הערכה של מאפייני תא גזע בקרצינומה של תאי השחלות אדם באמצעות Multi ומבחני Spheres מבוסס תא בודדים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את תכונות תאי הגזע של תאי קרצינומה בשחלות אנושיות באמצעות מבחני כדורים מבוססי תאים מרובים ובודדים. זה מושג על ידי בחירה ראשונה של SOX שני מדווחים RFP lentivirus תאים שהועברו על ידי טיפול ב-Pur Mycin בשלב השני, התאים החיוביים ל-RFP ו-RFP שליליים מבודדים ומצופים על ידי עובדות כמושבות בודדות או מרובות תאים לכל באר. לאחר מכן, היווצרות הכדור הראשוני מנותחת במיקרוסקופ ולאחר מכן מפרקים את תרביות הכדור הראשוני ומצופים מחדש לניתוח היווצרות הכדור המשני.

בסופו של דבר, מבחני הכדור הללו משמשים לחישוב שיעור תאי הגזע המשוערים של סרטן השחלות המציגים יכולת יצירת כדור. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע הסרטניים, כגון מהן כמה אוכלוסיות פוטנציאליות של תאי גזע סרטניים ומה התדירות שהייתה בכל שקית הגידול. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי זיהוי תאי גזע של סרטן השחלות, היא עשויה להיות מיושמת גם לבידוד תאי גזע סרטניים מישויות גידול מוצקות אחרות כגון קרצינומה של השד.

24 שעות לאחר התמרת תאי קרצינומה של שחלות אנושיות עם חלקיקים לנטי-ויראליים, הסר את הסופרנטנט הנגיפי ושטוף את התאים בתרבית PBS. התאים במדיום מלא למשך 48 שעות. לאחר מכן החלף את המדיום והוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר פירו מיצין לאחר חמישה ימים.

טפל בתרביות עם מגן אחד בדילול של 1 עד 1000 למחרת. שטפו את התאים ב-PBS ולאחר מכן נתקו אותם עם 0.05% טריפסין EDTA. לאחר שלוש דקות, הפסק את התגובה עם מדיום מלא.

ספרו את התאים וצנטריפוגה אותם במשך חמש דקות בטמפרטורה של 300 פעמים G וטמפרטורת החדר. השעו מחדש את התאים בזהירות ב-0.5 עד מיליליטר אחד של PBS סטרילי ולאחר מכן סננו את תרחיף התאים שנוצר דרך מסנן של 40 מיקרומטר. התאם את התאים לחמש פעמים 10 לששת התאים לדילול מיליליטר, ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של כדורים בינוניים לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד של 96 בארות ליד לבדיקת כדור מבוססת תא בודד.

השתמש במצב תא בודד כדי למיין תא אחד לכל באר של הצלחת. לאחר מכן מדרגים את התאים באופן מיקרוסקופי כדי להעריך את יעילות הציפוי. דגרו את התאים בכדורים טריים, בינוניים ב-37 מעלות צלזיוס, ו-5% CO2 עם גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי יומי ותוסף גורם גדילה אפידרמיס.

לאחר שבוע, קבע את מספר כדורי הגידול המתעוררים על ידי מיקרוסקופ אור ואת נוכחות האות הפלואורסצנטי ממערכת המדווח המשולבת על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ספרו את הכדורים בקוטר העולה על 100 מיקרומטר ככדורים גדולים ואת הכדורים בקוטר של 50 עד 100 מיקרומטר ככדורים קטנים. הקפדה על ספירת כדורים אמיתיים ולא אשכולות תאים.

לאחר מכן חשב את שיעור הכדור היוצר תאים חיוביים RFP או RFP שליליים לפי הנוסחה למעבר. הכדורים מתחילים בהעברת התוכן של כל באר לצינורות מיקרו צנטריפוגה בודדים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן שטפו כל באר שלוש עד חמש פעמים עם PBS כדי להקפיד לאסוף את כל הכדורים ולסובב את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של פי 300 G וטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את החטף והחזיר את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין EDTA ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר רך למשך חמש דקות. אם לא נראים כדורים גדולים לאחר חמש דקות, יש לערבב בעדינות את תמיסת התא עם קצה פיפטה של 100 מיקרוליטר ולהוסיף 500 מיקרוליטר של מדיום שלם כדי לנטרל את הטריפסין. תאים מסתובבים, משעים את הכדורים בזהירות בכדורים בינוניים ומנקזים את תרחיף התאים שנוצר דרך מסנן של 40 מיקרומטר כפי שדורג זה עתה.

לבסוף, לציפוי מחדש סדרתי של התאים הבודדים, זרע תאים בודדים מכדור ראשוני אחד ב -100 מיקרוליטר של כדורים, בינוני לבאר בצלחת חדשה של 96 בארות חיבור נמוך במיוחד. לאחר מכן השתמש באותה נוסחה כמו עבור בדיקת הכדורים הראשוניים כדי להעריך את שיעור התאים היוצרים כדורים בכדורים המשניים. בדיקות בכדורים מבוססי תאים מרובי תאים מבחנים כמעט 40% מתאי קרצינומה בשחלות אנושיות חיוביים ל-RFP בהשוואה ל-20% בלבד מהתאים השליליים ל-RFP הולידו כדור גידול בודד בבדיקת הספירות הראשוניות.

באופן מפתיע, מספרים גבוהים יותר של כדורים נספרים ממספרים נמוכים יותר של תאים מצופים הן במדיה מבוססת MGEM והן במדיה מבוססת D-M-E-M-F 12, מה שמדגים כי שיטות הציפוי מוטות מאוד את התוצאות בבדיקה זו. לעומת זאת, כאשר תאים משותקים על ידי תוספת של 1% מתיל צלולוז, יעילות היווצרות הכדור אינה תלויה בעיקר בצפיפות התאים בתרביות כדורים מבוססות תאים. כ-35% מהתאים מהכדורים החיוביים ל-RFP מאבדים את האות הפלואורסצנטי האדום שלהם לאחר שבעה ימים של תרבית, מה שמצביע על כך שתאים אלה עברו התמיינות בעוד שלמעלה מ-65% מהתאים שומרים על אות RFP המרמז על יכולת חידוש עצמי.

לעומת זאת, תאים מכדורים שנוצרו מתאי RFP שליליים בתחילה נשארים שליליים ל-RFP, מה שמצביע על כך שהם אינם יכולים לבסס מחדש את פוטנציאל תאי הגזע בתנאים אלה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי המבוצע על כדורים שנוצרו מתאים בודדים מאשר נתונים אלה ומדגים כי כדורים בודדים שמקורם בתאים חיוביים ל-RFP מכילים גם תאים חיוביים ל-RFP וגם תאים שליליים ל-RFP. ואילו כדורים שמקורם בתאים שליליים של RFP שומרים על היעדר האות האדום שלהם בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שינויים אחרים כמו נוגדנים, צביעה או ניתוח ביטוי גנים באמצעות PCR כמותי כדי לאפיין עוד יותר את התאים בעלי יכולת יצירה חמורה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי יש לבצע בדיקות השתלה in vivo בעכברים מדוכאי חיסון כדי לאמת את תכונות תאי הגזע של הגידול של התאים היוזמים של הכדור