Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר חיידקים באופן לא פולשני ישירות לריאות של עכברים. זה מושג על ידי העמסת כרית אוויר של 150 מיקרוליטר למזרק אטום לגז, ולאחר מכן 50 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים המוכן. בשלב השני, עכבר מורדם מוחדר עם קטטר בגודל 20 באמצעות חוט מנחה כדי לסייע במיקום.

לאחר מכן, לאחר אישור הצלחת האינטובציה באמצעות מד זרימה פשוט, החיסון החיידקי מועבר דרך הצנתר ישירות לריאה עם מחט קהה ארוכה בגודל 22. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בחיסון תוך-קנה הנשימה או בהשמטת אינטובציה כדי לחקור מחלות בדרכי הנשימה התחתונות בעכברים, תוך הימנעות ממעורבות מקבילה של דרכי הנשימה העליונות. היתרון העיקרי של חיקוי על פני שיטות חיסון בין-אף הוא שטכניקה זו מאפשרת אספקה מדויקת וניתנת לשחזור של חיסון ישירות לריאות.

מכיוון ש-IIT היא טכניקה לא כירורגית, היא גם מפחיתה את הפוטנציאל לסיבוכים הקשורים להליכים כירורגיים תוך קנה הנשימה. למרות ששיטה זו יכולה לספק מנגנון אמין להעברת חיידקים לריאה כדי לחקור פתוגנזה, ניתן ליישם IMA גם על העברת ריאגנטים אחרים, כגון תרכובות סביבתיות לחקר נזק לריאות, מתן מטרה של טיפולים לטיפול ומתן בדיקות הדמיה או SRNA לחקר ביולוגיה ריאתית בסיסית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם שלב האינטובציה מכיוון שהשלב דורש מיקום זהיר של החיה וההיקף האוטומטי להכנסת חוט מנחה.

הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה מכיוון שקשה לתאר את המיקום הראשוני של חוט ההנחיה לתוך קנה הנשימה לחוקרים חדשים. 15 שעות לפני ההתקנה יש לחסן שלושה מיליליטר של תרבית מרק עם מושבת חיידקים אחת ולגדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס ושייקר ב-200 סל"ד. לאחר 15 שעות, סובב מיליליטר אחד מהתאים בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, והשהה מחדש את החך במיליליטר אחד של PBS.

לאחר מכן, מדוד דילול של 1 עד 10 של תרחיף מלאי החיידקים ב-OD 600 כדי לקבוע את ריכוז החיידקים. לאחר מכן יש לדלל את תאי החיידקים ב-PBS לריכוז הרצוי של חיידקים לכל 50 מיקרוליטר חיסון. עבור התקנת ה-IIT, עכברים מוכנים ל-IIT על ידי מתן תמיסת לידוקאין של 2% לעכבר מורדם קלות על ידי עכברי מחט גבאג'.

חזרה להרדמה בזמן שהלידוקאין נכנס לתוקף. כעת שואבים 150 מיקרוליטר אוויר למזרק ביטול מסוג גז של 250 מיקרוליטר, המצויד במחט קהה ארוכה בגודל 22. לאחר מכן קדם את בוכנת הטפלון מסימן 150 מיקרוליטר לסימון 200 מיקרוליטר על גוף המזרק כדי לשאוב 50 מיקרוליטר של החיסון החיידקי בעת טעינת המזרק.

LA, עכבר מורדם שוכב על משטח אינטובציה המאבטח את החיה על ידי החותכות על טבעת ללא טבעת המחוברת לרצועת סקוטש המחוברת לפלטפורמה. הרם את העכבר לשיפוע של 45 מעלות ולאחר מכן השתמש במוליך מיקרו כותנה כדי למשוך את הלשון בתנועת גלגול עם היד הדומיננטית. לאחר מכן, עם היד הלא דומיננטית, השתמש באוטוסקופ הפעלה המתאים לספקולציה של אינטובציה כדי לשמור על נסיגת הלשון ולדמיין את האפיגלוטיס.

לאחר מכן החזיקו ביד הדומיננטית חוט מנחה המושחל דרך קטטר בגודל 20, החדירו את העכבר לעומק של 10 מילימטר בתוך קנה הנשימה והוציאו את האוטוסקופ. אבטח את הקטטר ביד הלא דומיננטית. לאחר מכן חבר לזמן קצר את הפיתוי המחובר באורך של צינור שקוף 16 המכיל צבע צבעוני לקטטר.

הצבע אמור לנדוד במהירות קדימה ואחורה בתגובה לנשימת החיה כאשר בעל החיים עבר אינטובציה מוצלחת. הכנס את המחט הקהה בגודל 22 לתוך הצנתר והוציא את החיסון ישירות לריאה בתנועת נוזל אחת. לאחר מכן הסר מיד את המחט והצנתר מהחיה והחזיר את העכבר לכלוב שלו עם ניטור עד שהחיה תתאושש לחלוטין מההרדמה.

כדי להעריך את העומס החיידקי של רקמת הריאה הנגועה, הסר את הריאות בטכניקה סטרילית והנח את הרקמה בשקית דגימה סטרילית של אונקיה אחת. לאחר שקילת שקית הדגימה בתוספת הריאות, הוסף מיליליטר אחד של PBS סטרילי לרקמה ומכור מחדש את שקית הדגימה. לאחר מכן גלגל בעדינות פיפטה סרולוגית של 25 מיליליטר על שקית הדגימה כדי להומוגניזציה של הרקמה.

הסר את הרקמה המחוברת דרך מסנן קיר פוליאסטר סטרילי וטפל בהומוגנאט עם טריטון X 100 בריכוז סופי של 1% כדי לשחרר את החיידקים. לאחר מכן, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לבצע דילול סדרתי פי שישה של ההומוגנאט בצלחת באר UBO 96. לאחר מכן השתמש בשמונה בארות רב-ערוציות כדי לצלחת את המשולש ההומוגני של 10 מיקרוליטר על צלחת אגר LBA.

לבסוף, דגרו את הלוחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס וספרו את היחידות היוצרות מושבה למחרת. העברת החיידקים יעילה ביותר בשיטה זו, כאשר למעלה מ-98% מהחיסון הפסאודומונס אירוגן הוחזר מריאות החיות שהוחדרו בניסוי מייצג זה. יתר על כן, התקנת IIT ניתנת לשחזור ללא קשר לריכוז החיסון הניתן.

כדי לדמיין את התפלגות החומר המוחדר בשיטת IIT, ניתן להעביר לריאות 50 מיקרוליטר של 0.1% צבע כחול מבריק של קומאסי כפי שהודגם זה עתה עבור החיסון. שימו לב, חלוקת הצבע לכל אונות הריאה לאחר שליטה. ניתן לבצע שיטה זו במהירות עם צוות של שני חוקרים בזמן ממוצע של שתיים-שלוש דקות, כולל הרדמה, חיסון IMA והתאוששות מהרדמה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לא לבצע יותר משני ניסיונות כושלים להחדיר את העכבר. אינטובציה כושלת עלולה לגרום לטראומה פוטנציאלית מהחדרת הקטטר לוושט במקום לקנה הנשימה. פתוגנים נשימתיים רבים, כולל אלה הדורשים הכלת שרירי הבטן L-3 יכולים להיות מועברים ביעילות על ידי imed מכיוון שניתן לבצע הליך זה כפי שמודגם על ידי ארונות בטיחות ובנוסף על ידי חוקרים הלובשים הגנה נשימתית מלאה כולל מגן פנים.

הוכחנו כי imit היא שיטה מדויקת ויעילה מאוד להעברת חומרים ישירות לריאות של עכברים. מאפיינים אלה הופכים את האימיט למתאים היטב למחקרים מסוג GLP הדורשים מערכות מודל הניתנות לשחזור גבוה.