מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא שושנת יריחו זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הדמיית מיקרוסקופיה תוך-חיונית של כבד העכבר כדי למדוד את מהירות זרימת הדם עם כלי כבד בודדים. זה מושג על ידי חשיפת הכבד תחילה והזרקת מגיב פלזמה פלואורסצנטי תוך ורידי כדי לסמן את כלי הדם בכבד. הסינוסואידים של הכבד והאריתרוציטים שנכנסו אליהם הודגמו לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית בזמן אמת.

לאחר מכן נבחרים כלי הכבד המעניינים למדידת מהירות זרימת הדם שלהם בשלב האחרון, סרטים של זרימת הדם בכבד נרכשים במהירות וברזולוציה גבוהה. בסופו של דבר, ניתן לכמת את מהירות זרימת הדם בתוך כלי דם בודדים בתנאים פיזיולוגיים רגילים ובעקבות זיהום במאניה ברצועה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות כמו אולטרסאונד TOLA וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית, הוא שהיא מספקת רזולוציה מרחבית וזמנית גדולה יותר בשילוב עם היכולת למדוד מספר פרמטרים אחרים בו זמנית.

in vivo, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההמודינמיקה של הכבד במהלך זיהומים מיקרוביאליים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות, כולל חקר הפיזיולוגיה של האיברים בסרטן ומחלות אוטואימוניות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה לחשוף כראוי כבד אנג'יו ולבחור במהירות את כלי הדם המציג את צביעת ריאגנט קרום הפלזמה הפלואורסצנטי ללא ניסיון מעשי לפני תחילת ההליך, יש לחטא את סביבת העבודה עם תרסיס חיטוי ביו-צידלי, ואת כל המכשירים הכירורגיים עם 70% אתנול למשך 30 דקות.

לאחר מכן, לאחר אישור רמת ההרדמה המתאימה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן, יש לגלח את בטן החיה ולנקות את אזור הניתוח עם פובידון יוד. לאחר מכן, בצע חתך קטן בעור ובשרירים מתחת לכלוב בית החזה בצד שמאל של הבטן, והניח חתיכת גזה לחה ממש מתחת לפתח. חלצו את הכבד והניחו אותו על הגזה, והניחו חתיכה שנייה של גזה לחה ממש מעל הרקמה.

לאחר מכן הניחו כיסוי בגודל 24 על 60 מילימטר בעובי 150 מיקרומטר ציאנואקרילט המחובר למסגרת מתכת על גבי הכבד. הפוך את העכבר וכסה את עיני החיה בחתיכה נוספת של גזה רטובה. כדי למדוד את מהירות זרימת הדם בכבד, פתח את תוכנת מערכת היישומים של Leica ובחר במצב סורק התהודה.

לאחר מכן, לחץ על לשונית התצורה ובחר לייזר והליום ניאון 6 33. לאחר מכן לחץ על הגדרות ובחר רזולוציה של 12 סיביות. כעת לחץ על תפריט הרכישה ובחלון הגדרות מסלול האלומה, בחר את המטרה 63 x והגדר את עוצמת הלייזר 6 33 ל-100%כדי להפעיל את פרמטרי רווח האות והיסט מהתפריט הנפתח של צילום multi tube three, בחר Alexa 6 33.

בכרטיסיית הרכישה, בחר את מצב רכישת XYT והגדר את רוחב הפורמט ל-1024 על 1024, הגדר את המהירות ל-8, 000 הרץ ובחר חור סיכה ומקדם זום של שלוש. לאחר מכן להדמיית וידאל של ארכיטקטורת הכבד, הנח את העכבר על הבמה של המיקרוסקופ הקונפוקלי ההפוך כשהכיסוי מחליק והכבד פונה כלפי מטה. על המטרה, הגדר את הטמפרטורה של החדר הנשלט התרמוסטטי ל -29 מעלות צלזיוס.

באמצעות לוח הבקרה של ה-USB, כוונן את מיקוד הכבד על סמך הקרינה של צבע מגיב הפלזמה המוזרק. כדי לכמת את מהירויות תאי הדם האדומים באמצעות תמונות XYT, ראשית, לחץ על הסמל החי כדי לדמיין את זרימת הדם במצב חי. לאחר מכן, בחר את תחום העניין ובחר כלי דם ספציפי לניתוח.

כוונן את קואורדינטות סיבוב השדה x, y וסריקה בלוח הבקרה של ה-USB כדי לכוונן את הכלי למצב אופקי. לאחר מכן הפסק להשתמש במצב חי ושנה את רוחב הגדרת הפורמט ל-1024 על 2 56. בחלון הגדרת מצב הרכישה, הגדר את ממוצעי הקו והמסגרת ל-1 והגדר את הערימות ל-150.

לחץ על התחל כדי להשיג את התמונות. לאחר שכל התמונות הושגו, פתח את תוכנת Image J ואת הקובץ המבוקש. לאחר מכן, תחת תפריט התוסף, בחר את אפשרויות הייבוא של הפורמטים loci ו-bio.

הגדר את פרמטרי הצפייה באוסף ל- hyper stack ובחר באפשרות X-Y-Z-C-T. ייפתח חלון המכיל את כל המידע על סדרות הרכישה בתפריט התוספים, שוב, בחר באפשרות MT a J, לחץ על סמל ההוספה ובחר תא דם אדום למעקב. לחץ על אותו תא דם אדום בכל אחת מהפריימים הרצופים, ולאחר מכן לחץ על סמל המדידה כדי למדוד את מהירות התא.

עקוב אחר תאי דם אדומים בודדים בתוך כלי דם בודד ונתח לפחות שלושה כלי דם בודדים באותו גודל. כדי לכמת את מהירויות תאי הדם האדומים באמצעות תמונות קו XT, לחץ בשידור חי כדי לדמיין את זרימת הדם במצב חי ובחר כלי דם ספציפי לניתוח. הזז את כלי השיט המעניין למצב אופקי והגדר את הלומן המרכזי של הכלי הנבחר לאורך סריקת הקו כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן הפסק את מצב החי ברגע שהכלי נמצא במקומו. כעת בחר את מצב הסריקה XT. הגדר את רוחב הפורמט ל-1024 על 512, את המהירות ל-8,000 הרץ, את ממוצע הקו ל-32 ואת השעה ל-512.

לאחר מכן לחץ על התחל ורכוש את תמונות קו ה-XT כדי ליצור פסים לכימות מהירות כדוריות הדם האדומות. פתח את מערכת היישומים של Leica. תוכנה פלואורסצנטית מתקדמת, בחר ניסויים.

פתח את קובץ DO LIF ובחר את התמונה המעניינת. גרף המציג תמונת קו XT ייפתח אוטומטית באמצעות כלי ציור הקו, צייר קו לאורך הפס, המציין את המרחק המתאים במיקרומטר ואת הזמן בשניות. לאחר מכן השתמש בערכים אלה כדי לחשב את המהירות כמרחק חלקי הזמן באמצעות התוסף MT A KJ עבור תוכנת תמונה J.

ניתוח כמותי של המהירות של תאי הדם האדומים הבודדים הללו בכלי בודד הראה כי המהירות של תאי דם אדומים הנודדים דרך כלי כבד קטנים היא בממוצע בין 25 ל-35 מיקרומטר לשנייה, עם זאת, סריקה חוזרת לאורך קו מקביל לדופן כלי הדם ומרוכזת בלומן של כלי הדם, עם זאת, מאפשר שימוש בהקרנות האורתוגונליות על AEs X ו-Y כדי לחשב את המהירות של תאי הדם האדומים הבודדים בדיוק דומה לשיטת MT a CJ. בתמונות אלה מוצגת דוגמה טיפוסית לניסוי תת-אופטימלי שבו לא נלקח בחשבון קצב ההפנמה של מגיב הפלזמה לתוך האנדותל המצפה את כלי הדם. שימו לב לאיכות המשתנה של הפסים בתמונת ה-XT המציגה את מהירות תאי הדם האדומים בתוך כלי דם אלה.

ללא פענוח, בניסוי מייצג אחרון זה, הוערכה זרימת הדם בכבד של עכברים נגועים ב-L Donovan I. שימו לב לעלייה המשמעותית במהירות זרימת הדם שנצפתה כבר שעה ועד 24 שעות לאחר ההדבקה, מה שמאמת את השימוש בשיטת תמונת קו XT להשגת תובנות חדשות לגבי השפעת מצבים פתולוגיים על המודינמיקה של הכבד לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להסתיים תוך שעתיים או שלוש אם היא מבוצעת כראוי לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה לחקור המודינמיקה ספציפית לאיברים בעכברים in vivo, בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח לחשיפת כבד וכיצד למדוד את מהירות זרימת הדם בכלי דם בודדים בכבד לאחר הזרקת עניבת פלזמה.