הכנה ואפיון של SDF-1α-Chitosan-Dextran סולפט חלקיקים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להכין ולאפיין ננו-חלקיקי SD F1 אלפא צ'יה ודקסטרן סולפט. הכנת הננו-חלקיקים מושגת על ידי ערבוב ראשון של גורם הביות של תאי הגזע, פקטור תאי סטרומל אחד אלפא או S df אלפא אחד עם דקסטרן סולפט כדי לאפשר קשירה לגליקן הטעון שלילית. כאוזן שלב שני, גליקן טעון חיובי מתווסף לתערובת ויוצר קומפלקס פולי אלקטרוליטים עם דקסטרן סולפט.

לאחר מכן מוסיפים אבץ גופרתי על מנת לייצב את הקומפלקסים בעזרת גשרי אבץ. לחלקיק שנוצר יש ליבה צפופה המוקפת בקליפה טעונה שלילית. החלקיקים נמדדים לאחר מכן על גודלם ופוטנציאל הזטה שלהם, כמו גם על התוכן והפעילות של S df אחד אלפא בננו-חלקיקים היתרון העיקרי של ננו-חלקיקי ה-SDF אלפא גליקן אחד הוא שה-SDF המשולב אלפא אחד פעיל לחלוטין מבלי להשתחרר מהחלקיקים.

לכן, החלקיקים יכולים להיות שימושיים לשמש כאות הרמין נייח בטיפול בתאי גזע. כדי להתחיל להכין פתרונות מלאי כמתואר בפרוטוקול הטקסט ולעקר אותם באמצעות ממברנות סינון 0.22 מיקרון. העריכו את רמות האנדוטוקסין בתמיסה המוכנה באמצעות בדיקת קריש ג'ל אולו אמבה ציט ליזאט.

ודא שהרמות נמוכות מ-0.06 יחידות אנדוטוקסין למיליליטר. לאחר מכן ב-0.18 מיליליטר מים טהורים במיוחד לבקבוקון זכוכית של 1.5 מיליליטר המכיל מוט ערבוב מגנטי. הגדר את מהירות הערבוב על 800 סל"ד, ואז הוסף 0.1 מיליליטר של 1% דקסטרן סולפט וערבב לאחר שתי דקות.

מוסיפים 0.08 מיליגרם SD F1 אלפא ומערבבים 20 דקות. טיפה מוסיפים 0.33 מיליליטר של 0.1% טיזן ומערבבים חמש דקות. שנה את מהירות הערבוב למקסימום והוסף לאט לאט 0.1 מיליליטר אבץ גופרתי עם מזרק אטום לגז.

מחזירים את מהירות הערבוב ל-800 סל"ד ומערבבים במשך 30 דקות. לאחר מכן מוסיפים 0.4 מיליליטר מניטול 15% ומערבבים לאחר חמש דקות. העבירו את תערובת התגובה לצינור פוגה של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 16, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשתמשו בפיפטה כדי להסיר את טיפת הנוזל האחרונה. הוסף לאט לאט 0.2 מיליליטר מניטול 5% ותלה את הגלולה עם מזרק מחט 0.5 מיליליטר 29 מד. לאחר מכן הוסף מיליליטר נוסף של 5% מניטול לפני הצנטריפוגה.

פעם שנייה ב-16,000 GS למשך 15 דקות. לאחר חזרה על תהליך הצנטריפוגה של השעיית Resus, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-0.2 מיליליטר של 5% מניטול. גודל החלקיקים ופוטנציאל הזטה מנותחים על ידי פיזור אור דינמי ופיזור אור אלקטרופורטי בהתאמה.

כדי להתחיל, בחר נוהל פעולה מרשימת ה-SOP, המכיל פרמטרים למדידת גודל חלקיקים באמצעות פיזור אור דינמי. כפי שמופיע בפרוטוקול הטקסט, יש לדלל את דגימת חלקיקי האלפא SD F1 במים. לאחר מכן טען 100 מיקרוליטר מהדגימה ל-UV Q Vet חד פעמי כגון Einor Q Vet.

הכנס את וטרינר ה-Q למחזיק התא והמתן עד שהתאמת העוצמה תגיע לאופטימלית לפני שתתחיל ברכישת נתונים. לאחר השלמת המדידה, רשום את תוצאות ההצטברות של קוטר ומדד פיזור פולי. ממוצע התוצאות המתקבלות מכל אחת מארבע הקריאות החוזרות וחשב את סטיית התקן למדידת פוטנציאל זטה באמצעות פיזור אור אלקטרופורטי.

טען 500 מיקרוליטר מדגימת החלקיקים המדוללת פי עשרה לתא הזרימה. בחר נוהל פעולה מרשימת ה-SOP הפוטנציאלית של Zeta, המכיל פרמטרים למדידה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. רשום את התוצאות של פוטנציאל הזטה.

לאחר מכן ממוצע את התוצאות המתקבלות מכל אחת מחמש הקריאות החוזרות וחשב את סטיית התקן. מחממים את הדגימות המדוללות של SD F1 alpha חופשי וקשור לחלקיקים במאגר דגימה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מערבולת הדגימות פעמיים במהלך החימום של 10 דקות על מנת להפריד את החלקיקים לחלוטין לאחר קירור הדגימות לטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, לצנטריפוגה היו 10,000 Gs למשך 0.5 עד דקה כדי להוריד את מערבולת עיבוי המים שוב כדי להתערבב היטב.

בשלב זה, פתרון המדגם צריך להיות ברור ללא משקעים נראים לעין. לאחר מכן טען 10 מיקרוליטר של דגימה לבאר לארבעה עד 20% נתרן ESAL סולפט או ג'ל SDS. הפעל אלקטרופורזה ב-200 וולט למשך 20 דקות לפני צביעת הג'ל בכתם חלבון כחול קומאסי.

לבחון את צפיפות פס החלבון של SD F1 alpha באמצעות הדמיה מולקולרית ותוכנת ניתוח דנסיטומטריה. חשב את הכמות של S DF אלפא אחד בחלקיקים כנגד עקומה סטנדרטית שנבנתה עם תקני SDF אחד אלפא חופשיים כדי לבצע את בדיקת השחרור במבחנה תערובת חלקיקי אלפא גליקן SD F1 עם מלח מאגר פוספט דוקוס ללא סידן ומגנזיום או DPBS ביחס של אחד לאחד. חלקו את תרחיף החלקיקים ל-0.05 מיליליטר בצינורות של 1.5 מיליליטר.

טען את הדגימות לתחתית הצינורות. הימנע מהכנסת בועות אוויר או הפרעה לפני השטח של הנוזל. אטום את החלק העליון של הצינורות עם פרפורם.

לאחר מכן סובב את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס על מערבל מיקרו צינורות מסתובב. הסר את האליקוטים מהצינורות בזמנים המיועדים ומיד צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה. הפרד את הסופרנטנטים והכדורים.

לאחר מכן הרכיב מחדש את הגלולה עם 0.05 מיליליטר DPBS. לאחר איסוף כל הדגימות, בדקו את הסופרנטנטים והכדורים על ג'ל SDS. כמו קודם, בדיקה זו מודדת את הפעילות הכימוטקטית של S df.

אינטראקציית אלפא אחת של S df אלפא אחד עם הקולטן שלו גורמת לנדידה של התא לעבר שיפוע אלפא SD F1. כדי להתחיל לדלל צורה חופשית או קשורה לחלקיקים SD F1 alpha עם מאגר הגירה בדילול סדרתי משולש לריכוזים הסופיים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. הוסף 0.6 מיליליטר מתמיסת האלפא SD F1 המדוללת לבאר בצלחת 24 הבארות לבקרה השלילית.

עשה את אותו הדבר עבור מאגר הגירה רק לאחר מכן הוסף 0.57 מיליליטר של מאגר הגירה לבאר לבקרת תאי הקלט. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן הנח תוספת תרבית תאים חדירה כגון transwell על גבי עומס הבאר התחתון 0.1 מיליליטר של תאי כובע מטומטמים לתוך הכנסת הטרנסוול.

לאחר מכן טען 0.03 מיליליטר תאים ישירות לבקרת תא הקלט. ובכן דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים בחממת פחמן דו חמצני של 5%. לאחר הדגירה, הסר את תוספות תרבית התאים.

העבירו את התאים שהיגרו לבארות התחתונות לצינור פוליסטירן של ארבעה מיליליטר. ספרו את התאים שהועברו בעזרת ציטומטר זרימה. לבסוף, חשב את ההגירה כאחוז ממספר תא הקלט לאחר חיסור המספרים בפקדים השליליים.

מוצג כאן הניתוח של מדידת גודל חלקיקי האוזאן SD F1 אלפא דקסטרן סולפט. תוצאת CUMUL מראה שהקוטר ההידרודינמי של החלקיק הוא 671 ננומטר ופיזור הפולי הוא 0.24. צילום מסך זה מציג את אחת מחמש המדידות החוזרות ונשנות של פוטנציאל הזטה של חלקיקי אוזן סולפט גדיל SD F1 אלפא DExT.

פוטנציאל הזטה הוא מינוס 24.7 מילי-וולט. כמות ה-S df אלפא אחת בחלקיקי האוזאן של S df אחד אלפא דקסטרן סולפט מוערכת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל SDS. מוצג כאן ג'ל SDS מוכתם קומאסי עם תקני SD F1 alpha, ננו-חלקיקי בקרת דקסטרן סולפט קאיזן ודגימות ננו-חלקיקים של SD F1 אלפא דקסטרן סולפט קאיזן טעונות.

עקומה סטנדרטית בנויה מניתוח הצפיפות של חישוב רצועות SD F1 Alpha Standard מהעקומה הסטנדרטית מצביע על כך שריכוז ה-S DF אלפא אחד בדגימת ננו-חלקיקי אלפא אחת של SDF הוא 0.03 מיליגרם למיליליטר. כדי לקבוע את קצב השחרור במבחנה של S DF אלפא אחד מהננו-חלקיקים, כמות השחרור של S DF אלפא אחד בסופרנט וכמות החלקיקים הקשורים לחלקיקים אלפא אחד בכדורים נקבעו על ידי צביעת קומאסי של ג'ל SDS ואחריו ניתוח ציטומטריה. הפעילות של החלקיקים הקשורים S DF אלפא אחד נמדדת על ידי בדיקת הגירה ובהשוואה אליה, SDF אחד אלפא חופשי כפי שמוצג כאן.

החלקיקים הקשורים ל-SDF אלפא אחד גרמו לאותה היקף נדידה כמו זה של s DF אחד אלפא חופשי בכל הריכוזים שנמדדו. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שניתן לשנות את הנוסחה של חלקיקי חלבון הגליקן. בהתאם ליישום הספציפי, ניתן לשלב חלבונים אחרים ולהשתמש בתכשירים שונים כדי לשנות את גודל החלקיקים.

אנו מקווים שסרטון זה מדגים את הטכניקות הבסיסיות בהכנה לאיסוף ננו-חלקיקים ולאחר מכן ניתוח פונקציונלי של ה-SDF המשולב אלפא אחד.