אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם
7 ביולי 2015
כאן, אנו יוצרים פיפטה מזכוכית עם פונקציות כפולות: עיכוב מבני מוח עמוקים על ידי הזרקות מיקרו של תרופות וניטור בזמן אמת של השפעותיהן באמצעות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבנות נתיב הזרקה זול להזרקה מיקרוסקופית של מוליכים עצביים אל ה-superior colliculus של חולדה, תוך ניטור פעילות נוירונלית של יחידות מרובות (multi-unit). דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת פיפטת זכוכית באמצעות קפילרה מזכוכית ומותח פיפטות מיקרוסקופיות אנכי. השלב השני הוא הכנסת תיל כסף אל הקפילרה, כאשר חלק מהתיל בולט מהקצה שאינו מצומצם.
בשלב הבא משתמשים בדבק כדי ליצור אטימה הדוקה בין פיפטת הזכוכית לבין מחט היפודרמית. השלבים הסופיים כוללים מילוי של הפיפטה בתמיסת GABA בצבע כחול (Chicago sky blue), המחוברת למזרק מיקרו המלא בשמן מינרלי ומקובעת למזרק מיקרו (micro injector). בסופו של דבר, מבנה זה של מכשיר הזרקה מחלקים נגישים ובמחיר סביר יכול לשמש לנטרול מבנים עמוקים במוח תוך כדי הקלטה של פעילות נוירונלית באזור המנוטרל לפני, במהלך ואחרי הזרקת התרופה.
קיימים מספר יתרונות לטכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון פולסי לחץ מבוססי גז ומערכות הזרקה פוטיות. אחד היתרונות הוא שמדובר בשיטה חסכונית המאפשרת בקרה מבוססת-תפקוד על הולכת התרופה, מה שמגביל את הנזק לרקמה הנגרם מהזרקת יתר. יתרון נוסף שהמערכת הזו מציעה הוא יכולת הקלטה משולבת, המאפשרת בקרה יעילה על הרכיב הזמני של דה-אקטיבציה עצבית.
להכנת פיפטות ההזרקה להקלטה, ראשית משוך קפילרה באורך שבעה סנטימטרים עם קוטר חיצוני של מילימטר אחד עבור דגם אנכי של COP. יחידה 20 או יחידה דומה. הגדר את המחמם ל-18 ואת הסולנואיד ל-1; לאחר מכן, בעזרת כפפות, שבור ידנית את הקצה כדי ליצור פתח, ואמת תחת מיקרוסקופ שהקוטר הפנימי הוא בין 30 ל-40 מיקרומטרים.
מדדו זאת באמצעות סרגל ה-viewfinders. התוצאה תהיה עכבה נמוכה יחסית של 0.3 עד 0.6 mega ohms. לאחר מכן, מהקצה שאינו מסתיימת בחוד, הכניסו לפיפט תיל כסף באורך של כ-שבעה סנטימטרים, והשאירו אורך של סנטימטר אחד עד שניים הבולטים מהפיפט.
כופף את עודף התיל בניצב לקפילרה. לאחר מכן, קח מחט היפודרמית בכילייג' 30 ומריח דבק פלסטי גמיש על גוף המחט. לאחר מכן, הכנס את המחט לאט לתוך הפפיטה.
במידה המקסימלית האפשרית, הוסיפו דבק נוסף כדי ליצור איטום בחיבור שבין הפיפטה למחט. כאשר קצה הפיפטה פונה כלפי מעלה, השאירו את המכלול לייבוש למשך כ-12 שעות.
לאחר הרדמה והצבת החולדה במסגרת סטריאוטקסית, מרחו פומדה אופתלמית וגלחו את הראש עד לניקיון. לאחר מתן חומר אלחוש מקומי ואישור להשגת מישור הרדמה כירורגי, המשיכו בביצוע חתך של קרקפת לאורך קו האמצע באמצעות להב סכין מנתחים מספר 10. פעולה זו תחשוף את התפרים הקורונליים והסגיטליים.
לאחר מכן, באמצעות שפכטל כירורגי, זהו את נקודות הייחוס האנטומיות Lambda ו-bgma. כווננו את תנוחת הראש כך שנקודות ציון אלו יהיו במישור אופקי אחד. לאחר מכן, בצעו איפוס של מצביע קשיח ועדין, כגון צינורית זכוכית, על ה-bgma.
בשלב הבא, התאימו את מיקום המבחנה למיקום הרצוי באמצעות הקואורדינטות מה-bgma. השתמשו בטוש לסמן ריבוע מסביב לאזור היעד עבור הקרניאוטומי. כעת, באמצעות המקדחה הסטרילית הכירורגית, הסירו באיטיות את העצם לאורך הסימונים.
התחילו בשימוש בלחץ נמוך ככל האפשר והמשיכו להניע את המקדח כדי למנוע נזק לרקמה שנגרם מהראש עקב חיכוך כאשר העצם הופכת לדקה, והסירו בזהירות את החלק המרובע באמצעות פינצטה. אין צורך להסיר את ה-Dura MA מכיוון שההזרקה תחדור דרכו בהמשך. שמרו על הקורטקס החשוף מושקה בנוזל צרbrospinal.
הכינו את החומר להזרקה על ידי מילוי ראשוני של מזרק של 5 עד 10 µL בשמן מינרלי. לאחר מכן, הכינו את התרופה הרלוונטית עם צבע במי מלח פיזיולוגיים. כאן, 0.5% Chicago sky blue מעורבב עם 300 µM gaba.
כעת מלאו את פיפטת ההזרקה על ידי טעינה ראשונית של מזרק של 1 mL עם התמיסה שהוכנה, ולאחר מכן השתמשו במזרק כדי למלא את הפיפטה. בעת הסרת המזרק, שמרו על לחץ קל על הבוכנה, כדי שואב (ואקום) לא יסיר את התמיסה מנתיב ההזרקה. בדקו אם יש דליפת נוזל בנקודות דליפה פוטנציאליות.
ספגו כל נוזל עודף ובדקו שוב אם ישנה דליפה. כעת, חברו את המזרק המיקרוסקופי עם השמן המינרלי לנתיב ההזרקה. לאחר מכן, נגבו כל תמיסה עודפת.
בעזרת גזה. בדקו את קצה ההזרקה. יש לוודא שניתן להזרים דרכו טיפות קטנות של תמיסה, אחרת הוא חסום; כעת התקינו את המזרק בצורה מאובטחת למערכת מיקרו-משאבה.
לאחר מכן, העבירו את מיקום נתיב ההזרקה לקואורדינאטות היעד והורידו את האלקטרודה אל ה-superior colliculus, שניתן לזהותו באמצעות הקלטה של פוטנציאלים מעוררים חזותיים. בזמן הורדת האלקטרודה, הפילו לחץ חיובי קטן על ידי הזרקה בקצב נמוך כדי למנוע סתימה. הפסיקו את ההזרקה עם ההגעה למבנה.
לאחר הכנסת המזרק, כסו את הקורטקס החשוף באגר חמים כדי למנוע התייבשות. לאחר המיקום הסופי של האלקטרודה, המתינו 30 דקות כדי לאפשר התייצבות של הרקמה שסביב האלקטרודה. לאחר מכן, הזריקו 400 עד 800 nanoliters של תמיסה בקצב של 40 nanoliters לדקה עד להפעלת פעילות נוירונלית ב-superior colliculus; האלקטרודה אמורה להראות הפחתה ב-spikes במהלך ההזרקה של התמיסה המעכבת.
פוטנציאלים מעוררים חזותית התקבלו ב-superior colliculus. בעקבות הבזק של 300 milliseconds לעין הקונטרלטרלית עם הזרקת gaba, פעילות ה-spiking בתגובה לגירוי של הבזק דוכאה למשך 45 עד 60 דקות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבדוק אם ישנן דליפות במהלך הטעינה ולוודא שתמיסת התרופה זורמת בחופשיות דרך קצה המזרק.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את בנייתה של פיפטת זכוכית שנועדה למטרות כפולות: הולכת תרופות לעיכוב מבנים עמוקים במוח וניטור פעילות עצבית באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- נוירופרמקולוגיה
רקע
- הבנת מבני המוח העמוקים היא קריטית למחקר בתחום מדעי המוח.
- מיקרו-הזרקות מאפשרות הובלה ממוקדת של תרופות.
- ניטור סימולטני של פעילות נוירונלית משפר את דיוק הנתונים.
- כלים זמינים ובעלות נמוכה יכולים לסייע להרחבת יישומי המחקר.
מטרת המחקר
- ליצור שיטה חסכונית להזרקה מיקרוסקופית של מוליכים עצביים.
- לנטר פעילות עצבית רב-יחידתית (multi-unit) במהלך מתן תרופה.
- לשפר את הנגישות של טכניקות ניסיוניות במדעי המוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של פיפטת זכוכית באמצעות קפילרית זכוכית.
- החדרה של תיל כסף לצורך רישום חשמלי.
- איטום של הפיפטה למחט היפודרמית באמצעות דבק.
- מילוי הפיפטה בתמיסת GABA למיקרו-הזרקה.
תוצאות עיקריות
- הפיפטה שהוכנה העבירה ביעילות תרופות אל ה-superior colliculus של החולדה.
- התקבלו בהצלחה הקלטות סימולטניות של פעילות נוירונלית.
- השיטה הוכיחה מהימנות בהשבתה (inactivation) של מבני מוח מוגדרים.
- התוצאות הצביעו על פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקרי מדעי המוח.
מסקנות
- הפיפטה בעלת התפקוד הכפול היא כלי בעל ערך למחקרי מדעי העצב.
- היא מאפשרת הן הולכת של תרופות והן ניטור בזמן אמת של פעילות נוירונלית.
- גישה זו יכולה לשפר תוצאות ניסיוניות בנורופרמקולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
שיטה זו מאפשרת תיקוף תפקודי בזמן אמת של השפעות תרופתיות על מעגלים עצביים, ובכך מסייעת בהפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות בשלבים מוקדמים של גילוי נוירו-פרמקולוגי. על ידי שילוב של מיקרו-הזרקה עם קריאה אלקטרופיזיולוגית, היא מספקת ביטחון מכניסטי לסריקת תרכובות מעכבות. גישה זו מציעה פלטפורמה גמישה וזולה לבחינת פרמקודינמיקה ספציפית לאזורי מוח לפני אופטימיזציה של מולקולות מובילות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה תפקודית של מטרות טיפוליות באמצעות הובלה ספציפית של תרופות לאתר היעד ובמקביל ניטור של פעילות נוירונלית.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף מונחה-היפותזה של מעורבות נתיבים נוירונליים במודלים של מחלות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר קריאות אלקטרופיזיולוגיות כמותיות בזמן אמת כסממנים ביולוגיים תפקודיים של מעורבות תרופתית.
- ערך תפעולי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרמטרי מיקרו-הזרקה והקלטה ניתנים לשחזור.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מגשר על ממצאים in vitro לתפקוד מעגלים שלם על ידי תיקוף השפעות של תרופות במערכות נוירונליות רלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות go/no-go על ידי קישור עיכוב של מטרה לשינויים מדידים בפעילות רשת נוירונלית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי גילוי מוקדמים, שבהם יש לבסס את המעורבות של המטרה (target engagement) ואת ההשלכות התפקודיות לפני קידום התרכובת.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אישור ש modulates של המטרה מייצר תוצאות אלקטרופיזיולוגיות צפויות.
- סריקה: מאפשר סריקה ראשונית של חומרים מעכבים תוך שימוש בהשתקה עצבית כמדד תפקודי.
- אנליטיקה: מספק מדדי דיכוי ספייקים ומדידות של זמן השהיה עד להשפעה לצורך השוואה בין תרכובות.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם תיקוף פרה-קליני על ידי הדגמת השפעות המתווכות על ידי המטרה in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון ה-injectrode ניתן להתאמה לאזורי מוח ותרכובות כימיות שונות, מה שתומך בשימוש חוזר נרחב בתוכניות גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי קישור התערבות פרמקולוגית לפלט עצבי תפקודי.
- ערך תפעולי: מפחית את ההסתמכות על מערכות הזרקה והקלטה נפרדות, ובכך משפר את יעילות זרימת העבודה ואת סנכרון הנתונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מזעור תוצאות חיוביות שגויות באמצעות אישור תפקודי של המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון על בסיס תגובות אלקטרופיזיולוגיות תלויות מינון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, אלקטרופיזיולוגיה ומיקוד סטריאוטקסי.
- תלוי בגישה למיקרו-מזרקים, מגברים ומערכות רכישת אות המסוגלות להקלטה של מספר יחידות (multi-unit recording).
- מחייב סטנדרטיזציה של נפחי ההזרקה, קצבי ההזרקה ותקופות התייצבות לאחר ההזרקה בין מחקרים שונים.
- התאמה לאזורי מוח שונים עשויה לדרוש כיול מחדש של הקואורדינטות ומיקום האלקטרודות.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות נזק לרקמה כתוצאה מהחדרות חוזרות ושונות בשלמות האיטום המשפיעה על דיוק אספקת התרופה.
