Name: תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למדו לייצר אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) מתאי גזע iPS באמצעות טכניקת מיקרובארים ליצירת גופי עובר בגדלים מוגדרים. שיטה זו משפרת את יעילות ההתמיינות לקו התאים הרשתי ומספקת כלי חשוב למחקר רפואי רגנרטיבי של מחלות רשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הדעות או הטענות הכלולות כאן הן דעותיהם הפרטיות של המחברים ואין לפרש אותן כרשמיות או כמשקפות את העמדות של משרד הצבא או משרד ההגנה. מחקר זה בוצע בזמן שהמחברים אלברטו מוניז, ראמש ר. קאיני, וויטני א גרין וג'ה-הייק צ'וי החזיקו בפוסט-דוקטורט של המועצה הלאומית למחקר ב-USAISR. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר לרפואה שיקומית קלינית של צבא ארה"ב (CRMRP) ותוכנית המחקר לרפואה מבצעית צבאית (MOMRP).

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li>
<li>Ukrohne, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4+reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).</li>
<li>Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+outside+the+liver%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+hepatic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications.</a> World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+source+of+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a source of cardiac regeneration.</a> J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+greatly+improve+conversion+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+the+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage.</a> Stem Cells Int. 2012, 140427(2012).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li>
<li>Cour la, M., Tezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Organ+Biology%22%5BJournal%5D)">The Retinal Pigment Epithelium.</a> Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).</li>
<li>Vaajassari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+defined+and+xeno-free+differentiation+of+functional+human+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Mol Vis. 17, 558-575 (2011).</li>
<li>Carr, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152(2009).</li>
<li>Muniz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+uptake%2C+processing%2C+and+secretion+in+human+iPS-RPE+support+the+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).</li>
<li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li>
<li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+embryoid+body+formation%3A+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li>
<li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust%2C+reproducible+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com">http://www.stemcell.com</a> (2010).</li>
<li>The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: 
 <a target="_blank" href="http://archive.today/0qTh">http://archive.today/0qTh</a> (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

על מנת לממש את ההבטחה המלאה של תאי גזע pluripotent לטיפול בתאים, יש צורך להסדיר הבידול שלהם באופן עקבי לשחזור. דו&quot;ח זה מתאר פרוטוקולים כדי ליצור EBS-נשלט באמצעות טכנולוגיית גודל צלחת microwell, ליזום בידול כלפי הרשתית ולזהות סמני חלבון וגן של הרשתית. כדי לסנכרן את הבידול במבחנה, בגדלים אחידים של EBS נוצרו על ידי מספרים ידועים של תאי iPS centrifuged בצלחות microwell על ידי צבירת כפייה. Immunocytochemistry ותגובה הפוך שעתוק השרשרת של פולימראז (RT-PCR) משמשים כדי לפקח ע...

גזע pluripotent תאים (iPS) מושרה הם סוג של תאי גזע pluripotent נגזר על ידי תכנות מחדש של תאים בוגרים עם גורמים חיצוניים 1. בניגוד לכך, תאי גזע עובריים (ESCs), סוג אחר של תאי גזע pluripotent, נוצרים ממסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט 2-3. למרות מקורותיהם השונים, תאי iPS וESCs הם דומים בקיבולת בלתי מוגבלת שלהם לשכפל במבחנה וביכולתם להתמיין לכל סוג תא 4-5. מאפיינים אלו של תאי iPS להפוך אותם למועמדים אידיאליים עבור יישומים ברפואת רגנרטיבית אישית. מאמצי המחקר אחרונים מתמקדים בפיתוח פרוטוקולי בידול חזקים להפקת תאים בוגרים מיוחדים כוללים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) 6-11. עבור יישומים קליניים פוטנציאליים של תאי iPS נגזרים, בידול מכוון עבור אותו סוג תא מסוים הוא חיוני. ישנן שיטות שונותפורסם לבידול מכוון של שני תאי iPS ESCs ולרשתית שמשתנית מאוד ביעילות שלהם 6-7, 12-16. אנחנו עדיין לא יודעים שרבים מן האירועים המולקולריים הקובעים את גורל תא / רקמה במהלך פיתוח או בידול. בשנים האחרונות, נעשו מאמצים לפתח פרוטוקול הבידול שיכול לחקות ההתפתחות העוברית ככל האפשר. בשלב הבלסטוציסט, אוכלוסייה לא מחויבת של תאי גזע נמצא יחד במייקרו-סביבה תלת ממדים. אז, אסטרטגיות שונות יושמו על מנת להפוך את תאי ESC / iPS התאספו יחד ולגדל אותם בשלושה ממדים. אגרגטים של תאי גזע אלה נקראים גופי embryoid (EBS). מחקרים הראו כי ההבחנה EB של תאי גזע לחקות שלב המוקדם של התפתחות עובר ואופן ספונטני יכולה להצמיח האנדודרם פרימיטיווי על פני השטח החיצוניים שלה. מאוחר יותר, כפיתוח EB מתקדם, פנוטיפים תאים מובחנים של כל שלוש השושלות נבט מופיעים 17-18. הerefore, פרוטוקולי בידול המבוסס EBS משכו הרבה תשומת לב לבידול במבחנה של תאי ESC / iPS ומועמד טוב לדור הרשתית מתאי גזע pluripotent 13. EBS יכול להתבצע באמצעות מספר שיטות מESC תאים / iPS. בתחילה, EBS נעשה על ידי גירוד את מושבות חסיד ושמירתם בתרבות השעיה שאינה חסיד. עם זאת, גישה זו מניבה אוכלוסייה הטרוגנית של EBS שגורם לשחזור נמוך. תרבות תליית ירידת תא וmicrowell היווצרות EBS מבוססת טכניקות פופולריות אחרות להיווצרות EBS שיניבו EBS הומוגנית בגדלים מוגדרים, כי הם מאוד לשחזור. יתר על כן, טכניקת microwell יכולה להניב מספר רב של אגרגטים בפחות מאמץ. התמיינות של תאים בתוך EBS מוסדרת על ידי זמנית רמזי morphogenic ממייקרו-הסביבה התאית ו תאי. בניגוד לבידול ביום שניפורמט olayer, EBS לתת במה להרכבה מורכבת של תאים ואיתות בין תאית להתרחש 17. מעניין לציין, כי מספר תאי גזע pluripotent המשמשים לייצור EBS הבודד נצפה להשפיע על גורלם של תאים. לדוגמא, במחקר בידול hematopoietic של ESCs אדם, זה היה ציין כי 500 התאים EB קידמה בידול כלפי שושלת מיאלואידית ואילו 1,000 התאים EB דחפה כלפי שושלת erythroid 20. במחקר אחר, EBS הקטן העדיף בידול האנדודרם אילו EBS הגדול קידם לבידול נוירו-האאקטודרם 11, 17. המחקרים האחרונים ממליצים כי מספר תאי ESC / iPS המשמשים לייצור EBS הפרט להשפיע על EBS בידול המבוסס על כל סוגי תאים. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אין מחקרים הנוכחיים שהובהרו ההשפעה של גודל EBS בנטייה שלה כדי לבדל את כיוון הרשתית. מטרתו של מחקר זה היא לאפיין את ההשפעה שלגודל EB על גזע pluripotent מושרה תאים (iPS) - אפיתל הפיגמנט ברשתית בידול (iPS-RPE) ולזהות את המספר הסלולרי האופטימלי על מנת להפוך את EBS לבידול מכוון לשושלת הרשתית.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 מדיה + תוסף 5x</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (מעכב סלעים)</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>היקלון (פישר)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM מדיה</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N1</td><td>סיגמא</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>בקר עוברי </td><td>סרום היקלון (פישר)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>טריודו-L-תירונין נתרן&nbsp; מלח</td><td>סיגמא</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מלח חוצץ</td><td>היקלון (פישר)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 צלחת</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td> בינוניים <td>5893</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>Accutase</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD ערכת קיבוע/פרמיביליזציה ציטופיקס/ציטופרם BD</td><td>Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-PAX6</td><td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-RX נוגדן Abcam</td><td></td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>עכבר&nbsp; נוגדן נגד MITF</td><td>תרמו מדעי</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-ZO-1 נוגדן</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy פלוס מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR מאסטר מיקס</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>קיבולת גבוהה RNA ל-cDNA ערכת</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

תאים (ips) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (rpe) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי embryoid

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

לתאי גזע פלוריפוטנטיים יש את היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן ולהתמיין כמעט לכל סוג תא. בנוסף, פיתוח טכניקות לתכנות מחדש של תאים סומטיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) יצר עניין והתרגשות לקראת האפשרות של רפואה רגנרטיבית אישית מותאמת אישית. עם זאת, היעילות של התמיינות תאי גזע לקראת שושלת רצויה נותרה נמוכה. מטרת מחקר זה היא לתאר פרוטוקול להפקת אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) מתאי iPS (iPS-RPE) על ידי יישום גישת הנדסת רקמות ליצירת אוכלוסיות הומוגניות של גופים עובריים (EBs), מתווך נפוץ במהלך התמיינות במבחנה. הפרוטוקול מיישם היווצרות גודל ספציפי של EBs באמצעות טכנולוגיית לוחות מיקרובאר. מוסברות גם השיטות לזיהוי חלבונים וסמני גנים של RPE על ידי אימונוציטוכימיה ותגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך (RT-PCR). לבסוף, מתוארת יעילות ההתמיינות בגדלים שונים של EBs המנוטרים על ידי ניתוח מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) של סמני RPE. טכניקות אלה יקלו על התמיינות תאי iPS ל-RPE ליישומים עתידיים.

בניסוי זה, תאי iPS היו בתרבית ומובחנת לשושלת הרשתית מEBS. EBS בגדלים מבוקרים נוצר באמצעות צלחות microwell. כפי שניתן לראות באיור 1 EB ההיווצרות היה הומוגני בצלחות microwell. EBS אלה ולאחר מכן נאסף ומצופה על 6 צלחות היטב (איור 2). ניתן לזהות על ידי מורפולוגיה הרשתית, פיגמנטציה, וביטוי המשושה הקלסי של סמני הרשתית. לאחר 12 שבועות של תרבות, 200 התאים EBS פיתח astrocyte ומורפולוגיה פי...

מטרת דו&quot;ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים לגזור את האפיתל רשתית פיגמנט (RPE) מתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) באמצעות גדלים שונים של גופי embryoid.

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין את ההשפעה של גודל גוף העובר על התמיינות RPE מתאי IPS להכוונת התמיינות גוף העובר לעבר שושלת RPE. זה מושג על ידי שימוש ראשון בטכניקת המיקרווול ליצירת גופי עובר הומוגניים בגדלים מוגדרים. בשלב השני מתחילה התמיינות מכוונת של תאי ה- IPS לכיוון שושלת הרשתית, ואז תאי I-P-S-R-P-E מזוהים ומבודדים.בשלב האחרון, תאי I-P-S-R-P-E מועשרים ומורחבים. בסופו של דבר, ניתן לנתח את תאי I-P-S-R-P-E לביטוי שלהם של סמנים ספציפיים ל-I-P-S-R-P-E. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו התמיינות ספונטנית, הוא שהטכניקה שלנו מביאה ל-RP גבוה יותר. עניין זה יכול לעזור לייעל את ההתמיינות המכוונת של תאי IPS לכיוון שושלת RP.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות ניווניות ברשתית כגון ניוון מקולרי, דלקת רטיניטיס או מחלת סטארגארדט. מכיוון שהחלפת RPE חולה ב-RPE בריא שמקורו בתאי IPS עשויה להיות האפשרות הטובה ביותר למניעת אובדן ראייה, בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שתאי גזע עדינים מאוד ושינויים עדינים בידית שלהם יכולים להשפיע על תהליך ההתמיינות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלב קצירת גוף העובר ממקום המיקרוגל קשה.לפני הזריעה יש לחמם את תרבית תאי הגזע החופשיים של המזין ל-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לחמם במהירות את ה-IMR 90 מקף תאי IPS אחד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מופשרים, מוסיפים חמישה מיליליטר של תרבית תאי גזע חמים ללא מזין, בינוניים לתאים, טיפתיים ומערבבים בעדינות. לאחר מכן, סובבו את התאים ואז השעו בזהירות את גושי התאים בשני מיליליטר של תרבית תאי גזע ללא מזין.זרע בינוני את הגושים בבארות בודדות של צלחת מצופה מטריצה, ולאחר מכן הנח את התאים בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות ושינויים יומיומיים בינוניים. חמישה עד שבעה ימים לאחר מכן, התבונן במושבות הלא מובחנות עם מרכז צפוף המוכנות למעבר תחת מיקרוסקופ אור. כאשר התאים מוכנים, הוסף מיליגרם אחד למיליליטר של 37 מעלות צלזיוס שטח חם לכל באר ודגר את הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס למשך שבע דקות.לאחר מכן שאפו את חלל ה-DYS ושטפו בעדינות את מושבות התאים עם שני מיליליטר DM MF 12 חם מראש. פעמיים. לאחר השטיפה, הוסף שני מיליליטר של מדיום תרבית תאי גזע חופשי מזין לכל באר, והשתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לגרד בעדינות את המושבות, ולשחרר את גושי התאים.לאחר מכן העבירו את הגושים המנותקים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והוסיפו מספיק מדיום תרבית תאי גזע חופשי כדי לזרוע את המעבר הבא של התאים ליצירת גופי העוברים. ראשית, שטפו את תאי ה-IPS בשני מיליליטר DMMF 12 ולאחר מכן הוסיפו 750 מיקרוליטר אקוטן לכל באר של צלחת שש הבארות למשך חמש עד 10 דקות. באינקובטור תרבית תאים, כאשר התאים החלו להתנתק, השתמש בפיפטה כדי לפרק בעדינות את התאים לתרחיף תא בודד ולאחר מכן להעביר אותם לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.שוטפים את הצלחת עם חמישה מיליליטר DM MF 12, מאגדים את הכביסה עם התאים בצינור החרוטי. לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר גושי תאים שנותרו. כעת סובב את התאים כדי להסיר את האקוטן וההחייאה.השעו את הגלולה במדיום היווצרות גוף העובר ל-0.5 עד 1 כפול 10 לתאים השביעיים לריכוז מיליליטר. לאחר קביעת מספר התאים ברי קיימא על ידי אי הכללה של טריאן כחול, הוסף את מספר התאים המתאים לכל באר של צלחת מיקרו באר כדי ליצור את העובר הרצוי. מידות גוף.פיפטה בעדינות את התרביות כדי להקל על פיזור אחיד של התאים, ולאחר מכן התאם את מדיום היווצרות גוף העובר בתוספת מעכב סלע לנפח סופי של 2.0 מיליליטר. לאחר פיפטינג עדין יותר, סובב את תרביות תאי המיקרו באר ודגר את הצלחת בחממת תרבית תאים למשך 24 שעות. למחרת פיפטה מדיום למעלה ולמטה לכל מיקרו באר עם מיקרו פילטר אחד כדי לקצור את רוב גופי העובר ואז להעביר את תרחיף גוף העובר דרך מסננת תאים הפוכה של 40 מיקרומטר כדי להסיר תאים בודדים.לאחר מכן, שטפו את צלחת המיקרו חמש פעמים עם מיליליטר אחד של DMMF 12 כדי להסיר את שאר גופי העובר העוברים את השטיפות דרך המסננת. לאחר מכן הפוך את מסננת התאים בצלחת פטרי וסנן את גופי העובר שנאספו עם מדיום נוסף ליצירת גוף העובר. לאחר ספירת התאים שנאספו דוגרים על גופי העובר על מטריצת חלבון מצופה שש צלחות באר בפחות מ-1000 גופי עובר לבאר במדיום היווצרות גוף העובר, בתוספת 10 מעכבי סלע מיקרו-מולארי בחממת תרבית תאים למשך 24 שעות.לבסוף, החלף את מדיום היווצרות גוף העובר במדיום התמיינות כדי ליזום את ההתמיינות. איסוף דגימות ביום 6, 17, 29 ו-60 כדי לבצע את הניתוח המתאים במורד הזרם. לאחר 12 שבועות של תרבית, 200 גופי עוברי תאים מפתחים מורפולוגיה של אסטרוציטים ופיברובלסטים ללא פיגמנטציה נראית לעין, בעוד שגופי העובר הגדולים יותר מפתחים שכבה חד-שכבתית של מורפולוגיה ופיגמנטציה RPE קלאסית כפי שמודגם בתמונות אלה אימונוכימיה לאיתור סמני RPE, MITF ו-ZO אחד חושף את הביטוי המשותף של חלבונים אלה שמקורם ב-500 תאים ו-3000 גופי עובר תאים.בגרף זה, הסמן הנוירואקטודרמלי PAC 6 נמדד בגופי עוברים בגודל שונה בנקודות זמן שונות על ידי ציטומטריית זרימה. לדוגמה, ב-3000 גופי עובר תאים, כ-50% מהתאים שנותחו היו חיוביים ל-PAC 6 ביום השישי של התרבית. בנוסף, ניתוח פקס של סמן RPE MITF על גופי עוברים בגדלים שונים גילה כי 20% מהתאים ביטאו MITF ביום ה-60 של ההתמיינות.RPE מתורבת מאופיינים גם ביכולתם לאבד את הפיגמנט והמורפולוגיה המצולע שלהם ולקבל פנוטיפ פיברובלסטים על האריזה. לדוגמה, כאן מוצגים תאי מעבר חדשים שאיבדו את הפיגמנט שלהם וקיבלו מורפולוגיה של פיברובלסטים. תאים אלה מתרבים לאחר מכן, מחזירים את המורפולוגיה המצולעית הקלאסית שלהם במפגש, ותוך מספר שבועות חוזרים לפיגמנטציה שלהם.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לזהות ולבודד כראוי את מושבות ה-IPS RP לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע לחקור את ההתמיינות המכוונת לסוגי תאים בוגרים רבים על ידי חיקוי התפתחות אמבריולוגית תקינה. אל תשכח שעבודה ברקמות, מעבדות וירטואליות עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי השלכות, כגון לבישת מעילי רגליים, כפפות ומשקפיים תמיד צריכות להילקח בזמן ביצוע הליכים אלה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור גופי עובר הומוגניים בגודל הרצוי כדי לכוון את כריתת היערות לעבר I-P-S-R-P-E ולבודד ולהעשיר תאי RPE.

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

MicroRNA (מירנה) הפרופילים של גזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS), אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נגזרים מגזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS) (iPS-RPE), ורשתית של העובר, הושווה.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

תאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עשויים לשמש ליישומים מרובים, כולל טיפולים מבוססי תאים לניוון רשתית, מידול מחלות ומחקרי תרופות. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת RPE מתאי גזע.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתאי גזע pluripotent. השיטה משתמשת בשילוב של גורמי גדילה מולקולות קטנות כדי לכוון את הבידול בתאי גזע לתוך RPE ילדותי בעוד 14 ימים ו- RPE בוגרת, פונקציונלי לאחר שלושה חודשים.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להבדיל תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית תאי גזע pluripotent האנושי הנושאים מוטציות נגזר החולה. הקווים המוטנטים תא עשוי לשמש עבור ניתוחים פונקציונליים כולל immunoblotting, immunofluorescence, תיקון קלאמפ. גישה זו מחלה-ב--תבשיל עוקף את הקושי של השגת תאי RPE אדם מקורי.

בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות

הייצור של תאים ברשתית מתמחה מתאי גזע pluripotent היא נקודת מפנה בהתפתחות מבוססי תאי גזע טיפול למחלות רשתית. המאמר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לדור יעיל של organoids ברשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית למחקר בסיסי translational, קליניים.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.

יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

למדו לייצר אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) מתאי גזע iPS באמצעות טכניקת מיקרובארים ליצירת גופי עובר בגדלים מוגדרים. שיטה זו משפרת את יעילות ההתמיינות לקו התאים הרשתי ומספקת כלי חשוב למחקר רפואי רגנרטיבי של מחלות רשתית.

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

גלה סרטונים נוספים