני לאחר השתלה ללא סיכון מוגבר לדחיית שתל. Assay משתמש בעקרונות של רגישות יתר מושהה סוג ומספק הערכה מדויקת של שתי התגובות רכובים על ידי מקבלי חיסון מפעיל ורגולציה הספציפיות תורמות.

Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

אנו מציגים כאן שיטה לפיתוח תאי T רגולטוריים ספציפיים לאנטיגן פונקציונלי (Ag) (Tregs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) לאימונותרפיה של דלקת מפרקים אוטואימונית במודל עכברי.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

מאמר זה מתאר שיטה למדידת alloreactivity באוכלוסייה מעורבת של תאי T באמצעות זרימת הדמית cytometry.

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום סובלנות ב השתלת ולאחר להעריך חוץ גופית בתוך ויוו הקיבולת המדכא של תאים נפרדים קבוצות משנה של המטופל, את מצב המערכת החיסונית של המטופל כלפי התורם או אנטיגנים אקסוגני.

במבחנה In Vivo למזהמים סביבתיים T, B והתאים מיאלואידית פעילות מדכא ומענים ההורמונאלית מן המקבלים

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת אנטיגן גידול פונקציונלי-ספציפי המושרה pluripotent תא גזע בודד באמצעות OP9/DLL1 מערכת התרבות המשותף.

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

אנו מתארים הליך להערכת היכולת של חומרים פרמקולוגיים לייצר תאים דנדריטיים טולרוגניים מתאים דנדריטיים נאיביים שמקורם במונוציטים במבחנה ולאמת את עוצמתם על ידי יצירת תאי T רגולטוריים אוטולוגיים.

שיטה פשוטה ויעילה לבדיקת חומרים אימונומודולטוריים ליצירת תאים דנדריטיים טולרוגניים ממונוציטים CD14+ אנושיים

למד לבודד ולשכפל תאי T ספציפיים לאלואנטיגן מדם היקפי באמצעות מיון ציטומטרי זרימה וגירוי נוגדנים. שיטה זו מאפשרת חקר תגובות חיסון ספציפיות ויישומים בטרנספלנטציה.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

גלה סרטונים נוספים