Name: הכנה ואפיון של SDF-1α-Chitosan-Dextran סולפט חלקיקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: למדו הכנה ואפיון של ננו-חלקיקים מכילי SDF-1α מדקסטרן סולפט וכיטוזן. השיטה מאפשרת יצירת מערכת משחררת גורם הומינג לתאי גזע לשימוש בטיפולים תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH: HL671795, HL048743, וHL108630.

1. הכנת SDF-1α סוכרי חלקיקים בשל צורך משלוח in vivo, לעקר את כל המכולות, טפטפות, וטיפים לשימוש בתכשיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות המניות הבאות בultrapure מים: 1% סולפט dextran; 1 M NaOH (סטרילי מסונן עם קרום PES); chitosan 0.1% 0.2% בחומצה אצטית קרחונית (מסנן דרך 0.8 ו0.22 מיקרומטר מסננים ברציפות ולהתאים את ה- pH 5.5 עם NaOH לאחר מכן); 0.1 M 4 ZnSO; מניטול 15%; ו0.92 מ&quot;ג / מיליליטר SDF-1α (מאוחסנים בaliquots על 80 מעלות צלזיוס, ושמרו על 4 מעלות צלזיוס מופשרים פעם אחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר פתרונות מניות באמצעות 0.22 מיקרומטר ממברנות סינון. להעריך את רמות רעלן פנימיות בפתרון מוכן עם assay lysate amebocyte Limulus קריש ג&#39;ל (LAL). ודא שהרמות הן &lt;0.06 איחוד אירופי / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.18 מיליליטר מים ultrapure לבקבוקון זכוכית 1.5 מיליליטר מכיל בר ומערבבים מגנטי. קבע את המהירות ומערבבים ב 800 סל&quot;ד. להוסיף 0.1 מיליליטר 1%סולפט וdextran מערבב במשך 2 דקות. להוסיף SDF-1α 0.08 מ&quot;ג (0.087 מיליליטר של 0.92 מ&quot;ג / מיליליטר SDF-1α פתרון) ומערבבים במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.33 מיליליטר 0.1% dropwise chitosan ומערבבים במשך 5 דקות. מהירות שינוי ומערבבים עד למקסימום ולהוסיף 0.1 מיליליטר 0.1 M 4 ZnSO לאט עם מזרק 0.1 מיליליטר (מעל 1 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור במהירות ומערבבים עד 800 סל&quot;ד ומערבבים למשך 30 דקות. להוסיף מניטול 0.4 מיליליטר של 15% ומערבבים במשך 5 דקות. מעביר את תערובת התגובה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה ב16,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: הנוכחות של מניטול מאפשרת resuspension של החלקיקים לאחר צנטריפוגה. בהתאם לקומפקטיות של גלולה, ריכוז מניטול יכול להיות מגוון בין 0% ל -5%. resuspension המלא של החלקיקים לאחר כל צנטריפוגה הוא קריטי כדי למנוע אגרגטים בהשעיה הסופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולהשתמש פיפטה להסיר את הטיפה האחרונה של נוזל לאט. להוסיף מניטול 0.2 מיליליטר 5%. להשעות את גלולה עם 0.5 מיליליטר, לבית 29 Gמזרק DLE. להוסיף מניטול 1 מיליליטר של 5%. צנטריפוגה XG ב 16,000 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. Resuspend גלולה במניטול 0.2 מיליליטר 5%. אחסן את ההשעיה החלקיקים ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: ההשעיה החלקיקים יכולה גם להיות מאוחסנת קפוא ב -80 ° C או lyophilized. מניטול 5% כולל בהשעיה הוא חיוני כדי למנוע הצטברות של החלקיקים לאחר ההקפאה והפשרה או אחרי lyophilization והתייבשות. מניטול ניתן להסיר על ידי צנטריפוגה של ההשעיה לאחר האחסון. </li></ol> 2. מדידה של גודל חלקיקים ופוטנציאל זטה גודל החלקיקים ופוטנציאל זטה מנותחים על ידי פיזור אור דינמי ופיזור אור electrophoretic, בהתאמה, עם נתח של חלקיקים שצוין ברשימת חומר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את הפרמטרים הבאים למדידת גודל חלקיקים: פעמים צבירה: 70; פעמים חוזרות: 4; טמפרטורה: 25 ° C;Diluent: מים; התאמת עוצמת: אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מדגם SDF-1α-DS-CS עם מים (דילול של פי 10). לטעון של המדגם לקובט UV חד פעמי 100 μl כגון קובט אפנדורף. הכנס את קובט לתוך מחזיק התא. חכה להתאמת עוצמת להגיע &quot;אופטימום&quot; (~ 10,000 CPS). התחל רכישת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדידה תושלם, תרשום את תוצאות cumulants של קוטר (ננומטר) ומדד polydispersity. ממוצע התוצאות שהתקבלו מכל אחד 4 הקריאות החוזרות ולחשב את סטיית התקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס 500 μl של מדגם חלקיקים בדילול של פי 10 לתא זרימה למדידת פוטנציאל זטה. להגדיר את הפרמטרים הבאים למדידה: פעמים צבירה: 10; פעמים חוזרות: 5; טמפרטורה: 25 ° C; Diluent: מים; התאמת עוצמת: אוטומטי. רשום את התוצאות של פוטנציאל זטה (mV). ממוצע התוצאות המתקבלות מכל אחד 5 קריאות חוזרות ונשנות, ולחשב את deviatio הסטנדרטיn. </li></ol> 3. כימות של SDF-1α בחלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל צורת SDF-1α חופשיות לריכוזים של 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 ומ&quot;ג / מיליליטר במאגר מדגם 1.3x Laemmli. לדלל דגימות SDF-1α-DS-CS 6 μl עם 1.3x 40 μl חיץ מדגם Laemmli. (הכן את חיץ מניית 4x Laemmli מכיל 0.25 M טריס-HCl, pH 7.5, 8% SDS, גליצרול 40%, 0.05 מ&quot;ג / 8% 2-mercaptoethanol מיליליטר bromophenol כחול, ו. מחלקים את פתרון המניות לתוך aliquots הקטן ולשמור ב -20 ° C לשימוש יחיד.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מערבולת הדגימות פעמיים (כל אחד במשך 10 שניות במהירות המרבית) בזמן חימום 10 דקות על מנת לנתק את החלקיקים לחלוטין. לצנן את הדגימות לRT למשך 2 דקות. צנטריפוגה ב10,000 XG ל0.5-1 דקות כדי להפיל את עיבוי המים. מערבולת שוב לערבב היטב. הערה: בשלב זה, פתרון המדגם צריך להיות ברור שאין הווה משקע גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 ו# 181; l מדגם / גם לג&#39;ל SDS 4-20%. הפעל אלקטרופורזה ב 200 V עבור 20 דקות. כתם ג&#39;ל עם כתם חלבון הכחול Coomassie. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את צפיפות להקת חלבון של SDF-1α באמצעות תוכנת תרמי וניתוח צפיפות מולקולרית. לחשב את כמות SDF-1α בחלקיקים נגד עקומת סטנדרט נבנתה בסטנדרטים SDF-1α חופשיים. </li></ol> 4. במבחנת השחרור Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב חלקיקי סוכרי SDF-1α עם פוספט שנאגרו מלוח של Dulbecco ללא סידן ומגנזיום (D-PBS) בשעה 1: 1 (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את ההשעיה החלקיקים לתוך 0.05 aliquots מיליליטר ב 1.5 מיליליטר צינורות. טען את הדגימות לתחתית הצינורות. הימנע החדרת בועות אוויר או להפריע את פני השטח של הנוזל. לאטום את חלקו העליון של הצינורות עם Parafilm. הערה: בכך, הנוזל יישאר בתחתית בסיבוב העליון לתחתון שלאחר מכן על מיקסר הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הצינורות על 37 ו# 176; C במיקסר מיקרו-Tube סיבוב. הסר aliquots מהצינורות במועדים המיועדים צנטריפוגות מייד הדגימות ב16,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את supernatants וכדורים, ולשקם את הכדור עם 0.05 מיליליטר D-PBS. אחסן את הדגימות ב -20 ° C. אחרי הכל הדגימות שנאספו, לבחון את supernatants וכדוריות על ג&#39;ל SDS כפי שתואר לעיל. </li></ol> 5. ההגירה Assay assay זה מודד את פעילות chemotactic של SDF-1α. אינטראקציה של SDF-1α עם קולטה (CXCR4) על פני התא גורמת להגירה של התא לכיוון שיפוע SDF-1α. ב assay זה, התאים נטענים לתוך היטב עליון (מופרד על ידי קרום semipermeable מנמוך גם) פתרון וSDF-1α לנמוכים גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל SDF-1α (חינם או בצורה מאוגדת חלקיק) עם חיץ הגירה (בינוני RPMI-1640 המכילים 0.5% אלבומין בסרום שור) ב3-FOדילול סדרתי ld לריכוזים סופיים של 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.41, 0.14, 0.05 וng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.6 מיליליטר של פתרון SDF-1α המדולל או חיץ הגירה (בקרה שלילית) רק כדי גם בצלחת 24 גם. הוסף חוצץ הגירה 0.57 מ&quot;ל לטוב (שליטת תא קלט). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הנח להכניס את תרבות תא חדירה כגון Transwell (גודל נקבובית 5 מיקרומטר, בקוטר 6.5 מ&quot;מ) על גבי נמוך גם. טען 0.1 מיליליטר תאי Jurkat (5 × 10 5) לTranswell להכניס. לטעון 0.03 מיליליטר תאים ישירות לשליטת תא הקלט היטב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 ב5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מוסיף Transwell. העבר את התאים שהגרו לבארות התחתונות לצינור קלקר 4 מיליליטר. ספירת התאים נדדו עם cytometer זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב הגירה כאחוז ממספר תאי קלט (מספר תאים בשליטת תא הקלט היטב x 100/30) לאחר החיסור של המספרים בnegative פקדים (תאים היגרו לבארות המכילות מאגר הגירה בלבד). </li></ol>

<ol><li>Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+polyelectrolyte+complexes+of+chitosan+and+dextran+sulfate+towards+versatile+nanocarriers+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules.</a> Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+strategies+for+therapeutic+delivery+by+using+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles.</a> Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).</li>
<li>Yue, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+affects+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+chitosan-based+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).</li>
<li>Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+as+a+therapeutic+stem+cell+homing+factor+in+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction.</a> Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).</li>
<li>Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-derived+factor-1%2FCXCR4+signaling%3A+indispensable+role+in+homing+and+engraftment+of+hematopoietic+stem+cells+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).</li>
<li>Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha-heparin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).</li>
<li>Amara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1alpha+associates+with+heparan+sulfates+through+the+first+beta-strand+of+the+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).</li>
<li>Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate%2Fheparin+oligosaccharides+protect+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29%2FCXCL12+against+proteolysis+induced+by+CD26%2Fdipeptidyl+peptidase+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV.</a> J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).</li>
<li>Yin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+in+glycan+nanoparticles+exhibits+full+activity+and+reduces+pulmonary+hypertension+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).</li>
<li>Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+complexes+stabilize+and+controllably+release+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).</li>
<li>McCall, R. L., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA+nanoparticles+formed+by+single-+or+double-emulsion+with+vitamin+E-TPGS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS.</a> J Vis Exp. (82), 51015(2013).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+synthesis+of+carbohydrates+and+functionalization+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles.</a> J Vis Exp. (65), 3967(2012).</li>
<li>Xu, J., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+delivery+and+transfection+in+human+pancreatic+cancer+cells+using+epidermal+growth+factor+receptor-targeted+gelatin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.</a> J Vis Exp. (59), e3612(2012).</li>
<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כפי שצוין לעיל, נוצרים חלקיקי DS-CS באמצעות נטרול מטען בין polyanion (DS) וpolycation מולקולות (CS). מאז האינטראקציה תשלום מתרחשת בקלות במהלך ההתנגשות המולקולרית, הריכוז של פתרונות הפולימר ומהירות ערבוב במהלך הערבוב הוא קריטי לגודל של החלקיקים שנוצר. מגמה כללית היא שיותר מדוללת פתרונות DS וCS 15 ותוצאת מהירות ערבוב גבוהה יותר בחלקיקים קטנים יותר. גיבוש חלקיקי סוכרי SDF-1α יכול להיות מגוון. לדוגמא, בסכו...

סולפט dextran (DS) וchitosan (CS) הם סוכרים עם מטען שלילי בין מספר קבוצות החליפו סולפט (בDS), או קבוצות האמינים טעונות חיובי (deacetylated CS). כאשר מעורב בתמיסה מימית, שני סוכרים יצירת קומפלקסי polyelectrolyte דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות. המתחמים וכתוצאה מכך עלולים ליצור אגרגטים גדולים שיהיה לשלב מופרדים מהתמיסה המימית (משקעים), או חלקיקים קטנים שמים מסיסים (קולואידים). התנאים הספציפיים שתורמים לתוצאות אלה נחקרו רבים, וכבר סיכמו ומאוירים בפירוט בביקורת האחרונה 1. בין תנאים אלה, שתי דרישות בסיסיות לייצור חלקיקים מסיסים מים חייבים 1) יש לי הפולימרים הטעונים ההפוך מסה טוחנת שונה באופן משמעותי; ו -2) להיות מעורב ביחס הלא stoichiometric. תנאים אלה יאפשר מגזרי פולימרי complexed תשלום ניטראלי שנוצרו על ידי תשלוםנטרול להפריד ויוצר את הליבה של החלקיקים, והפולימרים העודפים כדי ליצור את המעטפת החיצונית 1. חלקיקי הסוכרים שתוארו בפרוטוקול זה נועדו למסירת ריאתי, ונועדו להיות נקי טעונים שלילי, וממדי ננומטר. תשלום המשטח השלילי מפחית את הסבירות של ספיגה התאית של החלקיקים 2,3. חלקיקים של ממד ננומטר להקל על המעבר בדרך נשימת דיסטלי. כדי להשיג מטרה זו, הסכום של DS בשימוש בתכשיר זה הוא בעודף של CS (יחס משקל 3: 1); וגבוה מולקולרי משקל-DS (MW משקל הממוצע 500,000) ומשקל מולקולרי נמוך CS (טווח MW 50-190 kDa, 75-85% deacetylated) משמש. SDF-1α הוא גורם ביות של תאי גזע, אשר מפעיל את פונקצית הביות באמצעות פעילות chemotactic. SDF-1α ממלאים תפקיד חשוב בביות ותחזוקה של תאי גזע hematopoietic במח העצם, ובגיוס של progeתאי nitor לרקמה ההיקפית ל4,5 תיקון פציעה. יש SDF-1α אתר מחייב הפרין ברצף החלבון שלה, המאפשר לחלבון להיקשר להפרין / הפאראן גופרתי, הדימרים צורה, להיות מוגן מפני פרוטאז (CD26 / DPPIV) איון, ואינטראקציה עם תאי מטרה באמצעות קולטנים בתא השטח 6-8. יש DS תכונות מבניות דומות להפרין / הפאראן גופרתי; כך, המחייב של SDF-1α לDS יהיה דומה לזה של ligands פולימרים הטבעי שלה. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את ההכנה של ננו-חלקיקי SDF-1α-DS-CS. הנהלים מייצגים את אחד הניסוחים שנחקרו בעבר 9. הפרוטוקול מותאם במקור מחקירה של חלקיקי VEGF-DS-CS 10. הכנה בקנה מידה קטנה מתוארת, אשר ניתן לשנותם בקלות עם אותו פתרונות המניות ותנאי הכנה. לאחר הכנה, החלקיקים מאופיינים בy בחינת גודלם, פוטנציאל זטה, התאגדות SDF-1α מידה, במבחנה זמן שחרור, ופעילות של SDF-1α המשולבים.

<table><tbody><tr><td>דקסטרן סולפט</td><td>פישר</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>צ'יטוזן, משקל מולקולרי נמוך&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>אבץ גופרתי הפטהידראט</td><td>סיגמא</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-מניטול</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&אלפא;</td><td>הוכן על פי הפניה 8.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק, ממברנת PES 0.22&nbsp; &#956; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>מוטות מיקרו ערבוב מגנטיים (2&nbsp; x&nbsp; 7&nbsp; מ"מ)</td> <td>פישר&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בקבוקון זכוכית; סאן-סרי</td><td>פישר&nbsp;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>מנתח חלקיקים Delsa Nano C&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX ג'ל</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode כחול בטוח חלבון</td><td>כתמי Fisher&nbsp;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>הדמיה מולקולרית VersaDoc MP 4000 מערכת</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell חדיר תומך</td><td>בקורנינג</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent פלוס קיט</td><td>פישר</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה ואפיון של sdf-1α-chitosan-dextran סולפט חלקיקים

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) ו-dextan sulfate (DS) הם פוליסכרידים טעונים (גליקנים), היוצרים ננו-חלקיקים מבוססי קומפלקס פוליאלקטרוליטים כאשר הם מעורבבים בתנאים מתאימים. ננו-חלקיקי הגליקן הם נשאים שימושיים לגורמי חלבון, המאפשרים אספקה in vivo של החלבונים ושומרים על שמירתם ברקמה הממוקדת. מתחמי הפוליאלקטרוליטים הגליקניים אידיאליים גם לאספקת חלבונים, שכן השילוב מתבצע בתמיסה מימית, מה שמפחית את הסבירות להשבתת החלבונים. חלבונים עם אתר קשירת הפרין נצמדים לדקסטרן סולפט בקלות, והם בתורם מיוצבים על ידי הקשירה. חלקיקים אלה גם פחות דלקתיים ורעילים כאשר הם מועברים in vivo. בפרוטוקול המתואר להלן, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), גורם ביות של תאי גזע, מעורבב תחילה ומודגר עם דקסטרן סולפט. צ'יטוזן מתווסף לתערובת ליצירת קומפלקסים פוליאלקטרוליטים, ואחריו אבץ גופרתי לייצוב הקומפלקסים עם גשרי אבץ. חלקיקי SDF-1α-DS-CS המתקבלים נמדדים עבור גודל (קוטר) ומטען פני השטח (פוטנציאל זטה). נקבעת כמות ה-SDF-1α המשולבת, ואחריה מדידות של קצב השחרור שלו במבחנה ופעילותו הכימוטקטית בצורה קשורה לחלקיקים.

פוטנציאל הגודל וzeta של חלקיקי SDF-1α-DS-CS מוכנים נקבעים עם מנתח חלקיקים. איור 1 מציג את הניתוח של מדידת הגודל. מהתוצאות שהתקבלו מcumulants ארבע מדידות חוזרות, הקוטר הידרודינמית הממוצע של חלקיקי SDF-1α-DS-CS הוא 661 ± 8.2 (ננומטר) וpolydispersity הוא 0.23 ± 0.02. התוצאה של מדידת פוטנציאל זטה מוצגת באיור 2. מחמש מדידות חוזרות, פוטנציאל זטה של חלקיקי SDF-1α-DS-CS הוא -24.8 ± 0.5 mV. כפי שצוין לעיל, הנוכחות של מניטול 5% בהשעית חלקיקי SDF-1α-DS-CS הי...

מטרת פרוטוקול זה היא לשלב SDF-1α, גורם ביות של תאי גזע, בננו-חלקיקי דקסטרן סולפט-צ'יטוזן. החלקיקים המתקבלים נמדדים לפי גודלם ופוטנציאל הזטה שלהם, כמו גם התוכן, הפעילות וקצב השחרור במבחנה של SDF-1α מהננו-חלקיקים.

הכנה ואפיון של SDF-1α-Chitosan-Dextran סולפט חלקיקים

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להכין ולאפיין ננו-חלקיקים של SDF-1 Alpha ודקסטראן סולפט. הכנת הננו-חלקיקים מתבצעת תחילה על ידי ערבוב של הגורם המגייס תאי גזע, stromal cell derived factor one alpha או SDF-1 alpha, עם דקסטראן סולפט כדי לאפשר קישור לגליקן בעל מטען שלילי. כשלב שני, מתווסף לתערובת אוזאן, גליקן בעל מטען חיובי, המגבש קומפלקס פולי-אלקטרוליט עם דקסטראן סולפט.בשלב הבא מוסיפים אבץ סולפט על מנת לייצב את הקומפלקסים באמצעות גשרי אבץ. החלקיק המתקבל בעל ליבה צפופה המוקפת במעטפת בעלת מטען שלילי. לאחר מכן נמדדים גודל החלקיקים ופוטנציאל הזטא שלהם, כמו גם התוכן והפעילות של SDF-1&#945; בתוך הננו-חלקיקים. היתרון המרכזי של ננו-חלקיקי גליקן SDF-1&#945; הוא ש-SDF-1&#945; המוטמע פועל במלואו ללא צורך בשחרור מהחלקיקים.לפיכך, החלקיקים עשויים להועיל כסימון קבוע להרמין (hermine) בטיפול בתאי גזע. לתחילתה, הכינו תמיסות מלאי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב ועקרו אותן באמצעות ממברנות סינון של 0.22 micron. העריכו את רמות האנדוטוקסין בתמיסה שהוכנה באמצעות בדיקת gel clot של ulu amoeba cyte lysate.וודאו שהרמות נמוכות מ-0.06 יחידות אנדוטוקסין למילליטר. לאחר מכן, הוסיפו 0.18 מיליליטר של מים אולטרא-טהורים למבחנה מזכוכית בנפח 1.5 מיליליטר המכילה מוט ערבוב מגנטי. הגדירו את מהירות הערבוב ל-800 RPM, לאחר מכן הוסיפו 0.1 מיליליטר של 1% dextran sulfate וערבבו למשך שתי דקות.הוסיפו 0.08 milligrams של SD F1 alpha וערבבו למשך 20 דקות. הוסיפו בטיפות 0.33 milliliters של 0.1%tizen וערבבו למשך חמש דקות. שנו את מהירות הערבול למקסימום והוסיפו לאט 0.1 milliliters של zinc sulfate באמצעות מזרק אטום לגז.החזירו את מהירות הערבוב ל-800 RPM וערבבו למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 0.4 milliliters של 15% mannitol וערבבו לאחר חמש דקות. העבירו את תערובת התגובה למבוב צנטריפוגה (fuge tube) בנפח 1.5 milliliter וסובבו במהירות של 16, 000 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך 10 דקות.לאחר הצנטריפוגציה, שאבו את הנוזל העליון והשתמשו בפיפטה כדי להסיר את טיפת הנוזל האחרונה. הוסיפו לאט 0.2 milliliters של 5%mannitol והשעיקו את המשקע בעזרת מזרק עם מחט gauge 29 בנפח 0.5 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד נוסף של 5%manitol לפני הצנטריפוגציה.פעם שנייה ב-16,000 GS למשך 15 דקות. לאחר חזרה על תהליך הצנטריפיגציה של תרחיף ה-Resus, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) וסספנדו מחדש את המשקע ב-0.2 milliliters של 5% mannitol. גודל החלקיקים ופוטנציאל זטא מנותחים באמצעות פיזור אור דינמי ופיזור אור אלקטרופורטי, בהתאמה.כצעד ראשון, בחרו הליך פעולה מרשימת ה-SOP, המכילה פרמטרים למדידת גודל חלקיקים באמצעות פיזור אור דינמי. כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב, דללו את דגימת חלקיקי SD F1 alpha במים. לאחר מכן, העמיסו 100 µL מהדגימה לתוך קוביית UV Q Vet חד-פעמית, כגון Einor Q Vet.הכנס את ה-Q vet למחזיק התאים והמתן עד שכיול העוצמה יגיע לאופטימום לפני תחילת רכישת הנתונים. לאחר השלמת המדידה, רשום את התוצאות המצטברות של הקוטר ומדד הפולי-דיספרסיות (poly dispersity index). חשב את הממוצע של התוצאות שהתקבלו מארבע קריאות חוזרות וחשב את סטיית התקן למדידת פוטנציאל זטא באמצעות פיזור אור אלקטרופורטי.העבירו 500 µL של דגימת החלקיקים המדוללת פי עשרה לתא הזרימה. בחרו הליך הפעלה מרשימת ה-SOP של פוטנציאל זטא, המכילה את פרמטרי המדידה כפי שמופיעים בפרוטוקול הכתוב. רשמו את תוצאות פוטנציאל הזטא.לאחר מכן, חשבו את הממוצע של התוצאות שהתקבלו מחמש הקריאות החוזרות וחשבו את סטיית התקן. חממו את הדגימות המדוללות של SD F1 alpha החופשי והקשור לחלקיקים בבופר דגימות Laemmli בטמפרטורה של 100 °C למשך 10 דקות. בצעו ערבוב במערבל Vortex פעמיים במהלך החימום בן 10 הדקות כדי להבטיח דיסוציאציה מלאה של החלקיקים. לאחר קירור הדגימות לטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, סובבו במערכת צנטריפוגה ב-10,000 G למשך 0.5 עד דקה אחת כדי לשקיע את העיבוי של המים, וערבבו שוב ב-Vortex למיזוג מלא.בשלב זה, תמיסת הדגימה צריכה להיות צלולה וללא משקע נראה לעין. לאחר מכן, טענו 10 µL של דגימה לכל באר לג'ל sodium ESAL sulfate או SDS בריכוז של 4% עד 20%. הריצו אלקטרופורזה במתח של 200 V למשך 20 דקות, לפני צביעת הג'ל בצבע חלבונים kumasi blue.בחן את צפיפות פס הפרוטאין של SDF-1&alpha; באמצעות מדמייunary מולקולרי ותוכנה לניתוח דנסיטומטריה. חשב את כמות ה-SDF-1&alpha; בחלקיקים ביחס לעקומת סטנדרט שנבנתה עם סטנדרטים של SDF-1&alpha; חופשי כדי לבצע את בדיקת השחרור in vitro. ערבב חלקיקי גליקן של SDF-1&alpha; עם תמיסת DPBS (docos phosphate buffered saline) ללא סידן ומגנזיום ביחס של 1:1. חלק את תרחיף החלקיקים למנות של 0.05 milliliters במבחנות של 1.5 milliliters.העבירו את הדגימות לתחתית המבחנות. הימנעו מהכנסת בועות אוויר או מהפרעה למשטח הנוזל. אטמו את חלקי העליון של המבחנות עם פאראפילם.לאחר מכן, סובב את המבחנות בטמפרטורה של 37 °C באמצעות מערבל מבחנות מיקרו מסתובב. השג תתי-דגימות מהמבחנות בזמנים שנקבעו וצנטריפו באופן מיידי את הדגימות ב-16,000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. עם סיום הצנטריפוגה, הפרד את העל-סחף (supernatants) מהמשקעים (pellets).לאחר מכן, השחו את המשקע באמצעות 0.05 milliliters של DPBS. לאחר איסוף כל הדגימות, בחנו את העל-משקים והמשקעים על ג'ל SDS. כפי שצוין קודם לכן, בדיקה זו מודדת את הפעילות הכיmotקטית של S df.אינטראקציה אחת של SDF-1$\alpha$ עם הרצפטור שלו גורמת לנדידת התא לעבר מדרג הריכוזים של SDF-1$\alpha$. כדי להתחיל, דללו SDF-1$\alpha$ בצורתו החופשית או הקשורה לחלקיקים בעזרת באפר נדידה בדילול סדרתי פי שלושה עד לריכוזים הסופיים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. הוסיפו 0.6 milliliters של תמיסת SDF-1$\alpha$ המדוללת לבאר בלוח 24 בארות עבור הביקורת השלילית.בצעו את אותו הדבר עבור תמיסור ההגירה בלבד, ולאחר מכן הוסיפו 0.57 milliliters של תמיסור הגירה לבאר המשמשת כביקורת תאי קלט. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות. לאחר מכן, מקמו מעל לבאר התחתונה סרט תרבית תאים חדיר, כגון transwell, והעמיסו 0.1 milliliters של תאי jerk hat אל תוך סרט ה-transwell.לאחר מכן, העבירו 0.03 milliliters של תאים ישירות לבקרת תאי הקלט (input cell control). דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים באינקובטור עם 5% carbon dioxide. עם סיום הדגירה, הוציאו את תבניות תרבית התאים (cell culture inserts).העבירו את התאים שנדנדו לבארות התחתונות למבחנה פוליסטירן של ארבעה מיליליטר. ספרו את התאים שנדנדו באמצעות ציטומטר זרימה. לבסוף, חשבו את הנידוד כאחוז ממספר התאים ההתחלתו (input), לאחר חיסור המספרים בביקורות השליליות.כאן מוצגת האנליזה של מדידת גודל החלקיקים של SD F1 alpha dextran sulfate ozan. תוצאת ה-CUMUL מראה שהקוטר ההידרודינמי של החלקיק הוא 671 nanometers והפולי-דיספרסיה (poly dispersity) היא 0.24. צילום מסך זה מציג אחת מחמש המדידות החוזרות של פוטנציאל הזטא (zeta potential) של חלקיקי SD F1 alpha DExT strand sulfate ozan.פוטנציאל הזטא הוא 24.7- מיליוולט. כמות ה-S df one alpha בחלקיקי S df one alpha dextran sulfate ozan מוערכת באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל SDS. מוצג כאן ג'ל SDS שנצבע ב-kumasi, עליו הועמסו סטנדרטים של SD F1 alpha, דגימות של ננו-חלקיקי בקרה מסוג dextran sulfate kaizan ודגימות של ננו-חלקיקי SD F1 alpha dextran sulfate kaizan.עקום סטנדרט נבנה מניתוח הצפיפות של פסי ה-SD F1 Alpha Standard; חישוב מהעקום הסטנדרטי מצביע על כך שריכוז ה-S DF one alpha בדגימת ננו-חלקיקי SDF one alpha הוא 0.03 mg/mL. כדי לקבוע את קצב השחרור in vitro של S DF one alpha מהננו-חלקיקים, נקבעה כמות ה-S DF one alpha השתחררה לסביבון (supernatant) וכמות ה-sdf one alpha הקשור לחלקיקים במשקעים (pellets) באמצעות צביעת Coomassie של ג'ל SDS, ולאחריה ניתוח ציטומטרי. הפעילות של S DF one alpha הקשור לחלקיקים נמדדת באמצעות בדיקת נדידה (migration assay) ומושווה לזו של SDF one alpha חופשי, כפי שמוצג כאן.SDF-1$\alpha$ הקשור לחלקיקים השראה את אותה רמת נדידה כמו SDF-1$\alpha$ חופשי בכל הריכוזים שנמדדו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שניתן לשנות את הרכבם של חלקיקי הגליקן-חלבון. בהתאם ליישום הספציפי, ניתן לשלב חלבונים אחרים ולהשתמש בהרכבים שונים כדי לשנות את גודל החלקיקים.אנו מקווים שסרטון זה הדגים את הטכניקות הבסיסיות להכנה של איסוף ננו-חלקיקים ולאחר מכן ניתוח תפקודי של SDF-1α המוטמע.

preparation-characterization-sdf-1-chitosan-dextran-sulfate

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

המכשול העיקרי בתא טיפולים שוטפים גזע הוא לקבוע את השיטה היעילה ביותר, כדי לספק תאים אלה לרקמות המארחות. כאן אנו מתארים שיטה chitosan מבוסס משלוח יעיל ופשוט של הגישה, תוך מתן אפשרות השומן שמקורם בתאי גזע כדי לשמור על multipotency שלהם.

בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

פרוטוקול זה מתמקד ניצול היכולת הטמונה בתאי גזע כדי לקחת את המקל מ מטריקס הסובבת אותם תאי ו להיגרם להתמיין פנוטיפים רבים. זה כתב היד שיטות משתרע תיאור שלנו ואפיון של המודל ניצול הידרוג bilayered, המורכבת PEG-הפיברין וכן קולגן, בו זמנית לשתף להבדיל השומן שמקורם בתאי...

הנדסת Hydrogel Bilayered לשלוט בידול ASC

Free Free solution אלקטרופורזה נימית היא שיטה אנליטית מהירה, זולה וחזקה המאפשרת ניטור כמותי של תגובות כימיות בזמן אמת. התועלת שלו לניתוח מהיר, נוח ומדויק מודגמת כאן באמצעות ניתוח השתלת פפטיד קוולנטי על סרטי צ'יטוזן לשיפור הידבקות התאים.

אלקטרופורזה הנימים לפקח פפטיד האריך על Chitosan סרטים בזמן אמת

Homogenization פשוט שימש להכנת רומן, צפיפות גבוהה, lipoprotein- חיקוי חלקיקים כדי לתמצת את גורם הגדילה העצבים. אתגרים, פרוטוקולים מפורטים להכנת nanoparticle, אפיון במבחנה , וכן ב vivo מחקרים מתוארים במאמר זה.

הכנה ואפיון של נוזל HDL מחקה ננו-חלקיקים עבור אנקפסולציה גורם העצב הגדילה

כאן נתאר להכנת נתיישב hydrogels להזרקה מבוסס משקם באמצעות הכימיה אימין דינמי. שיטות להתאמת חוזק מכני של הידרוג ויישומה בתרבות תא 3D מוצגים.

הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לסינתזה של היפרדות כונדרויטין סולפט א איגוד פפטיד (plCSA-BP)-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים באמצעות צעד אחר צעד sonication bioconjugate וטכניקות. חלקיקים אלה מהווים כלי הרומן למסירה יישוב של הרפוי גידולים האנושי ביותר, היפרדות trophoblasts לטיפול סרטן והפרעות היפרדות.

סינתזה ואפיון של היפרדות כונדרויטין גופרתי (plCSA) - מיקוד השומנים - חלקיקי הפולימר

מאמר זה מתאר את ומגעים falcarindiol ב מצופים השומנים חלקיקים nm 74. ספיגת הסלולר של חלקיקים באמצעות תאי גזע אנושי לתוך טיפות השומנים מנוטרת על ידי הדמיה פלורסנט, קונפוקלי. חלקיקים מיוצרים בשיטת הזרקת מהירה של הממס הסטה, הגודל שלהם נמדד עם טכניקה פיזור אור דינאמי.

ספיגת של חלקיקים חדשים מצופים השומנים, המכיל Falcarindiol על ידי גזע אנושי Mesenchymal

שיטת ההקפאה משמשת להפקת הידרוג'לים chitosan-פולי (ויניל אלכוהול) ללא סוכנים מקושרים. עבור שיטה זו, חשוב לשקול את תנאי ההקפאה (טמפרטורה, מספר מחזורים) ויחס פולימרי, אשר יכול להשפיע על המאפיינים והיישומים של הידרוג'לים שהתקבלו.

שיטת הקפאת-הפכנף כדי להכין Chitosan-פולי (ויניל אלכוהול) ללא מקשר בין סוכנים ומחקרים שחרור Diflunisal

מחקר זה מתאר שיטה להרחיב את הכיטין לקצף על ידי טכניקות כימיות שאינן דורשות ציוד מיוחד.

הכנת קצף כיטין מורחב ושימוש בהם בהסרת נחושת מימית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה שאינה מבוססת על תחליב לייצור מיקרוגלים של צ'יטוזן-גניפין. ניתן לשלוט במדויק בגודלם של המיקרוג'לים האלה, והם יכולים להציג נפיחות תלוית pH, לפרק in vivo ולהיות עמוסים במולקולות טיפוליות שמשחררות לאורך זמן באופן מתמשך, מה שהופך אותם לרלוונטיים מאוד ליישומים של הנדסת רקמות.

ייצור של מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות

למדו הכנה ואפיון של ננו-חלקיקים מכילי SDF-1α מדקסטרן סולפט וכיטוזן. השיטה מאפשרת יצירת מערכת משחררת גורם הומינג לתאי גזע לשימוש בטיפולים תאיים.

הכנה ואפיון של SDF-1α-Chitosan-Dextran סולפט חלקיקים

גלה סרטונים נוספים