תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation

מטרת הליך זה היא תרבית והפעלה חשמלית של עוברי עכבר, שבלול exvivo. על מנת לחקור היבטים שונים של התפתחות השבלול, כולל התמיינות מורפוגנזה ואירועי גדילה, זה מושג על ידי השגת ראש מעובר עכבר עוברי ביום 13. לאחר מכן, חשפו את האוזניים הפנימיות על ידי הסרת המוח ובודדו אותן מהעצם הרקתית המתפתחת על ידי ניתוק מבסיס הגולגולת.

לאחר מכן הסר את הסחוס שמעליו ופתח את צינור השבלול כדי לקבל את האפיתל החושי של השבלול. השלב האחרון הוא תרבית השבלול המנותח עם או בלי אלקטרופורציה למשך עד שבוע. בסופו של דבר, ניתן לנתח את השתלים להדמיית תאים חיים או כתם חיסוני קבוע ולנתח אותם על ידי הדמיה קונפוקלית, תרבות עוברי של עכבר.

Cochlear explan מספק מערכת מצוינת לחקר היבטים שונים של אורגנוגנזה, כגון התפשטות, אפיון סולפט וקוטביות בשבלול המתפתח וכיצד אירועים אלה תורמים לגדילה ולהתמיינות. לכן טכניקה זו מאפשרת לבצע מניפולציות פרמקולוגיות ולנטר את תפקודי הגנים ex vivo. וכך, בשילוב עם העברת הגנים באמצעות אלקטרופורציה, ניתן לשנות את ביטוי הגן המעניין ולפקח על תפקודו ברמת התא הבודד.

כדי להתחיל בהליך זה, הניחו ראש עובר עכבר E 13 בצלחת סוגאר סטרילית המכילה תמיסת חיתוך קרה. תחת מיקרוסקופ מנתח, קבעו את ראש העובר על ידי הנחת סיכות זעירות סביב אזור העין. לאחר מכן בעזרת שני זוגות מלקחיים סטריליים, הסר בזהירות את העור ופתח את הגולגולת בצד הגב לאורך קו האמצע.

לאחר מכן, הסר את המוח מחלל הגולגולת. ניתן לזהות את האוזניים הפנימיות הממוקמות בתוך העצמות הטמפורליות מרירית כלי הדם סביבן. לאחר מכן, נתחו את האוזניים הפנימיות מהעצמות הטמפורליות על ידי הנחת המלקחיים מתחת לרקמה ובידוד האוזן הפנימית מבסיס הגולגולת.

לאחר מכן, העבירו את האוזניים הפנימיות המנותחות לכלי חדש המכיל תמיסת חיתוך קר. כעת כוונו את האוזן הפנימית כך שהצד הגחוני פונה כלפי מעלה. ייצב את האוזן הפנימית על ידי החדרה עדינה של הקצה החד של סיכות המינוצ'ין דרך החלק הווסטיבולרי.

בעזרת מלקחיים עדינים במיוחד, חתכו את הסחוס שמעליו על ידי ביצוע חתך ליד החלון הסגלגל. ודא שהמלקחיים אינם מוחדרים עמוק מדי לתוך הסחוס מכיוון שהסחוס שמעליו מתמזג לפעמים עם צינור השבלול. לאחר מכן הסר בזהירות את הסחוס מהשבלול.

לאחר מכן, חשפו את האפיתל החושי על ידי הנחת המלקחיים בבסיס או בקודקוד צינור השבלול ומשכו בעדינות את גג השבלול החוצה. כשלב אחרון, הסר בזהירות את רקמת החיבור הבסיסית מהאפיתל החושי החשוף כך שבסיס משטח השבלול יהיה שטוח. לאחר מכן, בודדו את השבלול המנותח מהחלק הווסטיבולרי של האוזן הפנימית.

העבירו את האפיתל החושי של השבלול המנותח לתוך מטריצת קרום הבסיס תרבית מצופה היטב באמצעות כף סטרילית בגודל 1.5 מילימטר אם יש צורך בניקוי נוסף כדי להסיר רקמה מיותרת, ניתן לבצע זאת בשלב זה. לאחר מכן כוונו את תצוגה השבלול כשפני השטח הלומינליים של האפיתל פונים כלפי מעלה. שאפו את תמיסת ה-DMEM של מטריצת קרום המרתף כדי לשטח בזהירות את הרקמה ולהוסיף בעדינות 150 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי למנה.

ודא שכל x explan a נצמד היטב להחלקת כיסוי הזכוכית המצופה ואינו צף במדיום התרבית. לאחר מכן, העבירו בעדינות את השבלול המנותח לתוך צלחת תרבית סטרילית של 150 מילימטר והניחו אותו באינקובטור תרבית רקמות. 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לשלושה עד שישה DIV.

לאחר 1D IV.בדוק את התרבית תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לוודא שלמשטח השבלול יש היטב נצמד לצלחת התרבית. לאחר מכן המשיכו לדגור את התרבית in vivo לפרק הזמן הרצוי לפני עיבודה לאימונוהיסטוכימיה שתוגדר לאלקטרופורציה. ראשית יש לעקר צלחת זכוכית אחת מצופה סיגר 100 מילימטר על ידי חיטוי או השרייה של 70% אתנול למשך כ-20 דקות.

לאחר מכן הניחו לו להתייבש באוויר על ספסל נקי לפני השימוש. כעת הכינו DNA מווקטור ביטוי לבחירתכם באמצעות ערכת הכנה מתאימה של מקסי או MIDI. וקטורי הביטוי המשמשים בפרוטוקול זה הם מבנה ביטוי H אחד ומבנה ביטוי נוירו-D אחד.

והריכוז הסופי של ה-DNA צריך להיות לפחות מיקרוגרם אחד למיקרוליטר ב-DNA סטרילי RNA חופשי מים כדי להפעיל את ה-DNA לתוך ה-explane של השבלול האני. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת DNA פלזמה לכלי מצופה סיגר טרי של 100 מילימטר. לאחר מכן העבירו שבלול מנותח במלואו לתוך תמיסת ה-DNA כאשר פני השטח הלומינליים של האפיתל פונים כלפי מעלה.

הטה מעט את השבלול כך שיהיה בניצב למישור המנה. לאחר מכן, הנח את משוט האלקטרודה השלילי לכיוון האפיתל החושי ואת משוט האלקטרודה החיובית ליד בסיס השבלול באמצעות האלקטרו-אטור. ספק תשעה עד 10 פולסים של 24 מילי-וולט משך פעימה של 30 אלפיות השנייה.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית חם לשבלול המדורג אלקטרו. חזור על ההליכים עבור כל הוצאת השבלול ועבור ה-DNA של כל הגנים המעניינים לפני העברת השבלול המדורג אלקטרו לצלחת המצופה מטריצת ממברנת הבסיס לציפוי. לאחר מכן תרבית את כל השבלול המדורג אלקטרו באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני לפרק הזמן הרצוי, אשר לאחר מכן יעובד לכימיה של ציטו חיסוני.

תמונות אלה מציגות את שתלי השבלול העובריים של היום ה-13 מפאבים של עכבר מסוג CD one, אשר עוברים אלקטרופוזציה עם TH one, EEG FP או neuro D one EGFP Reporter. הם סומנו כחיסונים עם סמן ספציפי לתאי שיער, אנטי מיו שבע A או סמן עצבי שניים לאחד באדום. התאים המדורגים אלקטרו, שניתן לדמיין על ידי ביטוי EGFP נראים לאורך רכס האפיתל הגדול יותר, רכס האפיתל הקטן ותאי האפיתל החושי.

תאי אפיתל השבלול הנוירו-D 1 עברו טרנספטציה לאחר חמישה DIV רכשו את הפנוטיפ העצבי בתהליכים דנדריטיים, שרובם היו חיוביים לשניים אחד או ל-T oh H. תאים שעברו טרנספטציה היו חיוביים למיו שבע. ביטוי לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות עבור ליטר אינטל של שמונה עד 10 פופסים.

זה יאפשר זמן מספיק לתרבית דיסקציה, אלקטרופורציה וציפוי של האקספלן.