Name: אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: למד לבנות צינורית זכוכית לשימוש כפול: הזרקת תרופות לבלימת מבנים עמוקים במוח ורישום פעילות עצבית בו זמנית בעכברוש. שיטה זו מאפשרת מחקר יעיל בנוירופיזיולוגיה ובנוירופרמקולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי מענקים מ-CIHR (MOP231122) ו-NSERC (RGPIN-2014-06503). אנו רוצים להודות לז'נבייב סיר על עזרתה בהכנת ניסויים ובפיקוח על עבודת מעבדה. MAL קיבלה מלגה ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC).

הערה: כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית להגנה על בעלי חיים והמועצה לביקורת האתיקה של אוניברסיטת מונטריאול. 1. אסיפה של פיפטה הקלטת ההזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימים כ 7 סנטימטר ארוכות זכוכית (קוטר חיצוני 1 מ&quot;מ) באמצעות חולץ פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את הקצה של הנימים ולבדוק את הצמצם תחת מיקרוסקופ אור. ודא שהקוטר הפנימי הוא בין 30 מיקרומטר עד 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס חוט כסף ארוך 7 סנטימטרים לתוך נימי זכוכית עם כ 1 סנטימטר הבולט מהקצה הלא המחודד של פיפטה הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכופף את החוט העודף orthogonally לנימי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפה של דבק פלסטי גמיש בפיר של מחט מזרק 30 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מזרק 30 G בפיפטה הזכוכית לפי השרטוטים מוצגים באיור 1 </strong&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ציפוי שני של דבק על מנת להבטיח חותם ראוי מהצומת בין פיפטה הזכוכית והמזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את פיפטה לייבוש עם הקצה פונה כלפי מעלה לכ -12 שעות על מנת להבטיח ריפוי תקין של הדבק. התוצאה המוגמרת מוצגת באיור 2. </li></ol> הערה: הליך זה נעשה על ניסויים ועיקור של קצה פיפטה חריפים לא נדרשה. 2. הכנת בעלי החיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה בתיבת הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להרדמה באמצעות isoflurane 4% במשך 5 עד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה על שולחן stereotaxic עם כרית חימום ובדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס. השתמש חרטום כדי לשמור על הרדמה עם isoflurane 2%. Secure ראשו של העכברוש באמצעות מוטות אוזן ובעל שיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפות משחה או עין עיניים, הכוללות% 1 אטרופין טיפות כדי לסייע בהרחבת אישון. כדי למנוע יובש, תחול ירידת הסיכהזה בערך כל 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הראש ולנקות אותו עם 10% povidone- יוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדמה מקומית, להזריק 0.5 מיליליטר של לידוקאין 2% מתחת לקרקפת במקומות 2-3 על ידי הרמת העור והחדרת קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר רמה נאותה של הרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן והתבוננות חוסר התנועה. בנוסף, לפקח על קצב הלב כדי לוודא שהוא נמצא בערכים נורמלים (300 עד 400 פעימות / דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הקרקפת בקו ישר לאורך החציון עם להב 10 אזמל # לחשוף שני תפרי עטרה ועל sagittal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הנקודות למבדה וגבחת על ידי לחיצה בצד את הרקמה שמכסה את הגולגולת עם מרית כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמת הגולגולת כך שעמדות גבחת וLambda נמצאות על אותו המישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את נקודת ההתייחסות, להשתמש בהתקן stereotaxic עם שפופרת זכוכית רכובה להגדיר אותו ממש מעל גבחת. זה יהיה &quot;אפס&quot; ולAntero-אחורי medמדידות ial-רוחב קואורדינטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את נקודת העניין על ידי הזזת stereotaxic הר לקואורדינטות הנדרשות, לציין את קואורדינטות stereotaxic ולצייר ריבוע מסביב לאזור היעד שמסמן בי craniotomy יבוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תרגיל כירורגית עם תרגיל מעוקר לאורך הכיכר המסומנת לאט בלי לחץ כדי להסיר את חומר העצם לאט. היזהר שלא לקדוח יותר מדי זמן באותו האזור, כפי שהוא יפיק חום ולגרום לנגעים בקליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עצם תיחום craniotomy הפך דק מספיק, להסיר בזהירות את סעיף הגולגולת עם פינצטה כדי לחשוף את הקליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות להשקות את הקליפה החשופה עם נוזל השדרה מוחין מלאכותי כדי למנוע התייבשות רקמה. הערה: הסרת מאטר דורה היא מיותרת על העכברוש כמו הקצה של injectrode הוא יציב מספיק כדי לחדור. </li></ol> 3. מילוי והרכבה של מערכת ההזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא5-10 microsyringe μl על ידי שאיפה עם שמן מינרלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המזרק עם פיפטה הזכוכית קבועה עם תמיסה של 0.5% שמיים כחולים שיקגו (CSB) וחומצת 300 מיקרומטר γ-aminobutyric (GABA) או פתרון של לידוקאין 2% עם 0.5% 9 CSB. לדלל את כל הפתרונות עם מי מלח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של חומר בשפע, למלא באמצעות מזרק רגיל ולהשתמש בטכניקות הזהירות הרגילות, כדי למנוע ההיווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של חומרים יקרים יותר, להשתמש בשמן מינרלים כדי למלא את injectrode והסוכן הכימי אז יכול להיות שהוצג על ידי שאיפה. כהפרש בין צפיפות נפט ומים מינרליים הוא יחסית גבוה, חומר זה הוא מועמד טוב להזרקה של תמיסות מימיות. הערה: צבע ניתן להוסיף כדי לאשר את ההפרדה בין שני הנוזלים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למלא את פיפטה ההזרקה, למלא מזרק 1 מיליליטר עם הפתרון על ידי שאיפה ולאחר מכן להזריק את הפתרון לאטלפיפטה ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב זהיר להדלפות באזורים שצוינו באיור 1 על ידי שטיפת אזורים אלה נקיים והתבוננות דליפות על ידי הזרקת הפתרון לאט עם המזרק נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מזרק 1 מיליליטר. כאשר עושים זאת, כדי להיות בטוח לשמור על לחץ קל על הבוכנה כך שהוואקום אינו מסיר את הפתרון מפיפטה ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את microsyringe עם שמן מינרלים על ידי שאיפה ולצרף אותו בחוזקה לפיפטה ההזרקה המלא, ולאחר מכן לנגב בזהירות כל פתרון עודף מinjectrode התאסף עם גזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהקצה אינו חסום על ידי הזרקת נפח קטן מאוד, מספיק לראות טיפה קטנה ויוצרת בקצה של פיפטה הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר injectrode על מערכת micropump ולוודא שהוא קבוע גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם בזהירות את קצה injectrode בקואורדינטות היעד ולהוריד את הקצה אל פני השטח של קליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוריד את injectrשיר הלל באמצעות המנגנון stereotaxic למבנה היעד (colliculus מעולה במקרה זה) באמצעות קואורדינטות אנטומי המתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הקליפה החשופה עם אגר חם כדי למנוע התייבשות רקמה. </li></ol> 4. הזרקה ואיון הפיך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת microinjection להזריק 400 עד 800 NL ב 40 / הפעלת דקות ועיתונות NL להתחיל ההזרקה. שים לב ששיעור ספייק יציג ירידה בהזרקה. הערה: בהגדרת הניסוי, פעילות עצבית התאוששה תוך שעה לאחר תום מסירת GABA. כל מכשיר מכאני מכויל ניתן להשתמש כדי להפעיל לחץ על מזרק microinjection כדי לנהל את הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישת נתונים אלקטרו, להרדים בשיטה אושרה על ידי בעלי החיים האתיקה הקהילה המקומית. </li></ol>

<ol><li>Martin, J. H., Ghez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inactivation+in+the+analysis+of+the+central+control+of+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).</li>
<li>Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+indirect+pathways+to+visual+response+properties+in+macaque+middle+temporal+area+MT%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT.</a> The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).</li>
<li>Lomber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+and+limitations+of+permanent+or+reversible+deactivation+techniques+in+the+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).</li>
<li>Malpeli, J., Schiller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+reversible+inactivation+of+small+regions+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).</li>
<li>Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryoloop%3A+an+adaptable+reversible+cooling+deactivation+method+for+behavioral+or+electrophysiological+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+deep+brain+structures+with+microinjections+for+delivery+of+drugs%2C+viral+vectors%2C+or+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants.</a> Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).</li>
<li>Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+parameters+of+cortical+inactivation+by+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).</li>
<li>Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+Reorganized+Primary+Somatosensory+%28SI%29+Cortex+after+Local+Inactivation+of+Normal+SI+Cortex+in+Chronic+Spinal+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+%26+Motor+Research%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats.</a> Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).</li>
<li>Malpeli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+subcortical+sites+by+drug+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).</li>
<li>Minville, K., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+frequency+processing+in+posteromedial+lateral+suprasylvian+cortex+does+not+depend+on+the+projections+from+the+striate-recipient+zone+of+the+cat%E2%80%99s+lateral+posterior-pulvinar+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex.</a> Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).</li>
<li>Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+the+binocular+visual+field+in+the+superior+colliculus+of+the+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat.</a> Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

הפרוטוקול המוצע נועד לפתור את האתגרים הנובעים משיטות איון הפיכים הנוכחיות. באופן ספציפי, הפרויקט הזה במטרה לשכלל את השיטות המשמשות לmicroinjections הכימי של חומרי ויסות פעילות עצבית, במיוחד במבני מוח עמוקים. אתגר טכני המתעוררים מסוג זה של התקנה הוא את הצורך בשני הבדיקות שcolocalized באותו המרחב מוגבל בvivo כדי להפיק הקלטות מדויקות במקום ההזרקה. בעיה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש במכשירים, כגון זו שהוצגה כאן, שמסוגל גם ההזרקה והקלטה באותו האתר. שיטות אלטרנטיביות כוללות שימוש...

איון של אזורים בקליפת המוח וגרעינים תת-קליפת המוח הוא חשוב בחקר יחסים פונקציונליים בין מבנים השונים במוח 2-4. הספרות האחרונה העסיקה כימית או טכניקות קריוגני פסד של פונקציה כדי ללמוד את התפקיד של מבני מוח 2,5. בהקשר לmicroinjections התרופתי, בנפחים קטנים של תרופות יכולים להינתן לאזור במוח בקצב מבוקר תוך מזעור הנזקים נלווים ל6,7 הרקמה הסובבת. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לספק אגוניסטים ספציפיים, אגוניסטים הפוך או יריבים כדי לחקור את ההשפעה של מטרות תרופתיות שונות על פעילות עצבית. יכולים להיות גם למדו אפקטים כגון על ידי מדידת שינויים בתגובות עצביות ממקומות מרוחקים, המאפשרת לחוקרים ללמוד את היחסים בין מבנים בקליפת המוח וקורטיקליים שונים. הנה, אנחנו מדגימים את ההרכבה של מכשיר, injectrode, מסוגל boה הקלטת אותות אלקטרו ומתן כמויות קטנות של סמים במיקום היעד. אנחנו מדגימים את היכולות של מערכת זו על ידי הזרקת GABA, מעכב משותף של פעילות עצבית, בcolliculus מעולה החולדה. אזור זה הוא רגיש לגירוי חזותי, אשר אפשר לנו להשתמש בפעילות multiunit עוררה חזותי כדי לאשר לוקליזציה injectrode. ההפיכות של איון הוערכו על ידי ההתאוששות של פעילות עצבית נורמלית לאחר תום הזרקת GABA. היכולת לעקוב אחר פעילות יחידה רבת מאתר ההזרקה מאפשרת כוונון העדין של שיעורי ההזרקה וכרכים דרושים כדי להשיג את התגובה הפרמקודינמית הרצויה. לכן, יתרון של שיטה זו הוא פוטנציאל הגבלה של נזק לרקמות שנגרמו על ידי microperfusion, מאז הכרכים היעילים הקטנים מוזרקים. הפרוטוקול המוצע מספק שיטה יעילה עלות ליצירת necessar החומרה חד פעמיy לניסויי ניהול שבו משלוח סמים והקלטת פעילות עצבית המקומית הוא רצויה.

<table><tbody><tr><td>משאבת הזרקה (UltraMicroPump III)</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr>#UMP3 <tr><td>קונסולת הזרקה (בקר Micro4)</td><td>WPI</td><td>#SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>Hamliton</td><td>(80301) 701LT 10 ומיקרו; מזרקי L SYR</td><td>בין 5 ל -10 &mu; l השתמש</td></tr><tr><td>בדבק פלסטיק גמיש</td><td>Lepage</td><td>393915</td><td>קל יותר למרוח את צורת הג'ל על הפיר של ה-30&nbsp; מחט היפודרמית G היוצרת אטימה עמידה למים כשהיא יבשה.</td></tr><tr><td>פיפטות זכוכית</td><td>WPI</td><td>#TW100F-4</td><td>דופן דקה, 1&nbsp; מ"מ OD, 0.75&nbsp; מזהה מ"מ עם פיפטות נימה בשימוש</td></tr><tr><td>720 מחט פיפטה חולץ</td><td>Kopf</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>חוט כסף</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>782500</td><td>חשוף "0.010</td></tr></tbody></table>

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

כאן אנו מתארים שיטה לבניית &quot;injectrode&quot; שימוש יחיד באמצעות חלקים מסחריים נגישים ובמחיר סבירים. מערכת חיטוט פותחה המאפשרת להזרקה של תרופה בעת הקלטת אותות אלקטרו מהאוכלוסייה העצבית הפגועה. שיטה זו מספקת אלטרנטיבה פשוטה וחסכונית לפתרונות מסחריים. פיפטה זכוכית שונה על ידי שילוב שלו עם מזרק ונימת כסף. Injectrode מחובר למשאבת microsyringe מסחרית עבור משלוח סמים. התוצאה היא טכניקה המספקת משוב פרמקודינמיקה בזמן אמת באמצעות אותות תאיים רבת יחידה שמקורם מהאתר של אספקת סמים. כהוכחה של מושג, הקלטנו פעילות עצבית מcolliculus מעולה שהושרו על ידי הבזקי אור בחולדות, במקביל עם משלוח של תרופות דרך injectrode. קיבולת הקלטת injectrode מאפשרת אפיון הפונקציונלי של injאתר שיקוף העדפת שליטה מדויקת הלוקליזציה של אספקת סמים. יישום של שיטה זו גם חורג הרבה מעבר למה שהפגין כאן, כבחירה של חומר כימי נטענה לתוך injectrode היא עצומה, כולל איתור סמנים לניסויים אנטומיים.

הבנייה של injectrode מתוארת באיור 1. חוט כסף (C) מוזנת לתוך פיפטה זכוכית (ד &#39;) עם חלק מהכפוף התיל ובולט החוצה מהפתיחה. מחט 30 G (B) מצורף ואטום לפתיחת פיפטה הזכוכית עם דבק. לאחר פיפטה כבר מלאה בחומר ההזרקה, מזרק מיקרו זכוכית () מחובר למחט. חשוב שיש חותם טוב בי מזרק מיקרו מתחבר עם המחט (E) ובו חוטי הכסף שבולט מפיפטה הזכוכית (F). איור 2 מציג תצלום של מה injectrode נראה כמו אחרי שסיימתי את ההרכבה. <p class="jove_content" style=";text-align:ri...

כאן, אנו יוצרים פיפטה מזכוכית עם פונקציות כפולות: עיכוב מבני מוח עמוקים על ידי הזרקות מיקרו של תרופות וניטור בזמן אמת של השפעותיהן באמצעות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית.

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבנות נתיב הזרקה זול להזרקה מיקרוסקופית של מוליכים עצביים אל ה-superior colliculus של חולדה, תוך ניטור פעילות נוירונלית של יחידות מרובות (multi-unit). דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת פיפטת זכוכית באמצעות קפילרה מזכוכית ומותח פיפטות מיקרוסקופיות אנכי. השלב השני הוא הכנסת תיל כסף אל הקפילרה, כאשר חלק מהתיל בולט מהקצה שאינו מצומצם.בשלב הבא משתמשים בדבק כדי ליצור אטימה הדוקה בין פיפטת הזכוכית לבין מחט היפודרמית. השלבים הסופיים כוללים מילוי של הפיפטה בתמיסת GABA בצבע כחול (Chicago sky blue), המחוברת למזרק מיקרו המלא בשמן מינרלי ומקובעת למזרק מיקרו (micro injector). בסופו של דבר, מבנה זה של מכשיר הזרקה מחלקים נגישים ובמחיר סביר יכול לשמש לנטרול מבנים עמוקים במוח תוך כדי הקלטה של פעילות נוירונלית באזור המנוטרל לפני, במהלך ואחרי הזרקת התרופה.קיימים מספר יתרונות לטכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון פולסי לחץ מבוססי גז ומערכות הזרקה פוטיות. אחד היתרונות הוא שמדובר בשיטה חסכונית המאפשרת בקרה מבוססת-תפקוד על הולכת התרופה, מה שמגביל את הנזק לרקמה הנגרם מהזרקת יתר. יתרון נוסף שהמערכת הזו מציעה הוא יכולת הקלטה משולבת, המאפשרת בקרה יעילה על הרכיב הזמני של דה-אקטיבציה עצבית.להכנת פיפטות ההזרקה להקלטה, ראשית משוך קפילרה באורך שבעה סנטימטרים עם קוטר חיצוני של מילימטר אחד עבור דגם אנכי של COP. יחידה 20 או יחידה דומה. הגדר את המחמם ל-18 ואת הסולנואיד ל-1; לאחר מכן, בעזרת כפפות, שבור ידנית את הקצה כדי ליצור פתח, ואמת תחת מיקרוסקופ שהקוטר הפנימי הוא בין 30 ל-40 מיקרומטרים.מדדו זאת באמצעות סרגל ה-viewfinders. התוצאה תהיה עכבה נמוכה יחסית של 0.3 עד 0.6 mega ohms. לאחר מכן, מהקצה שאינו מסתיימת בחוד, הכניסו לפיפט תיל כסף באורך של כ-שבעה סנטימטרים, והשאירו אורך של סנטימטר אחד עד שניים הבולטים מהפיפט.כופף את עודף התיל בניצב לקפילרה. לאחר מכן, קח מחט היפודרמית בכילייג' 30 ומריח דבק פלסטי גמיש על גוף המחט. לאחר מכן, הכנס את המחט לאט לתוך הפפיטה.במידה המקסימלית האפשרית, הוסיפו דבק נוסף כדי ליצור איטום בחיבור שבין הפיפטה למחט. כאשר קצה הפיפטה פונה כלפי מעלה, השאירו את המכלול לייבוש למשך כ-12 שעות.לאחר הרדמה והצבת החולדה במסגרת סטריאוטקסית, מרחו פומדה אופתלמית וגלחו את הראש עד לניקיון. לאחר מתן חומר אלחוש מקומי ואישור להשגת מישור הרדמה כירורגי, המשיכו בביצוע חתך של קרקפת לאורך קו האמצע באמצעות להב סכין מנתחים מספר 10. פעולה זו תחשוף את התפרים הקורונליים והסגיטליים.לאחר מכן, באמצעות שפכטל כירורגי, זהו את נקודות הייחוס האנטומיות Lambda ו-bgma. כווננו את תנוחת הראש כך שנקודות ציון אלו יהיו במישור אופקי אחד. לאחר מכן, בצעו איפוס של מצביע קשיח ועדין, כגון צינורית זכוכית, על ה-bgma.בשלב הבא, התאימו את מיקום המבחנה למיקום הרצוי באמצעות הקואורדינטות מה-bgma. השתמשו בטוש לסמן ריבוע מסביב לאזור היעד עבור הקרניאוטומי. כעת, באמצעות המקדחה הסטרילית הכירורגית, הסירו באיטיות את העצם לאורך הסימונים.התחילו בשימוש בלחץ נמוך ככל האפשר והמשיכו להניע את המקדח כדי למנוע נזק לרקמה שנגרם מהראש עקב חיכוך כאשר העצם הופכת לדקה, והסירו בזהירות את החלק המרובע באמצעות פינצטה. אין צורך להסיר את ה-Dura MA מכיוון שההזרקה תחדור דרכו בהמשך. שמרו על הקורטקס החשוף מושקה בנוזל צרbrospinal.הכינו את החומר להזרקה על ידי מילוי ראשוני של מזרק של 5 עד 10 µL בשמן מינרלי. לאחר מכן, הכינו את התרופה הרלוונטית עם צבע במי מלח פיזיולוגיים. כאן, 0.5% Chicago sky blue מעורבב עם 300 µM gaba.כעת מלאו את פיפטת ההזרקה על ידי טעינה ראשונית של מזרק של 1 mL עם התמיסה שהוכנה, ולאחר מכן השתמשו במזרק כדי למלא את הפיפטה. בעת הסרת המזרק, שמרו על לחץ קל על הבוכנה, כדי שואב (ואקום) לא יסיר את התמיסה מנתיב ההזרקה. בדקו אם יש דליפת נוזל בנקודות דליפה פוטנציאליות.ספגו כל נוזל עודף ובדקו שוב אם ישנה דליפה. כעת, חברו את המזרק המיקרוסקופי עם השמן המינרלי לנתיב ההזרקה. לאחר מכן, נגבו כל תמיסה עודפת.בעזרת גזה. בדקו את קצה ההזרקה. יש לוודא שניתן להזרים דרכו טיפות קטנות של תמיסה, אחרת הוא חסום; כעת התקינו את המזרק בצורה מאובטחת למערכת מיקרו-משאבה.לאחר מכן, העבירו את מיקום נתיב ההזרקה לקואורדינאטות היעד והורידו את האלקטרודה אל ה-superior colliculus, שניתן לזהותו באמצעות הקלטה של פוטנציאלים מעוררים חזותיים. בזמן הורדת האלקטרודה, הפילו לחץ חיובי קטן על ידי הזרקה בקצב נמוך כדי למנוע סתימה. הפסיקו את ההזרקה עם ההגעה למבנה.לאחר הכנסת המזרק, כסו את הקורטקס החשוף באגר חמים כדי למנוע התייבשות. לאחר המיקום הסופי של האלקטרודה, המתינו 30 דקות כדי לאפשר התייצבות של הרקמה שסביב האלקטרודה. לאחר מכן, הזריקו 400 עד 800 nanoliters של תמיסה בקצב של 40 nanoliters לדקה עד להפעלת פעילות נוירונלית ב-superior colliculus; האלקטרודה אמורה להראות הפחתה ב-spikes במהלך ההזרקה של התמיסה המעכבת.פוטנציאלים מעוררים חזותית התקבלו ב-superior colliculus. בעקבות הבזק של 300 milliseconds לעין הקונטרלטרלית עם הזרקת gaba, פעילות ה-spiking בתגובה לגירוי של הבזק דוכאה למשך 45 עד 60 דקות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבדוק אם ישנן דליפות במהלך הטעינה ולוודא שתמיסת התרופה זורמת בחופשיות דרך קצה המזרק.

simultaneous-electrophysiological-recording-micro-injections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פיתחנו שיטת הדמיה בתהודה מגנטית תפקודית זמנית הקלטה אלקטרו במוח מכרסם, המספקת פלטפורמה חקירת הקשר בין הפעילות העצבית ואת רמת חמצון הדם תלוי אות (BOLD) MRI.

FMRI Electrophysiology סימולטני במוח מכרסמים

הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד הקלטה זמין מסחרי.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והשימוש בהזרקה להעברת תרופות מדויקת לאזורי מוח ממוקדים של חולדה מורדמת, ולאחר מכן ניטור של הפעילות העצבית באמצעות אותות חשמליים מתועדים.

מיקרו-הזרקה של תרופות עם רישום אלקטרופיזיולוגי במוח של חולדה

סרטון זה מדגים את ההליך המפורט להכנת חולדה מורדמת להקלטות אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מוחית מאתרים מרובים. הקרקפת מנותחת כדי לגשת לגולגולת, וחורים נקדחים במקומות מדויקים כדי להתקין ולאבטח אלקטרודות. אלקטרודות מיקרו-חוט טונגסטן מוכנסות לאחר מכן למיקום היעד כדי להקליט את הנתונים.

In Vivo רישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילויות מוחיות מאתרים מרובים בחולדות

הסרטון מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית סימולטנית מאזורי מוח מרובים בחולדה באמצעות מערך מיקרו-כונן אינטגרטיבי. אלקטרודות הקלטה ממוקמות בנורת הריח, אלקטרודות ייחוס בקליפת המוח המצחית, ואלקטרודות מערך מיקרו-כונן בהיפוקמפוס. החולדה מורשית לחפש מזון באופן חופשי, והקלטה סימולטנית מכל האלקטרודות המושתלות נרשמת באמצעות המערך.

שיטת מערך מיקרו-כוננים להקלטה אלקטרופיזיולוגית מאזורי מוח מרובים

סרטון זה מדגים את ההליך להקלטות בו-זמניות של אלקטרואנצפלוגרפיה מקומית (EEG) ופוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) בחולדה מורדמת. התהליך כולל הכנת החולדה והצמדת אלקטרודות מעוררות לכריות השפם שלה. אלקטרודת עכביש EEG ממוקמת על גולגולת החולדה לצורך מדידות EEG על פני השטח. במקביל, מיקרואלקטרודה רב-ערוצית מוחדרת לאזור מסוים במוח דרך חור בגולגולת כדי לרשום פעילות עצבית מאזור מקומי במוח.

הקלטות פוטנציאליות אלקטרואנצפלוגרפיות ומקומיות בו-זמנית בחולדה מורדמת

מקור: Lai, J., et al. רישום אלקטרופיזיולוגי בו זמנית ומיקרו-הזרקות של חומרים מעכבים במוח המכרסמים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת מיקרו-הזרקה להקלטה ועיכוב עצביים בו זמנית בקוליקולוס העליון של החולדה. ההליך כולל מיקוד סטריאוטקסי, קידוח גולגולת והחדרת מזרק, המספק נוירוטרנסמיטר מעכב תוך רישום פעילות עצבית. גירוי אור מעורר פוטנציאל פעולה, בעוד שמיקרו-הזרקת סמים מדכאת את הריגוש העצבי. ככל שרמות המוליכים העצביים יורדות, הפעילות העצבית חוזרת לנקודת ההתחלה, ומאפשרת לחקור הן את העיכוב...

עיכוב פעילות עצבית ואיתור שלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה בחולדה

אנו מציגים שיטות לבניית אלקטרודות לרישום בו זמנית של פעילות עצבית חוץ-תאית ולשחרור חומרים נוירואקטיביים מרובים בקרבת אתרי ההקלטה בעכברים ערים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של קלטים סינפטיים מקומיים משוערים לנוירון המעניין.

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור הקלטה בו זמנית של שותף מקומי אלקטרואנצפלוגרם (EEG) ו- multi-למינריות שדה מקומי פוטנציאל עכברוש anesthetized. חור burr בתלמידים הגולגולת עבור הכניסה של microelectrode מוצג לייצר עיוות זניח של האות EEG.

הקלטה בו זמנית של שותף מקומי אלקטרואנצפלוגרם ופוטנציאל שדה מקומי במכרסם

אנו מדגימים כיצד לבצע הקלטה וחשמליים מודולציה של פעילות אפילפטית 4-aminopyridine-induced פרוסות המוח מכרסמים באמצעות מערכי microelectrode. חדר הקלטה מותאמת אישית שומר על רקמות הכדאיות ברחבי מישיבות ניסיוני. חיים מיפוי אלקטרודה, מבחר זוגות מגרה מבוצעות על ידי ממשק משתמש גרפי מותאם אישית.

הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode

אנו מציגים מערכת microinjectrode מיועד אלקטרופיזיולוגיה וסיוע משלוח של בדיקה ניסויית (כלומר, ננוחיישנים, microאלקטרודות), עם עירוי תרופה אופציונלי. רכיבים במיקרופלואידיג זמינים באופן נרחב לצינורית המכילה את הגשוש. פרוטוקול שלב אחר שלב עבור הבנייה microinjectrode הוא כלול, עם תוצאות במהלך עירוי מוסקימול בקליפת מקוק.

מערכת microinjectrode לטיפול בתרופות אינפוזיה ואלקטרופיזיולוגיה של התרופה

למד לבנות צינורית זכוכית לשימוש כפול: הזרקת תרופות לבלימת מבנים עמוקים במוח ורישום פעילות עצבית בו זמנית בעכברוש. שיטה זו מאפשרת מחקר יעיל בנוירופיזיולוגיה ובנוירופרמקולוגיה.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

גלה סרטונים נוספים