Name: איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: חקור פרוטוקול לאיתור תאי B מייצרי IgE בעכבר באמצעות טיפול בטריפסין וצביעה תוך-תאית. השיטה מאפשרת זיהוי מדויק של תאים המביעים IgE אמיתי באמצעות ציטומטריית זרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DRW נתמך על ידי מענקי NIH AI089972 וAI113217, ועל ידי הרירי אימונולוגיה מחקרי צוות, ופרס קריירה עבור מדענים רפואיים מWellcome בורוז הקרן מחזיק.

הערה: כל הניסויים שתוארו כאן היו בהתאם להנחיות ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) ואושרה על ידי בית החולים לבעלי חיים למחקר לילדים (קשת), בוסטון, מסצ&#39;וסטס. 1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורסת 1,000x IL-4: מדוללים ציטוקינים IL-4 עד 20 מיקרוגרם / מיליליטר בH 2 O או 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA). לוותר ב200 aliquots μl 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge וחנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1,000x אנטי CD40: השג מהיצרן ברמה של 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר, חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת גירוי תא B: כדי 425 מיליליטר של מדיום RPMI-1640, להוסיף 75 מיליליטר של סרום עגל עוברי מופשר טרי (FCS), 10 מיליליטר של 1.0 חיץ M HEPES, מניית L-גלוטמין 5 מיליליטר, 5 מיליליטר פניצילין: מניית סטרפטומיצין, 5 חומצות אמינו μl מיליליטר מינימאלי חיוני בינוני שאינו חיוני (MEM-NEAA), ו -3.5 של 2-mercaptoethanol. שמור תקשורת ב 4 C עד שבוע. הוספת IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) מייד לפני השימושרק להיקף המדיה הדרושה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% FCS-FACS מאגר: הוסף 10 מיליליטר של FCS ל -490 מיליליטר של 1x PBS. לשמור על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2x טריפסין-EDTA: לדלל 5 מיליליטר של 10x פתרון טריפסין-EDTA מניות (טריפסין 5.0 גר &#39;, EDTA 2.0 גר&#39; לכל ליטר) ב 20 מיליליטר של 1x PBS. חנות טריפסין-EDTA ב2x עובד aliquots ב 4 מעלות צלזיוס. לאפשר כדי לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עגל בסרום עוברי: שמור FCS המופשר ב 4 C עד שבועיים. מניחים על קרח 15 דקות לפני ההליך מכתים cytoplasmic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורמלין שנאגרו ניטראלי: הכן פתרון 10% פורמלין (paraformaldehyde 3.7%). פורמלין הוא רעיל ולכן להתמודד עם זה מתחת למכסת מנוע קטר מעבדה כשהוא לבוש PPE המתאים. פורמלין לאחסן בטמפרטורת חדר בארון אחסון כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנול: מתנול החנות המוחלט (100%) ב -20 ° C עד שהתאים מוכנים להיות permeabilized. הערה מתנול שהוא דליק וצריך להיות מאוחסן במקפיא מתאים. </li></ol> 2.טיהור והפעלה של תאי B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטחול עכבר טרי שנקטפו, להכין השעיה תא בודדת על ידי הלחיצה בעדינות את האיבר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר עם הבוכנה של מזרק 3 מיליליטר. בצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר, לאסוף תאים ב 10 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את גלולה supernatant וגלול ב 1 מיליליטר של תאי דם אדומים lysing הצפת למשך 5 דקות. לנטרל עם 13.5 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגנטי נפרד (אופציונאלי) תאי B באמצעות אנטי CD45R (B220), שכותרת חרוזים, בעקבות פרוטוקול טיהור MACS לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר תאי B מטוהרים ברמה של 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת גירוי תא B חימם המכילה IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 5 ימים על 37 מעלות צלזיוס. התחל עם 8 מיליליטר של התרבות מחולק ל 2 בארות של צלחת תרבות 6 היטב (4 מיליליטר כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק cultuמחדש מדי יום כדי לשמור על 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר. התאם את הריכוז על ידי פיצול לתוך בארות אחרות ודילול התרבות עם תקשורת גירוי B תא המכילה IL-4 הטרי ואנטי-CD40. </li></ol> 3. trypsinization, קיבוע, וpermeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עד 1.0 x 10 7 של תאים בתרבית בצינור חרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, ולמזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 10 מיליליטר של PBS להסיר את החלבון שיורית מתקשורת אוסף תא. חזור על שלב צנטריפוגה ולמזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בהיקף הנותרת לאחר decanting (כ -100 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 800 μl של טמפרטורת חדר 0.1% (2x) טריפסין-EDTA לתאים. לוותר לאט בזווית של 45 מעלות כלפי מטה בצד של צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצינור ומערבבים בעדינות על ידי הטיית הצינור כך הנוזל פועל לאורכו של זמן צינור 5-6s. משקע סיבי, לבן עלול להיווצר בפתרון. הגבל את זמן trypsinization לתחת דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תגובת trypsinization עם 1 מיליליטר של FCS הקר. לדלל את FCS מייד על ידי הוספת 10 מיליליטר של PBS הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, אז למזוג supernatant ולהחזיר את הצינורות לקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בהיקף הנותרת לאחר decanting. במידת צורך, להביא נפח עד עם PBS הקר 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף, להוסיף 800 μl של 10% פתרון ניטראלי שנאגרו פורמלין לתאים וpipet למעלה ולמטה. הצינור יחמם על התוספת של פורמלין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מיקסר מערבולת benchtop במהירות רועדת עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר 9 מיליליטר של (-20 ° C) מתנול הקר לpipet סרולוגיות 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הצינור המכיל את התאים על פני מיקסר המערבולת בעדינות להתחיל שקיןg התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מתנול קר לצינור, כך שהוא נופל dropwise על גבי התאים תוך הצינור עדיין רעד כל כך שמתנול הוא הערבוב ברציפות. לאחר 2 מיליליטר הראשון של מתנול מהירות מחלק יכולה להיות מוגברת לזרם איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הצינור לשבת על קרח למשך 30 דקות כדי להשלים את permeabilization. לחלופין, ניתן לאחסן את התאים ב -20 ° C עד חודש. </li></ol></li></ol> 4. הקרינה מכתים לIgG1 ומיתוג IgE כיתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ולמזוג את פתרון מתנול. משקע לבן עשוי גלולה עם התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של בטמפרטורת חדר 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות כדי לשטוף את התאים. חזור פעם אחת. הערה: כביסה גלולה עם טמפרטורת חדר PBS מתמוססת משקע נוסף שעלולות להיווצר לאחר שלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שטיפה נוספת עם 10 מיליליטר של 2% חיץ FCS-FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ דוגמאות ל96-גם סיבוב צלחת תחתונהו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. למזוג supernatant ולשים את הצלחת על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ב -60 μl של 2% חיץ FCS-FACS לכל גם עם דילולים הנוגדן הבאים: Anti-IgM הרשתית / Cy7, 1: 200, Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות של מכתים, לשטוף את הצלחת עם 150 μl של 2% חיץ FCS-FACS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב400 μl של 2% חיץ FCS-FACS וpipet דרך מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS 5 מיליליטר. </li></ol> 5. השתמש באסטרטגית gating בעקבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד CD45R (B220) תאים חיוביים מאוכלוסיית הלימפוציטים פיצוץ ממוקמת על חלקת FSC / SSC (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהתאים החיוביים B220, להשתמש בעלילת IgE וIgG1 לחשוף האוכלוסיות המתאימות. </li></ol>

<ol><li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li>
<li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+allergy+and+asthma+today%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li>
<li>Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).</li>
<li>Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+aberrant+IgE+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with aberrant IgE production.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).</li>
<li>Bacharier, L. B., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+IgE+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of IgE regulation.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).</li>
<li>Yokota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+species+of+human+Fc+epsilon+receptor+II+%28Fc+epsilon+RII%2FCD23%29%3A+tissue-specific+and+IL-4-specific+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression.</a> Cell. 55 (4), 611-618 (1988).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+class+switch+recombination+in+the+absence+of+both+Ku70+and+DNA+ligase+4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptors+as+regulators+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptors as regulators of immune responses.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+mediates+productive+and+mutagenic+DNA+repair+through+distinct+phosphoprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions.</a> Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).</li>
<li>Wesemann, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li>
<li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S%C2%B5+to+S%CE%B5+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li>
<li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li>
<li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University.+Science.+B%22%5BJournal%5D)">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).</li>
<li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).</li>
<li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+MD.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li>
<li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li>
<li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li>
<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
<li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li>
</ol>

למחברים אין גילוי נאות.

גירוי של תאי B טחול עכבר בתרבות עם אנטי CD40 וIL-4 יהיה לדמות סוג T מסייע 2 (T H 2) אינטראקציות, מיתוג כיתה מעודד לIgG1 וIgE 5. תאי B יכולים להיות מופעלים על אחריות חברתית בהקשר של splenocytes הכולל של 12 או תאי B טחול מטוהרים 11. כפי שצוין בפרוטוקול (שלב 2.3), העשרת תאי B היא אופציונלית, ונתונה לשיקול דעתו של הנסיין כדי לקבוע אם הוא היית מועיל. הפרדה מגנטית חיובית של תאי B באמצעות CD45R (B220), שכותרת חרוזים מנוצלים כאן. לאחר הפרדה, מומ...

במהלך שרשרת כבדה רקומבינציה אימונוגלובולינים (IGH) מתג כיתה (CSR) בעכברים ובבני אדם, IGH μ אקסונים קבועים אזור (Cμ) יימחקו ויוחלפו על ידי אחד מכמה סטים של אקסונים אזור קבועים במורד הזרם (ים H C) (למשל Cγ, Cε, וCα), וכתוצאה מכך מתג מייצור IgM לייצור של מעמדות אחרות איג (למשל IgG, IgE, או IgA). CSR מתרחש בתוך אזורי מתג (S), שהם 1-10 רצפי kb ממוקמים 5 &#39;לכל קבוצה של C H של 1. אנזים ההפעלה-induced Cytidine deaminase (AID) יוזם אחריות חברתית באמצעות פעילות דיאמינציה cytidine. IgE הוא מתווך עיקרי של מחלה אלרגית 2 והבנה טובה יותר של איך IgE מיוצר ומוסדר עשוי לפתוח דלתות לגישות טיפוליות חדשות למחלה אטופית. בעכברים ובבני אדם, IgE הוא אלוטיפ איג המוסדר ביותר בחוזקה. IgE בדרך כלל מתגלה באלפי רמות של times פחות מIGH האחר isotypes 3, אבל יכול להיות מורמים מאוד במצבי מחלה 4. עם זאת, אחריות חברתית לIgE הוא הבין באופן חלקי. הפעלה במבחנה של תאי B באמצעות IL-4 בשילוב עם שני אנטי CD40 או LPS, גורם לשני CSR IgG1 וIgE 5. תאי B מופעלים לבטא את קולט הנמוך זיקת IgE FcεRII / CD23 2,6, אשר נקשר IgE המסיס מופרש בתרבות לאחר CSR. לכן בעת ניתוח עם זרימת cytometry, תאי B עם כתם IgE-מחויב קולט בדומה לתאי B אופן אנדוגני להביע 7 IgE. אמנם ידוע כי B עכבר תאים לבטא את הזיקה הנמוכה IgG קולט FcγRIIB1 (CD32) 8, בניסיון שלנו זה לא מופיע להפריע למדידה של מיתוג בכיתה לIgG1. עם זאת, בעת מדידת מיתוג IgE לאחר הפעלת תא B בתרבות, IgE מחויב-פני השטח ספציפיים עלול לטשטש את הניתוח. עם שיטות צביעה משותפות, תאים שאינם IgE להביע להכתים חיובי עבור IgE. מתואר כאן היא אסטרטגיה שנוצלה לביצוע מבחני אחריות חברתית ולזהות תאי B להביע IgE אמיתיים מעכברים 9-11. טיפול בתאי B מופעלים עם טריפסין, מגיב מעבדה משותפת לעיכול חלבון, מסיר משטח מחויב שני cytophylic וקרום IgE. permeabilization לאחר והצביעה לIgE cytoplasmic כך חושפים את התאים מייצרי IgE האמיתיים.

<table><tbody><tr><td>נגד עכבר IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>שיבוט 553415</td><td>R35-72</td></tr><tr><td>עכברוש נגד עכבר IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>שיבוט 550083</td><td>A85-1</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>שמור על -20 &deg; </td></tr><tr><td>מסננת תאי פלקון C 40 ומיקרו; m ניילון</td><td>קורנינג</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאי פלקון 70 ומיקרו; m קורנינג ניילון</td><td></td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu / Mo CD45R (B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>שיבוט RA3-6B2</td></tr><tr><td>נגד עכבר/חולדה CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>שיבוט HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI בינוני 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) מיקרו-חרוזים&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>עמודת טיהור MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Reconstruct במים או 0.1% תמיסת פורמלין BSA</td></tr><tr><td>, חוצץ ניטרלי, 10%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 מ"ל</td><td>5.0 גרם טריפסין, 2.0 גרם EDTA&#8226; 4 Na לליטר של 0.9%</td></tr><tr><td>NaCl פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P0781-100 מ"ל</td><td>10,000 U פניצילין; 10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין (100x)</td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול (99%)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M6250-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה של תאים אדומים</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש נגד עכבר IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>שיבוט 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone סרום עגל עוברי תרמו</td><td></td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>תאי B מדיה לגירוי</td><td></td><td></td><td>תאי B מדיה לגירוי תאי B מורכבת מ-RPMI עם סרום עגל עוברי (15%), 20 מ"מ HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 מ"מ L-גלוטמין, &nbsp; 1x פניצילין-סטרפטומיצין (פניצילין: 100 U/ml, סטרפטומיצין: 100 ומיקרו; גרם/מ"ל), בטא-מרקפטואתנול (7 ומיקרו; ליטר/ליטר), IL-4 (20 ננוגרם/מ"ל) ואנטי-CD40 (1 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td></tr></tbody></table>

איתור של true ige להביע תאי lineage העכבר b

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

שרשרת כבדה (IGH) רקומבינציה אימונוגלובולין הלימפוציטים B מתג כיתה (CSR) היא תהליך שבו הביע תחילה IgM עובר לisotypes IGH האחר, כגון IgA, IgE וIgG. מדידה של IGH CSR במבחנה היא שיטת מפתח למחקר של מספר תהליכים הביולוגיים הנעים בין רקומבינציה DNA ותיקון להיבטים של אימונולוגיה מולקולרית ותאית. Assay במבחנה CSR כרוך ביטוי איג משטח מדידת הזרימה cytometric על תאי B מופעלים. בעוד מדידת subclasses IgA וIgG היא פשוטה, המדידה של IgE בשיטה זו היא בעייתית בשל IgE המסיס מחייב FcεRII / CD23 הביע על פני השטח של תאי B מופעלים. כאן אנו מתארים הליך ייחודי למדידה מדויקת של IgE-ייצור B עכבר תאים שעברו אחריות חברתית בתרבות. השיטה מבוססת על מחשוף בתיווך טריפסין של מתחמי IgE-CD23 על משטחי תא, ומאפשרת לגילוי של IgE-ייצור תאי B שושלת ידי CYצביעת toplasmic. הליך זה מציע פתרון נוח לניתוח הזרימה cytometric של CSR לIgE.

הליך זה יושם בהצלחה ללמוד CSR לIgE בB עכבר תאים. כדי להדגים את היעילות במדידת CSR, אנחנו מגורה תאי B טחול עכבר עם אנטי CD40 וIL-4 כפי שתואר לעיל 11. לאחר חמישה ימים של גירוי, תאים נאספו ועובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל ומוכתם עם fluorescently שכותרתו IgM, IgG1, IgE, וB220 נוגדנים (CD45R). מגודר על לימפוציטים מסוג פיצוץ (איור 1), אוכלוסייה ברורה של IgE + תאים לא יכול להיות מופלה בצורה נקיה ללא טיפול טריפסין (איור 2 א). עם זאת, trypsin...

ניתוח במבחנה של רקומבינציה של מתג מחלקה בעכברים הוא מאתגר עקב מולקולות IgE ציטופיליות הקשורות לקולטני Fc על פני תאי B. אנו מתארים שיטה לזיהוי IgE באמצעות מחשוף בתיווך טריפסין של IgE קשור לפני השטח לפני קיבוע וחדירות לצביעה פלואורסצנטית ציטופלזמית.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להבחין בין תאי IgE אמיתיים המבטאים תאי B לבין תאי B, המבטאים איזוטיפים אחרים של IgE המופרשים IgE. במהלך מבחני מיתוג מחלקה במבחנה נקשרים לחלבוני פני השטח של תאי B, מה שמטשטש את היכולת למדוד מעבר מחלקה ל-IgE. המטרה מושגת על ידי הסרת מולקולות IgE הקשורות לקולטן לפני הניתוח על ידי שימוש בטריפסין, שאינו מבקע באופן ספציפי חלבונים על פני התא תוך השארת מולקולות אימונוגלובולין תוך-תאיות המיוצרות באופן אנדוגני שלמות.שנית, חלבונים תוך-תאיים נחשפים על ידי קיבוע תאי B בפורמין וחלחל לתאים במתנול. לאחר מכן, התאים מוכתמים בנוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית כדי לחשוף אימונוגלובולינים תוך תאיים. התוצאות מראות אוכלוסיית תאי B חיוביים ל-IgE.אם נעשה שימוש בטריפסין על סמך ניתוח זרימה ציטומטרית, מחקרים בביולוגיה של IgE הוגבלו בשל הקושי לזהות תאים המייצרים IgE. שיטה זו מספקת פתרון נגיש שמעבדות יכולות לאמץ בקלות כדי להאיץ את ההבנה שלנו של מולקולה מעניינת זו. טכניקה זו מועילה על פני השיטות הקיימות לביטול ההשפעה של IgE הקשור לקולטן.לדוגמה, זה פחות יקר מחסימת IgE על פני השטח עם נוגדנים נגד IgE וסלחני יותר מטיפול שטיפת חומצה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לניתוח מחלקת תאי B של עכברים, מעבר לטיפול ב-IgE עם טריפסין לפני צביעת עובדה יכול להיות מיושם גם על פרוטוקולים אחרים הדורשים הסרה של חלבונים על פני השטח מטחול עכבר שזה עתה נקטף. הכן תרחיף תא יחיד.לחץ בעדינות על האיבר דרך מסננת תאים של 70 מיקרון באמצעות הבוכנה של מזרק של שלושה מיליליטר. אסוף את התאים בצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של XPBS אחד. תאי הצנטריפוגה הבאים ב -300 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.יש להסיר את הסופרה נטנט ולהשעות את הכדור במיליליטר אחד של מאגר כדוריות דם אדומות. הניחו לתגובת הליזינג למשך חמש דקות לפני שנטרלו אותה עם 13.5 מיליליטר של XPBS אחד. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים שוב ב-300 Gs למשך חמש דקות והשעיה מחדש של הגלולה בנפח השיורי.כעת הוסף לתאים מדיה חמה לגירוי תאי B המכילה IL 4 ואנטי CD 40. התחל בתרבית של שמונה מיליליטר המחולקת לשתי בארות של צלחת תרבית של שש בארות ועורר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים. בדוק את התרבית מדי יום כדי לשמור על התאים במיליון למיליליטר.התאם ריכוז על ידי פיצול התרביות לבארות אחרות ודילול בגירוי תאי B. מדיה המכילה IL 4 טרי ואנטי CD 40. התחל באיסוף של עד 10 מיליון מתאי B מגורים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר.לאחר מכן צנטריפוגה אותם ב-300 גרם למשך חמש דקות ושפכו את הסופרנטנט כדי להסיר את החלבון הנותר ממצע איסוף התאים. שטפו את תאי B עם 10 מיליליטר PBS ואחריו צנטריפוגה נוספת ודיקנטציה של החטיפה לאחר הניקוי, השעו מחדש את כדור התא בנפח שיורי של כ-100 מיקרוליטר והוסיפו בזהירות 800 מיקרוליטר של טמפרטורת החדר 0.1% נסיעות ב-EDTA. הוסף את התמיסה לאט לאורך דופן הצינור.הוסף שיפוע, ואז כסה את הצינור וערבב אותו בעדינות והעביר את הנוזל לאורך הצינור. חמש או שש פעמים עלול להיווצר משקע לבן חוטי בתמיסה תוך דקה אחת. להרוות את התגובה עם מיליליטר אחד של FCS קר.שמור את התאים על קרח. כעת הם עדיין חיים ויכולים לבטא חלבונים חדשים על פני השטח. יש לדלל מיד את ה-FCS על ידי הוספת 10 מיליליטר PBS קר.הסר כל פסולת צפה בעזרת פיפטה. סובב את התאים בארבע מעלות צלזיוס. שפכו מיד את החטיפה והשעו מחדש את התאים בנפח השיורי.במידת הצורך, הביאו את הנפח עד 100 מיקרוליטר עם PBS קר מתקדם במהירות במכסה אדים ב 800 מיקרוליטר של 10% פיפטת פורמין ניטרלית התערובת למעלה ולמטה הצינור יתחיל להתחמם לאחר הערבוב דגירה של התאים בקיבוע למשך 10 דקות ב -37 מעלות צלזיוס. בינתיים, הקימו מערבל מערבולת ספסל במהירות טלטול עדינה והכינו מתנול מצנן למינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש. כאשר התאים מסיימים את הדגירה.שאבו תשעה מיליליטר מתנול לתוך פיפטה סרולוגית. לאחר מכן ללא כיסוי מערבל בעדינות את הצינור תוך הוספת המתנול טיפה. לאחר חלוקת שני מיליליטר מתנול במהירות טיפתית עד לזרם איטי.עכשיו תנו לצינור לשבת על קרח במשך 30 דקות כדי לחלחל לתאים. לחלופין, ניתן לאחסן את התאים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד חודש. התחל את הליך הצביעה על ידי צנטריפוגה ראשונה של תאי הסלסול וניקוי המתנול.משקע לבן עשוי להתגלגל עם התאים. לאחר מכן שטפו את התאים על ידי ערבוב של 10 מיליליטר טמפרטורת החדר צנטריפוגה וניקוי XPBS אחד. בצע את שלב הכביסה הזה פעמיים.לאחר מכן, בצע שטיפה נוספת עם 10 מיליליטר של פקס 2% FCS, חוצץ והשעה. הגלולה בנפח השיורי ממשיכה על ידי העמסת הדגימה לבאר אחת של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות. דגימות רבות מעובדות בדרך כלל במקביל.טען 20 עד 50 מיקרוליטר באמצעות צנטריפוגה של ספינר צלחת את התאים ב-300 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן שפכו את החטיפה והניחו את הצלחת על קרח. כעת צבעו את התאים לכל באר והוסיפו 60 מיקרוליטר של מאגר פקס 2% FCS המכיל ארבעה נוגדנים שונים.תן לתאים לדגור בכתם במשך חמש דקות לאחר הכתם. שטפו את התאים על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של פרוות חיץ פקס 2% FCS. לאחר מכן צנטריפוגה של הצלחת כמו קודם, ואחריה סילוק התמיסה והחייאת התאים.השתמש ב-400 מיקרוליטר של מאגר פקס 2% FCS. כעת הכניסו את התאים דרך מסננת תאי ניילון של 40 מיקרון לתוך צינור פקס של חמישה מיליליטר לשער הפקס. התאים על ידי בידוד תאים חיוביים CD 45 R, הידועים גם בשם B, שני תאים חיוביים 20 מאוכלוסיית הלימפוציטים המתפוצצים בחלקת F-S-C-S-S-C, ולאחר מכן מ-B שני תאים חיוביים 20.השתמש בתרשים IgE ו-IgG אחד כדי לחשוף את האוכלוסיות המתאימות באמצעות הליך זה. רקומבינציה של מתג מחלקה ל-IgE נחקרה בתאי B של עכבר באמצעות אסטרטגיית שער המבוססת על לימפוציטים מפוצצים. אוכלוסייה ברורה של תאים חיוביים ל-IgE לא הייתה יכולה להיות מובחנת בצורה נקייה ללא הטריפסין של התאים טריפסין לפני הקיבוע והחדירה אפשרו הפרדה של התאים המייצרים IgE עקב הסרת IgE קשור לפני השטח לאחר השליטה.טכניקת צביעה זו יכולה להיעשות תוך כשעה אם היא מבוצעת כראוי. עבודה עם פורמלין ומתנול עלולה להיות מסוכנת. לכן, תמיד יש להשתמש בפומה ולהשתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה.

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הליך זה מתאר את זיהוי ובידוד של לויקוציטים עכבר TH17 כי להפריש באופן פעיל IL-17 על גירוי.

זיהוי ובידוד של Viable IL-17-מפריש תאים עכבר T

Herpetiformis דרמטיטיס (DH) היא מחלה דלקתית כרונית המאופיינת תגובה אוטואימונית בין IgA ו אפידרמיס transglutaminase (eTG). ד"ה מפתחת בחלק קטן מאוד של חולים הרגישים לגלוטן ו / או צליאק. תוצאות המחקר הזה מצביעים על כך ד"ה יכול גם להתפתח לארח רזוס קוף עם סימפטומים של אטופיק idiopatic.

הכרה Transglutaminase עוריות על ידי IgA ו Transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס

סרטון זה מדגים שיטת הדמיה להמחשת אינטרפרון-גמא באתרו (IFN-γ) בטחול העכבר. בעקבות זיהום חיידקי והשראת הצטברות IFN-γ בתוך תאי T ותאי הרג טבעיים, הטחול נקצר מהעכבר. עם קבלת קטעי רקמות, immunostaining מבוצע כדי לדמיין IFN-γ בתוך התאים.

בדיקה לזיהוי הפרשת אינטרפרון-גמא באיברי הלימפה של מורין

אנו מתארים כאן מודל של עכבר מדווח טרנסגני כדי לדמיין את התאים המייצרים IL-22 בתוך רקמות עכבר שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר מיקומם של ציטוקינים אחרים או חלבוני מזכיר בעכבר.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול לאפיין תלויי-T ו- T-עצמאית אימונוגלובולינים (Ig) תגובות isotype בעכברים באמצעות אליסה. בשיטה זו נעשה שימוש לבד או בשילוב עם זרימה cytometry יאפשר לחוקרים לזהות הבדלים בתגובות isotype איג B תאית בעכברים בעקבות חיסון אנטיגן תלויי-T ו- T-עצמאית.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

במחקר זה, אנו מציגים הרומן ונוהל יעיל הבידוד של לימפוציטים מ טלאים של פייה (PPs), בו ניתן להשתמש לאחר מכן ב- vivo ו- in vitro לקשרי מבחני פונקציונלי, כמו גם מחקרים cytometric זרימה של הזקיקים T עוזר, מרכז נבטי B תאים.

שחקני המפתח unraveling Humoral חסינות: מתקדם וממוטב לימפוציט בידוד פרוטוקול טלאים מאתר של Peyer

כאן, אנו מתארים מיקוד פשוט שיטה הדמיה כדי להמחיש את הלוקליזציה באתרו של תאים הפרשה את ציטוקינים אינטרפרון גמא באיברי הלימפה משני מוראין. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור ויזואליזציה של ציטוקינים אחרים ברקמות שונות.

הדמיה של אינטרפרון באתרו הפקת גמא בטחול העכבר בעקבות זיהום יסטריה חיידקי

אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.

אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

מאמר זה מתאר פרוטוקולים של הערכת תגובת Tfh ו- GC B במודל העכבר של זיהום וירוס שפעת.

הערכה של תאי עוזר T זקיקים ותגובת מרכז חיידקים במהלך שפעת זיהום וירוס בעכברים

תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 (ILC2s), המעורבים בדלקת מסוג 2, משתתפים בעיקר בתגובה לזיהום הלמינת'ס, מחלות אלרגיות, הומאוסטזיס מטבולי ותיקון רקמות. במחקר זה מודגם הליך לבידוד ILC2s מרירית האף וזיהוי הביטוי של CD226.

בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226

חקור פרוטוקול לאיתור תאי B מייצרי IgE בעכבר באמצעות טיפול בטריפסין וצביעה תוך-תאית. השיטה מאפשרת זיהוי מדויק של תאים המביעים IgE אמיתי באמצעות ציטומטריית זרימה.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

גלה סרטונים נוספים