בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבודד תאי שריר מטוהרים מביופסיות שריר של מטופלים אנושיים ולהנציח אותם למחקרים בהמשך הזרם. זה מושג על ידי שקילה ראשונה, טחינה ועיכול של הרקמה שנאספה כדי לנתק את התאים החד-גרעיניים. כשלב שני, התאים המיוגניים מטוהרים מתאים לא מיוגניים על ידי עובדות.

לאחר מכן, תאים מיוגניים נגועים הן ב-CDK 4 והן ב-H turt כדי ליצור תאים אימורטליים. התוצאות מראות כי ניתן להרחיב תאי שריר חיים שמקורם בחולה למספר מעברים ולהתמיין על סמך מבחני איחוי תאים, נוכחות של צינורות מיו מתעוותים וביטוי סמנים מיוגניים. ההשלכות של טכניקה זו חורגות מעבר לאבחון של מחלת שרירים מכיוון שהיא יכולה לספק מספר בלתי מוגבל של תאים מיוגניים לסינון תרופות או יישומים אחרים במורד הזרם שבהם נדרש מספר גבוה של תאים.

אני אדגים את ההליך יחד עם ג'רום רובין, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה של ד"ר וודי רייט בדאלאס. התחל בניתוק ביופסיית השריר כדי לטהר את התאים המיוגניים. ראשית במכסה המנוע לבטיחות ביולוגית של תרבית רקמות, רשום את מסת ביופסיית השריר.

לאחר מכן, בצלחת של 10 סנטימטרים, השתמשו באזמלים סטריליים כדי לטחון את הרקמה לחתיכות קצוצות דק. הוסף כמה טיפות של X-H-B-S-S אחד כדי שהרקמה לא תתייבש לכל גרם של רקמה. הוסף 3.5 מיליליטר של משחת דיסק, שניים ו-3.5 מיליליטר של תמיסות קולגנאז D.

לאחר מכן מערבבים את התאים עם פיפטה של 25 מיליליטר ומעבירים את הצלחת לחממה כל 15 דקות. מערבבים את התאים עם פיפטה של חמישה מיליליטר תוך 90 דקות. צריכה להיות דיסוציאציה מוחלטת של רקמות.

לאחר ניתוק הרקמה, הוסף שני נפחים של מצע גידול וסנן אותו דרך מסננת של 100 מיקרון. אוספים את המסנן בצינור של 50 מיליליטר. גלולה את התאים מהסינון ב -329 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-HBSS עם 0.5%BS, A וספרו אותם. התאם את עוצמת הקול כדי לקבל מיליון תאים לכל 100 מיקרוליטר. הקצה אליקוט של 250,000 תאים כבקרה לא מוכתמת והקצה שני אליקוטים דומים לבקרות כתמים בודדים.

כל אלה נדרשים לניתוח הפקס. כעת, צבעו את התאים בחמישה מיקרוליטרים של נוגדן נגד CD 56 למיליון תאים, ודגרו את כל הדגימות על הקרח למשך חצי שעה. לאחר מכן, שטפו במהירות את הדגימות עם 10 מיליליטר HBSS.

לאחר מכן גלולה את התאים כמו קודם, אך בארבע מעלות צלזיוס לאחר שהתאים נזרקו, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-X-H-B-S-S אחד ב-5 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן הוסף פרופידיום יודיד לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. כעת טהר את התאים החיוביים המיוגניים CD 56 מהתאים הלא מיוגניים באמצעות עובדות העוקבות אחר צלחת הטיהור.

התאים המיוגניים ב-50,000 לבאר בשש צלחות באר מצופות בתרבית ג'לטין של 0.1%, התאים עד שהם מחוברים, ואז מדביקים אותם בנגיף לקו התאים בן אלמוות. בפרוטוקול הטקסט, יש סקירה נוספת כיצד לטהר ולתרבית פיברובלסטים עוריים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן תאים טרופיים של עוף החול לאחר דגירה של התאים הטרופיים של עוף החול למשך הלילה עם תערובת הפלסמיד PolyJet.

האכילו את התאים טריים, בינוניים, המורכבים מארבעה חלקים של DME M1, חלק מסרום עגל בינוני, 1 99 ו -10%. הכינו גם אריזות אינוטרופיות. PA שלושה 17 תאים בצלחת של שש בארות עם כ-400,000 PA שלושה 17 תאים לבאר.

12 שעות לאחר מכן, אספו את הנגיף המכיל סופרנטנט מעל התאים הטרופיים של פיניקס והעבירו אותו דרך מסנן של 0.45 מיקרון. לאחר מכן השתמש במיליליטר אחד של הסופרנטנט כדי להדביק את שלושת תאי ה-PA 17 ולתרבית אותם למשך הלילה. למחרת, בחר עבור קו תאים המייצר וירוס מ-PA שלושה תאים 17 על ידי מריחת אנטיביוטיקה ב-0.5 מיליגרם למיליליטר על המדיום כאשר התאים קרובים לשטף משותף, קצור את הסופרנטנט מהתאים שלוש פעמים במרווחים של 12 שעות.

מסננים את האוספים לאחר כל קציר. המסנן הוא הסופרנטנט הנגיפי העובד. מחלקים אותו למיליליטר אחד. אליקוטים.

הקדישו כמה אליקוטים לשימוש מיידי. ניתן לאחסן את העליונות הנוספות במינוס 80 מעלות צלזיוס, אך יאבדו 50% יעילות עם כל מחזור הפשרת הקפאה. שימו לב שלאורך כל התהליך יש לשטוף אקונומיקה של ציוד שנגע בחלקיקים הנגיפיים לפני שהוא מושלך לפח האשפה.

כדי לאחסן לצמיתות את קו התאים היציב המייצר נגיף PA 3 17, הקפיאו את התאים בסרום 10% DMSO 90% ואחסנו אותם במינוס 150 מעלות צלזיוס לכל באר של תאים מטוהרים בפקס. בצלחת שש בארות, מוסיפים 400 מיקרוליטר של סופרנטנט ויראלי טרי. השאירו שתי בארות ללא וירוס כבקרה.

דגרו את הצלחת למשך הלילה ולמחרת החליפו את המדיום בכל באר ל -2.5 מיליליטר של מדיית שרירים טרייה. הקפד להשליך את המדיה והפיפטות המכילות חלקיקים נגיפיים לתוך מיכל האקונומיקה. תן לתאים לדגור בתקשורת השרירים הטרייה למשך שלושה ימים.

לאחר מכן בחר את התאים לעמידות לאנטיביוטיקה באמצעות 400 מיקרוגרם ניאומיצין למיליליטר לזיהום CDK 4, או 300 מיקרוגרם היגרומיצין למיליליטר לטלומראז אנושי. זיהום טרנסקריפטאז הפוך למשך שבוע או שבועיים. שמור על התאים בתנאים סלקטיביים עד שהתאים ובארות הבקרה מתים כולם.

העבירו תמיד את התאים לפני שהם הופכים למתכנסים, גם במהלך הברירה כאשר הם מגיעים לשטף Co של 60 עד 80% השתמשו בתמיסת EDTA של 0.05% טריפסין כדי לאסוף ולהעביר את התאים. העבירו את התאים לצלחות של 10 סנטימטר עם מיובלסט טרי, בינוני עם אנטיביוטיקה. ראשית זרעו את התאים בצפיפות נמוכה מאוד של שלושה עד 500 לצלחת של 10 סנטימטרים.

שמרו על התאים בכלים אלה במשך כשבועיים עד שנוצרות מושבות קטנות של 10 עד 20 תאים כאשר המושבות הקטנות ניכרות. הסר את רוב המדיה והשאיר רק שכבה דקה של מדיה כדי למנוע מהתאים להתייבש. כעת, טבלו צד אחד של טבעת שיבוט בשומן ואקום סיליקון ואת הטבעת מעל שיבוט רצוי.

שים טבעת שונה סביב כל שיבוט רצוי בכל טבעת. הוסף כמה טיפות של תמיסת טריפסין EDTA. כאשר התאים מתעגלים, השתמשו במיקרוסקופ כדי לשאוב בזהירות כל כדור תאים לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר.

העבירו את כדורי התאים לבארות של הצלחת הקטנה ביותר הזמינה. לאחר מכן הרחב כל שיבוט לפי הצורך כדי למנוע שטף. באמצעות הפרוטוקול המתואר, תאים מיוגניים בודדו יחד עם פיברובלסטים, תאים אדיפוגניים ואולי תאים חיסוניים, ולאחר מכן טוהרו על ידי עובדות.

לאחר מכן התאים עברו אימורטליזציה כמתואר באמצעות וירוסים המבטאים קינאז תלוי ציקלין ארבע, CDK ארבעה וטלומראז אנושי הפוך טרנסקריפטאז h turt. היה חיוני לשמור על המנות מתחת לשטף בכל שלב מכיוון שהן יכלו להיכנס לתוכנית ההתמיינות וליצור צינורות מיו המשווים את היווצרות צינור המיו והתכווצות בתאי בקרה שאינם אימורטליים ובתאים האימורטליים. לא נראו הבדלים.

אלמוות של קו התאים אושר על ידי מדידת אורך הטלומרים ופעילות הטלומרים. אלמוות ניכר גם מעקומות גדילת התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתק תאי שריר ראשוניים מביופסיית המטופל.

להנציח את המיובלסט הראשוני ולבודד ולבחור שיבוטים מיוגניים מונצחים. אל תשכח שעבודה עם וירוס דורשת שימוש בתרבית רקמות ספציפית ובמערכת האוורור המאובטחת. בנוסף, יש להלבין את כל מה שמעורב במניפולציה של הנגיף כגון פיפטות, קצות, כלים, מזרקים ומסננים כדי למנוע זיהום לא רצוי.

חלקיקים נגיפיים עלולים להיות מסוכנים ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.