Name: תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וגין העברה על ידי Electroporation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: למד תרבות של עוברי explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי electroporation. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות השבלול ותפקוד גנים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר בראדלי שולט על הערותיו על פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R00 של המכונים הלאומיים לבריאות (5R00DC010220). פרויקט זה בוצע בחלל מעבדה משופץ בתמיכת Grant C06RR014516.

הערה: כל הפרוטוקולים באמצעות בעלי חיים חייבת להיות נבדקו ואושרה על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) וחייבת לעקוב אושרה שיטות לטיפול ולשימוש בחיות המעבדה באופן רשמי. כל הניתוחים צריכים להתבצע באמצעות טכניקה סטרילית על ספסל זרימה למינרית נקי. כפפות ומסיכה, אם תרצה בכך, יש ללבוש במהלך הליך זה. 1. Dissection של האוזן הפנימית עכבר עוברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה לצורך האיבר של קורטי תרבויות explant: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכסה המנוע תרבית רקמת הזרימה למינרית ידי הפעלת אור UV למשך כ 30 דקות ולחטא את המשטח עם אתנול 70% לפני השימוש. בנוסף, לעקר את כל מכשירי הנתיחה כולל כלים לנתיחה משובחים ומנות מצופות Sylgard לנתיחה עובר באמצעות החיטוי או על ידי השרייה באתנול 70% לפחות 20 דקות לפני השימוש. יוצקים את אתנול 70% ולאפשר את הכלים ומכשירים לייבוש באוויר בזרימה למינרית קליאה נקייהספסל n לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח מאוזנת של האנק סטרילית (HBSS) / (4 (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic) תערובת (HEPES) על ידי הוספת 10% מ10x HBSS ו 0.5% HEPES ולהתאים את ה- pH של כ 7.2 ומסנן לעקר פתרון סופי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לבצע את כל הניתוחים בפתרון HBSS / HEPES מקורר לשמר את הרקמה טובה יותר לאורך כל ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים מזכוכית מעיל תחתון עם מטריצת קרום במרתף על ידי הוספת 5 מיליליטר של הנשר בינוני השתנה הקר (4 ° C) סטרילי של Dulbecco (DMEM) לaliquot 300 μl של מטריצת קרום במרתף בצינור פוליפרופילן סטרילי 15 מיליליטר. מערבבים על ידי vortexing את התוכן ולהוסיף 150 μl של תערובת המטריצה-DMEM קרום במרתף למרכז של כל מנה תרבות, כך שהוא מכסה את כל התרבות גם בהווה במרכז הצלחת. לכסות את הכלים וחנות בחממה 37 ° C לפחות 45 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 4-5 מיליליטר מקורר HBSS לתוך הרי צלחות פטרי קלקר סטרילי ולהשאיר סגורים במכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות בצינור 15 מיליליטר פוליפרופילן סטרילי על ידי הוספת 9 מיליליטר של DMEM, תוספי N2 100 μl, 10 גר &#39;/ מיליליטר Cipro ו 1 מיליליטר של FBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של עוברים: הערה: בהליך זה לculturing explants שבלול מעוברי עכברים, אוזניים פנימיות אסיף מיום עוברי (E) 13 עצמות זמניות עם היום לאחר הפריה נשקלות כ9 E1. גם הפרוטוקול ניתן להשתמש עם אוזניים פנימיות עכבר עוברי החל מE12 לE18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר מתוזמן בהריון עם CO 2 ולהקריב את בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם או פרוטוקולים שאושרו מתאימים. לבצע euthanization ממכסת מנוע בתרבית הרקמה למינרית זרימה כדי לשמור על סטריליות בחדר תרבית הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עכבר מורדמים על מגבת נייר עם בטן כלפי מעלה ולחטא בטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הבטן על ידי גרירה עורעם מלקחיים מעוקלים ביד אחת ועור חתוך ושרירים לאורך קו האמצע עם מספריים באמצעות יד אחרת. שני חתכים בניצב משני הצדדים ולשלוף את הרחם בקפידה על ידי הרמת קרן רחם דו-צדדית עם מלקחיים ולנתק אותו ממתחת מספריים רקמות באמצעות חיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השרשרת העוברית בצלחת פטרי המכילה פתרון מקורר דיסקציה (תערובת HBSS / HEPES) והעברה לספסל הנקי מינרית הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עוברים בזהירות מהשליה ולהכניס אותם לתוך אחת מנות סטרילי פטרי המכילות פתרון לנתיחה. אם הפתרון הופך עקוב מדם, להעביר אותם לצלחת פטרי חדשה. הערה: בשלב זה, יכול להיות מבוים עובר באמצעות מדריך היערכות Theiler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף עוברים על ידי צביטה באזור הצוואר עם זוג מלקחיים או מספריים נקיים ומניח את הראשים בצלחת פטרי המכילה טרי פתרון לנתיחה מקורר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection של האוזניים הפנימיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> o מקוםראש עובר ne בצלחת sylgard סטרילית המכילה לנתח קר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון. עבודה תחת מיקרוסקופ לנתח בהגדלה של ~ 1.6x, לשתק את ראש העובר על ידי הצבת סיכות Minutien מסביב או קרוב יותר לאזור עיניים (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שני זוגות מלקחיים סטרילי להסיר בזהירות את העור ולפתוח את הגולגולת בצד הגב לאורך קו האמצע (איור 1). הסר מוח מחלל גולגולת ואוזניים פנימיות הנמצאות בתוך עצמות זמניות ניתן לזהות בשלב זה (איור 1 ג, ד). הציפוי הפנימי של כלי הדם, שהיא בדרך כלל נוכחים סביב האוזניים הפנימיות, יכול לשמש כנקודת ציון לזיהוי האוזן הפנימית בשלב זה (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האוזן הפנימית מהעצמות הזמניות על ידי הצבת המלקחיים מתחת לרקמה ובידוד האוזן הפנימית מבסיס הגולגולת וההעברה לצלחת חדשה המכילה פתרון לנתח קר (איור 1E, F). </li></ol></li></ol> 2. דור של איברים של תרבויות קורטי explant הערה: בשלב זה של התפתחות, רקמת סחוס היא ויכולה להיות גזור בקלות באמצעות מלקחיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט האוזן הפנימית, כך שהצד הגחוני פונה כלפי מעלה (איור 2 א) ולייצב את האוזן הפנימית על ידי בעדינות להכניס את הקצה החד של סיכות Minutien דרך חלק שיווי המשקל באוזן הפנימית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים ultrafine באמצעות לחתוך את הסחוס שמעליה על ידי ביצוע חתך באמצעות קצה אחד של מלקחיים ליד החלון הסגלגל ובזהירות להסיר את הסחוס משבלול האוזן (איור 2 ג). הערה: חשוב לוודא כי מלקחיים אינם מוכנסים עמוק מדי לתוך הסחוס כסחוס שמעליה לעתים התמזגו עם צינור השבלול ובמקרה זה הוא מועיל להשתמש במלקחיים סגורים לשחרר סחוס מצינור השבלול הבסיסי על ידי גירוד מתחת ל surface של הסחוס. בשלב זה של התפתחות, ספירלת השבלול היא רק שלושה רבעים מתור באורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לחשוף את האפיתל החושית על ידי הצבת המלקחיים באזור המועדף של צינור השבלול, או הבסיס או לכל הקודקוד, ומשייכתו בעדינות את הגג של השבלול (איור 2 ד). הערה: הגג של השבלול יש להסיר לחלוטין כפי שהוא יכול להסוות את האפיתל החושית פוגע הניתוח. הערה: הליך זה חייב להיעשות בעדינות כפי שהוא קל לקרוע את האפיתל החושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כצעד אחרון, להסיר בזהירות את רקמת חיבור הבסיסית מהאפיתל החושית החשופה, כך שהבסיס של explant השבלול הוא אחיד שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את השבלול גזור מחלק שיווי המשקל באוזן הפנימית באמצעות מלקחיים. זה יכול להתבצע לפני או אחרי 2.4 (2E איור) הצעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את האפיתל החושית השבלול גזור לתוך membra מרתףהתרבות גם באמצעות scooper סטרילי 1.5 מ&quot;מ (איור 2F) מצופה מטריצת ne. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט explant השבלול עם משטח lumenal של האפיתל פונה כלפי מעלה ולשאוב את פתרון המטריצה-DMEM קרום במרתף לשטח בזהירות את הרקמה ולהחליף אותו עם 150 μl של מדיום תרבות הטרי בעדינות על ידי הוספה לצלחת. יש להקפיד לוודא שכל explant שומר היטב לcoverslip הזכוכית המצופה ולא צף במדיום התרבות. ודא שקצה המלקחיים הוא הצביע למעלה בזמן ההדבקה ולזכוכית כדי למנוע נזק לexplant השבלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את המנה התרבות לתוך צלחת סטרילית 150 מ&quot;מ תרבות ומקום בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 לתקופה רצויה של זמן, בדרך כלל 3-6 ימים במבחנה (DIV). לאחר DIV 1, לבחון תרבויות תחת מיקרוסקופ לנתח לוודא כי explant השבלול דבק גם למנת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בcubation במבחנה לאורכים רצויים של זמן, תרבויות מעובדות אימונוהיסטוכימיה. הערה: תרבויות explant בדרך כלל טופחו במשך 6 DIV שהוא שווה ערך לשלב ההתפתחותי, P0. לאחר הדגירה במבחנה, יכולות להיות מעובד תרבויות עבור יישומים נוספים במורד הזרם כמו אימונוהיסטוכימיה (איור 3), RT-PCR, הכלאה באתר, ו / או כתם מערבי. </li></ol> 3. העברת גנים בתיווך Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה לצורך electroporation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר אחד 100 מ&quot;מ צלחת זכוכית sylgard מצופה על ידי מעוקר או טבילה באתנול 70% לכ -20 דקות ולאפשר לאוויר יבש בספסל נקי לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA מוקטור ביטוי של בחירה באמצעות ערכות maxi- או midi-הכנה מתאימות. וקטורי הביטוי בשימוש בפרוטוקול זה הם pIRES2-Atoh1.EGFP וpCLIG-NeuroD1.EGFP. הריכוז הסופי של ה- DNA צריך להיות מיקרוגרם / μl לפחות 1 בDNA סטרילי /-RNAse חופשית מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporating DNA לתוך explants שבלול עוברי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של פתרון ה- DNA פלסמיד לצלחת Sylgard מצופה 100 מ&quot;מ טרי ולהעביר explant גזור באופן מלא שבלול (המתקבל משלב 2.5) לפתרון ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם משטח lumenal של האפיתל פונה כלפי מעלה, להטות את השבלול מעט כל כך שזה ניצב למישור של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את משוטי אלקטרודה משני הצדדים של השבלול עם ההנעה שלילית (קתודה) לקראת האפיתל החושית וההנעה החיובית (אנודה) הממוקמת בסמוך לבסיס של השבלול. הערה: מאחר שה- DNA טעון שלילי, זה נודד משלילי להאלקטרודה חיובית ועל ידי הצבת סוף הקתודה של החללית בסמוך להאפיתל החושית; DNA בעיקר ילך דרך פני השטח של האפיתל החושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות electroporator, לספק 9 עד 10 פולסים של 24 mV, 30 משך דופק msec עם בורר דוושת רגל על ​​tהוא electroporator, ולאחר מכן להוסיף של מדיום תרבות החם 100 μl לשבלול Electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2.1-4 לכל explants השבלול ולDNA של כל הגנים של עניין ולהעביר את cochleae electroporated לתוך הצלחת מצופה מטריצת קרום במרתף לציפוי (שלב 2.7). כל cochleae תרבות electroporated ב-37 מעלות צלזיוס, 5% 2 חממה humidified CO לאורכים רצויים של זמן שלאחר מכן ניתן יהיה מעובד לimmunocytochemistry. הערה: השבלול מהמלטה שלמה של CD1 עכבר (כ 8-12 גורים) יכולה להיות מבודד, microdissected, electroporated ומצופית ב&lt; 4 שעות. </li></ol></li></ol> 4. ניתוח של תרבויות השבלול explant הערה: התרבויות בדרך כלל טופחו במשך 6 DIV שהוא שווה ערך לשלב ההתפתחותי, P0. לאחר הדגירה במבחנה, התרבויות הם קבועים ומעובדים עבור immunocytochemistry. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אורך רצוי של incubation, להסיר בינוני תרבות ובמהירות לשטוף את explant השבלול שבנאגר מלוח פוספט (PBS) דגירה בparaformaldehyde 4% (מוכן בPBS) במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את מקבע על ידי PBS הוספה ולשטוף בPBS שלוש פעמים במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize באמצעות PBS-T (Tween + 0.5% PBS) למשך 30 דקות לפני החסימה עם PBS-T המכיל סרום עיזים 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בפתרון נוגדן ראשוני המכילה נוגדן ראשוני בPBS-T עם 1% עזים בסרום הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השבלול שלוש פעמים בטמפרטורת חדר באמצעות PBS-T 15 דקות כל אחד לפני שמוסיף את נוגדנים משני Alexa מצומדות- מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז explant השבלול הוא בתרבית על coverslip זכוכית יכול להיות מטופלים בנפרד על ידי בידוד coverslip מצלחת והרכבה בשקופית. זו יכולה להיות מושגת על ידי השרייה המנה התרבות בOS30 ממס במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר. באמצעות סכין גילוח סטרילי, לנתק את coverslip מדאיש והר בשקופית ולדמיין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol><li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+development+of+the+organ+of+Corti+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Organotypic development of the organ of Corti in culture.</a> J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).</li>
<li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).</li>
<li>Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes1+is+a+negative+regulator+of+inner+ear+hair+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation.</a> Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).</li>
<li>Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+regulates+development+of+the+sensory+epithelium+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea.</a> Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).</li>
<li>Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+differentiation+and+DNA+binding+%28Ids%29+regulate+Math1+and+hair+cell+formation+during+the+development+of+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti.</a> J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).</li>
<li>Dabdoub, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+signaling+in+prosensory+domain+specification+and+subsequent+hair+cell+differentiation+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).</li>
<li>Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hey2+regulation+by+FGF+provides+a+Notch-independent+mechanism+of+maintaining+pillar+cell+fate+in+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti.</a> Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).</li>
<li>Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+induces+neuronal+formation+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea.</a> J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press. San Diego. (1995).</li>
<li>Sher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+and+postnatal+development+of+the+inner+ear+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).</li>
<li>Torres, M., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the vertebrate inner ear.</a> Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).</li>
<li>Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+inner+ear+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of inner ear induction.</a> Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).</li>
<li>Puligilla, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+world%E2%80%99s+best+hearing+aid%3B+regulation+of+cell+fate+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).</li>
<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).</li>
<li>Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-mediated+gene+transfer+to+study+the+molecular+physiology+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).</li>
<li>Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+hair+cells+and+support+cells+of+the+murine+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea.</a> Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

כל התאים בתוך המבוך הקרומי של האוזן הפנימית העכבר כוללים חושי, nonsensory וכל הנוירונים הגנגליון הספירלה נגזרים מplacodally-נגזר otocyst ממוקם בסמוך למוח האחורי של האאקטודרם, סביב 10-14 E8. בE11, אזור הגחון של otocyst משתרע ליצירת צינור השבלול וכפיתוח ממשיך, קבוצה של תאי האפיתל בשבלול האוזן, כמו גם באזורים אחרים של otocyst, הפכה צוין ככתמים prosensory שיהיה בהמשך להצמיח סוגים שונים של תאי שיער ותאי mechanosensory תמיכה nonsensory. בשבלול הפיתוח, שורה אחת של תאי שיער פני...

איבר היונקים של קורטי מורכב מפסיפס של סוגי תאים מיוחדים, כולל שני סוגים של תאי שיער מכניים-חושיים וכן לפחות ארבעה סוגים של תאים תומכים לא חושיים, מה שהופך אותו למערכת מודל אידיאלית לחקר תהליכים תאיים נורמליים כמו התפשטות, מפרט גורל, התמיינות ודפוס. בנוסף, התפתחות תקינה של סוגי תאים שונים אלה חיונית לתפקוד שמיעה תקין. לפיכך, חיוני להבין את הגורמים, הן המולקולריים והן התאיים, המווסתים את התפתחותם. עם זאת, גודלו הקטן של שבלול העכבר כמו גם חוסר הנגישות שלו מהווים אתגר מיוחד למחקרי ביטוי גנים. יתר על כן, רוב אירועי המפרט והדפוס של גורל התא מתרחשים בתקופות זמן עובריות ומסתיימים לרוב לפני הלידה. לכן, זיהוי ואפיון של אירועי איתות במהלך תקופות זמן עובריות חיוני כדי לקבל תובנה לגבי הבסיס המולקולרי של מורפוגנזה של השבלול. 
כאן, אנו מדגימים שיטה לתרבית שבלול שלם במבחנה מאוזניים פנימיות של עכברים עובריים. הרציונל מאחורי השימוש בטכניקה זו הוא ששבלול מתורבת שומר על המאפיינים המולקולריים והמורפולוגיים שלו ובכך מספק מודל רב ערך לחקירת גנים מועמדים פוטנציאליים ולחקר המנגנונים המעורבים במורפוגנזה של השבלול. למרות שעכברים טרנסגניים יכולים לשמש למחקרי ביטוי גנים, לעתים קרובות יש צורך במערכת חוץ גופית לניטור תפקודי גנים ספציפיים. יתר על כן, ניתן להקים תרביות שבלול מעוברי עכברים טרנסגניים כך שניתן יהיה לחקור את התפתחותם במבחנה ותגובתם לגורמים מסיסים ואנטגוניסטים שונים. למרות שעוברים ביום 13 (E13) משמשים בפרוטוקול זה, תרביות מ-E12 או E14 לאוזניים הפנימיות המוקדמות לאחר הלידה יכולות לתת תוצאות דומות. 
אנו מציגים גם טכניקת העברת גנים בצמחי שבלול עובריים מתורבתים באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. לאחר הבידוד של צמחי השבלול, ניתן להשתמש באלקטרופורציה כדי לבטא פלסמידים של DNA של גנים מעניינים בתאים בודדים בתוך צינור השבלול. טכניקה זו משמשת כגישה משלימה למחקרים המשתמשים בעכברים טרנסגניים כדי לקבל תובנה לגבי המסלולים המולקולריים העומדים בבסיס הפנוטיפ התאי. באמצעות שיטה זו של העברת גנים, מגוון סוגי תאי אפיתל בתוך השבלול העוברי עוברים טרנספטציה, ובכך מאפשרים ניתוחי אובדן ורווח תפקוד ברמת התא הבודד. בנוסף, ניתן לבצע מחקרים אלקטרופיזיולוגיים גם בתרביות שבלול8. שיטה זו של אלקטרופורציה במבחנה היא פשוטה ופשוטה יחסית, בשילוב עם נזק מינימלי לרקמה, הביאה להתרחבות מהירה של טכניקה זו.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ' s שונה</td><td>בינוני Gibco</td><td>12430-054</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>N-2 תוסף (100x)</td> <td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin hydrochloride</td><td>Cellgro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>צלחת זכוכית 60 מ"מ</td><td>קימבל צ'ייס</td><td>23062-6015/23064-6015</td><td></td></tr><tr><td>צלחת זכוכית 100 מ"מ</td><td>קימבל צ'ייס</td><td>23064-10015/23062-10015</td><td></td></tr><tr><td>סיכות Minutien</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>מחולל דופק</td><td>Protech International Inc</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבות תחתון זכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת מטריג'ל</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית, 60 x 15 מ"מ</td><td>Becton Dickinson</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OS-30</td><td>Dow Corning</td><td>4021768</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים, 15 מ"ל</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Myosin 6</td><td>Proteus Biosciences Inc</td><td>25-6791</td><td></td></tr><tr><td>Myosin 7a</td><td>Proteus Biosciences Inc</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>TuJ1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבות של עוברי explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי electroporation

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

תאי שיער שמיעתיים הממוקמים בתוך איבר העכבר של קורטי מזהים ומעבירים מידע קולי למערכת העצבים המרכזית. תאי השיער המכנו-סנסוריים מיושרים בשורה אחת של תאי שיער פנימיים ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים המשתרעים לאורך הציר הבסיסי עד האפיקלי של השבלול. טכניקת תרבית האקספלנט המתוארת כאן מספקת שיטה יעילה לבידוד ותחזוקה של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של העכבר העוברי. כמו כן, המורפולוגיה והמאפיינים המולקולריים של תאי שיער חושיים ותאים תומכים לא חושיים בתוך תרביות צמח השבלול דומים לאלה שנצפו in vivo וניתן לחקור אותם בסביבה התאית הפנימית שלהם. צמחי השבלול יכולים לשמש ככלי ניסיוני חשוב לזיהוי ואפיון של מסלולים מולקולריים וגנטיים המעורבים באפיון ובדפוס התאים. למרות שמודלים של עכברים טרנסגניים מספקים גישה יעילה למחקרי ביטוי גנים, מספר ניכר של מוטציות עכברים מתים במהלך ההתפתחות העוברית ובכך מעכבים את הניתוח והפרשנות של פנוטיפים התפתחותיים. ניתן לתרבת את איבר קורטי מעכברים מוטנטיים שמתים לפני הלידה כך שניתן יהיה לנתח את התפתחותם במבחנה ואת תגובותיהם לגורמים שונים. בנוסף, אנו מתארים טכניקה לאלקטרופורציה של צמחי שבלול עובריים ex vivo שניתן להשתמש בהם כדי להפחית או לבטא יתר על המידה גנים ספציפיים ולנתח את התפקוד האנדוגני הפוטנציאלי שלהם ולבדוק אם תוצר גן ספציפי נחוץ או מספיק בהקשר נתון כדי להשפיע על התפתחות השבלול של יונקים1-8.

אנו מתארים שיטה לבידוד השבלול (cochlea) מאוזניים פנימיות עובריות וביצוע מיקרו-דיסקציה לחשיפת האפיתל החושי. לאחר הדיסקציה, ניתן לזרוע ולגדל אותו כתעלת שבלול שלמה (איור 3) ולנתחו באמצעות אימונוהיסטוכימיה. תרביות של נתחי שבלול (cochlear explants) מהוות מערך בדיקה שימושי לבחינת ההשפעה של מגוון גורמים מסיסים ותרופות פרמקולוגיות על התפתחות השבלול. לאחר ביצוע דיסקציה של נתחי השבלול, ניתן להשתמש בטכניקת אלקטרופורציה כדי לבטא באופן לא טבעי גנים רלוונטיים ולבחון את השפעתם על המורפוגנזה של השבלול. התוצאות המוצגות כ...

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי. אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

מטרת הליך זה היא תרבית והפעלה חשמלית של עוברי עכבר, שבלול exvivo. על מנת לחקור היבטים שונים של התפתחות השבלול, כולל התמיינות מורפוגנזה ואירועי גדילה, זה מושג על ידי השגת ראש מעובר עכבר עוברי ביום 13. לאחר מכן, חשפו את האוזניים הפנימיות על ידי הסרת המוח ובודדו אותן מהעצם הרקתית המתפתחת על ידי ניתוק מבסיס הגולגולת.לאחר מכן הסר את הסחוס שמעליו ופתח את צינור השבלול כדי לקבל את האפיתל החושי של השבלול. השלב האחרון הוא תרבית השבלול המנותח עם או בלי אלקטרופורציה למשך עד שבוע. בסופו של דבר, ניתן לנתח את השתלים להדמיית תאים חיים או כתם חיסוני קבוע ולנתח אותם על ידי הדמיה קונפוקלית, תרבות עוברי של עכבר.Cochlear explan מספק מערכת מצוינת לחקר היבטים שונים של אורגנוגנזה, כגון התפשטות, אפיון סולפט וקוטביות בשבלול המתפתח וכיצד אירועים אלה תורמים לגדילה ולהתמיינות. לכן טכניקה זו מאפשרת לבצע מניפולציות פרמקולוגיות ולנטר את תפקודי הגנים ex vivo. וכך, בשילוב עם העברת הגנים באמצעות אלקטרופורציה, ניתן לשנות את ביטוי הגן המעניין ולפקח על תפקודו ברמת התא הבודד.כדי להתחיל בהליך זה, הניחו ראש עובר עכבר E 13 בצלחת סוגאר סטרילית המכילה תמיסת חיתוך קרה. תחת מיקרוסקופ מנתח, קבעו את ראש העובר על ידי הנחת סיכות זעירות סביב אזור העין. לאחר מכן בעזרת שני זוגות מלקחיים סטריליים, הסר בזהירות את העור ופתח את הגולגולת בצד הגב לאורך קו האמצע.לאחר מכן, הסר את המוח מחלל הגולגולת. ניתן לזהות את האוזניים הפנימיות הממוקמות בתוך העצמות הטמפורליות מרירית כלי הדם סביבן. לאחר מכן, נתחו את האוזניים הפנימיות מהעצמות הטמפורליות על ידי הנחת המלקחיים מתחת לרקמה ובידוד האוזן הפנימית מבסיס הגולגולת.לאחר מכן, העבירו את האוזניים הפנימיות המנותחות לכלי חדש המכיל תמיסת חיתוך קר. כעת כוונו את האוזן הפנימית כך שהצד הגחוני פונה כלפי מעלה. ייצב את האוזן הפנימית על ידי החדרה עדינה של הקצה החד של סיכות המינוצ'ין דרך החלק הווסטיבולרי.בעזרת מלקחיים עדינים במיוחד, חתכו את הסחוס שמעליו על ידי ביצוע חתך ליד החלון הסגלגל. ודא שהמלקחיים אינם מוחדרים עמוק מדי לתוך הסחוס מכיוון שהסחוס שמעליו מתמזג לפעמים עם צינור השבלול. לאחר מכן הסר בזהירות את הסחוס מהשבלול.לאחר מכן, חשפו את האפיתל החושי על ידי הנחת המלקחיים בבסיס או בקודקוד צינור השבלול ומשכו בעדינות את גג השבלול החוצה. כשלב אחרון, הסר בזהירות את רקמת החיבור הבסיסית מהאפיתל החושי החשוף כך שבסיס משטח השבלול יהיה שטוח. לאחר מכן, בודדו את השבלול המנותח מהחלק הווסטיבולרי של האוזן הפנימית.העבירו את האפיתל החושי של השבלול המנותח לתוך מטריצת קרום הבסיס תרבית מצופה היטב באמצעות כף סטרילית בגודל 1.5 מילימטר אם יש צורך בניקוי נוסף כדי להסיר רקמה מיותרת, ניתן לבצע זאת בשלב זה. לאחר מכן כוונו את תצוגה השבלול כשפני השטח הלומינליים של האפיתל פונים כלפי מעלה. שאפו את תמיסת ה-DMEM של מטריצת קרום המרתף כדי לשטח בזהירות את הרקמה ולהוסיף בעדינות 150 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי למנה.ודא שכל x explan a נצמד היטב להחלקת כיסוי הזכוכית המצופה ואינו צף במדיום התרבית. לאחר מכן, העבירו בעדינות את השבלול המנותח לתוך צלחת תרבית סטרילית של 150 מילימטר והניחו אותו באינקובטור תרבית רקמות. 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לשלושה עד שישה DIV.לאחר 1D IV.בדוק את התרבית תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לוודא שלמשטח השבלול יש היטב נצמד לצלחת התרבית. לאחר מכן המשיכו לדגור את התרבית in vivo לפרק הזמן הרצוי לפני עיבודה לאימונוהיסטוכימיה שתוגדר לאלקטרופורציה. ראשית יש לעקר צלחת זכוכית אחת מצופה סיגר 100 מילימטר על ידי חיטוי או השרייה של 70% אתנול למשך כ-20 דקות.לאחר מכן הניחו לו להתייבש באוויר על ספסל נקי לפני השימוש. כעת הכינו DNA מווקטור ביטוי לבחירתכם באמצעות ערכת הכנה מתאימה של מקסי או MIDI. וקטורי הביטוי המשמשים בפרוטוקול זה הם מבנה ביטוי H אחד ומבנה ביטוי נוירו-D אחד.והריכוז הסופי של ה-DNA צריך להיות לפחות מיקרוגרם אחד למיקרוליטר ב-DNA סטרילי RNA חופשי מים כדי להפעיל את ה-DNA לתוך ה-explane של השבלול האני. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת DNA פלזמה לכלי מצופה סיגר טרי של 100 מילימטר. לאחר מכן העבירו שבלול מנותח במלואו לתוך תמיסת ה-DNA כאשר פני השטח הלומינליים של האפיתל פונים כלפי מעלה.הטה מעט את השבלול כך שיהיה בניצב למישור המנה. לאחר מכן, הנח את משוט האלקטרודה השלילי לכיוון האפיתל החושי ואת משוט האלקטרודה החיובית ליד בסיס השבלול באמצעות האלקטרו-אטור. ספק תשעה עד 10 פולסים של 24 מילי-וולט משך פעימה של 30 אלפיות השנייה.לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית חם לשבלול המדורג אלקטרו. חזור על ההליכים עבור כל הוצאת השבלול ועבור ה-DNA של כל הגנים המעניינים לפני העברת השבלול המדורג אלקטרו לצלחת המצופה מטריצת ממברנת הבסיס לציפוי. לאחר מכן תרבית את כל השבלול המדורג אלקטרו באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני לפרק הזמן הרצוי, אשר לאחר מכן יעובד לכימיה של ציטו חיסוני.תמונות אלה מציגות את שתלי השבלול העובריים של היום ה-13 מפאבים של עכבר מסוג CD one, אשר עוברים אלקטרופוזציה עם TH one, EEG FP או neuro D one EGFP Reporter. הם סומנו כחיסונים עם סמן ספציפי לתאי שיער, אנטי מיו שבע A או סמן עצבי שניים לאחד באדום. התאים המדורגים אלקטרו, שניתן לדמיין על ידי ביטוי EGFP נראים לאורך רכס האפיתל הגדול יותר, רכס האפיתל הקטן ותאי האפיתל החושי.תאי אפיתל השבלול הנוירו-D 1 עברו טרנספטציה לאחר חמישה DIV רכשו את הפנוטיפ העצבי בתהליכים דנדריטיים, שרובם היו חיוביים לשניים אחד או ל-T oh H. תאים שעברו טרנספטציה היו חיוביים למיו שבע. ביטוי לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות עבור ליטר אינטל של שמונה עד 10 פופסים.זה יאפשר זמן מספיק לתרבית דיסקציה, אלקטרופורציה וציפוי של האקספלן.

culture-embryonic-mouse-cochlear-explants-gene-transfer

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מציגים שתי טכניקות מניפולציה ביטוי גנים בתאי הגנגליון ברשתית Murine (RGCs) על...

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו...

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

אנו מדגימים שיטה להשתלת תאים מתורבתים לאתרים מוגדרים של עוברי עכברים מוקדמים כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם in vivo. אנו מציגים גם שיטת אלקטרופורציה אופטימלית המשתמשת בנימי זכוכית בקוטר ידוע, המאפשרת העברה מדויקת של DNA אקסוגני לכמה תאים בעוברים.

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

איבר השמיעה מתווך את השמיעה. כאן אנו מציגים שיטת מיקרו-אלקטרופורציה שונה בביצית המותאמת לחקר התפשטות והתמיינות של תאי אב שמיעתיים באיבר השמיעה המתפתח.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

הפרוטוקול הנוכחי מעדכן פרוטוקולים קודמים ומשלב גישות פשוטות יחסית לגידול צמחי שבלול באיכות גבוהה. זה מספק איסוף נתונים אמין והדמיה ברזולוציה גבוהה בתאים חיים וקבועים. פרוטוקול זה תומך במגמה המתמשכת של חקר תאי האוזן הפנימית.

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

למד תרבות של עוברי explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי electroporation. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות השבלול ותפקוד גנים בביולוגיה התפתחותית.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation

גלה סרטונים נוספים