משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון שינויים במטען ממברנת התא לאחר היצמדות לתתי-מצעים מחומרים שונים. מטרה זו מושגת על ידי גידול המיקרואורגניזמים במצע עשיר בתוספי תזונה כדי להגדיל את מספרם. לאחר מכן, משטחי החומרים שאליהם ייצמדו המיקרואורגניזמים מנוקים ועוברים פונקציונליזציה כדי להבטיח שיעורי היצמדות מיקרוביאלית אופטימליים.

לאחר מכן, המיקרואורגניזמים נזרעים על תתי-מצעים שונים של חומרים כדי לאפשר דימות באמצעות מיקרוסקופיית כוח של גשושון קלווין (KPFM). התוצאות מראות כי לסוג תת-מצע החומר ולמטען המולד שלו יש השפעה על הפעילות התאית, כפי שניתן לראות בשינויים במטען ממברנת התא ובהיצמדות התאים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגוןהסמכה אלקטרופורטית, פיזור אור וקביעת נקודת איזו-אלקטרית, הוא ש-KPFM מאפשרת בחינה של המטען של תאים בודדים וביופילמים במקום של תרביות או מושבות שלמות.

דבר זה מועיל כאשר ברצונכם להשוות מאפיינים חשמליים של תאים בודדים ושל ביופילם בדיוק וברגישות גבוהים. ראשית, הכינו מצעי אגר דם כבשים בריכוז 5%, זרעו עליהם את חיידשיי ה-MRSA והדגירו אותם למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C כדי להנבט מושבות בודדות ומבודדות. הכינו 500 milliliters של triptych soy broth, מועשר ב-1% glucose ו-0.1% sodium chloride, והעבירו באוטוקלב יחד עם שתי מבחנות זכוכית נקיות וקופסה אחת של טיפים לפיפטות של one milliliter.

לאחר שהמצע ושפופרות הבחינה התקררו תחת מCב בטיחות ביולוגית או ליד מבער בונסן, העבירו בפיפטה שש milliliters של TSB לכל שפופרת בחינה. באמצעות אחד ממוצאי צלחות האגר עם דם כבשים שהוכנו קודם לכן, זרקו מושבה בודדת של MRSA לאחת השפופרות. השתמשו בשפופרת השנייה כביקורת שלילית כדי להבטיח סטריליות. דגרו את השפופרות באינקובטור סיבובי למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובמהירות של 200 RPM.

במבחנה של ה-MRSA צמיחה צריכה להיות נראית, או שלא צריכה להיות צמיחה כלל במבחנת הביקורת. לאחר מכן, צרו תרבית משנית על ידי שימוש ב-1 mL מהתרבית בת 24 השעות כדי להזהיר 6 mL של מצע tryptic soy broth טרי, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 200 RPM למשך שש שעות נוספות. לאחר מכן, העבירו בפיפט 1 mL מהתרבית למבחנת centrifuge וסבבו ב-850 ×g למשך שלוש דקות.

הסיר את הנוזל העליון והשתמש במים דה-יוניים כדי לשטוף את המשקע פעמיים בעזרת פינצטה ביד הדומיננטית. החזק דיסקיות דגימה FM מפלדת אל חלון בקוטר 20 מילימטר והשתמש ב-5 מיליליטר מים דה-יוניים כדי לנקות כל צד. הנח את הדיסקיות הנקיות לתוך כלי כימי עם מים דה-יוניים ובצע סוניקציה למשך דקה אחת לאחר מכן.

השתמשו בפינצטה כדי להוציא את דיסקיות הדגימה מהכלי והניחו אותן בזווית של כ-60 מעלות נגד דופןה של צלח פטרי פתוח על גבי נייר סופג. כדי לייבש לחלוטין, השתמשו במכסה של הצלח כדי לכסות את הדיסקיות המתייבשות. לאחר הייבוש, העבירו את הדיסקיות לצלח פטרי כדי לבצע פונקציונליזציה של פני השטח של הדיסקית. העבירו בפיפטה 200 עד 400 µL של 0.1% polyol lysine על הדיסקיות בתוך מabilis בטיחות ביולוגית, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, תוך שימוש בפינצטה להחזקת הדיסקיות.

השתמשו במים דאיוניים כדי לשטוף אותם כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר מכן, טפטפו 200 עד 400 µL של תרחיף תאים שנשטפו פעמיים על גבי דיסקי הדגימה המצופים. לאחר דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, השתמשו בזהירות ב-1 mL של מים דאיוניים כדי לשטוף את הדיסקים.

הניחו לדיסקיות להתייבש למשך לילה לפני ביצוע הדמיה באמצעות מיקרוסקופיית כוח פרובה קלווין (Kelvin Probe Force microscopy). הפעילו את המחשב יחד עם מיקרוסקופ הכוח האטומי או ה-AFMs, ה-HEB ובקר ה-MAC three. פתחו תוכנת הדמיה של AFM, כגון Ulence P ovu overview.

בחרו ב-A-C-A-F-M או בסימון הנכון עבור דימיון במצב מגע לסירוגין (intermittent contact mode). בעזרת פינצטה מסוג FM ביד הדומיננטית והחזקת תפס הקפיץ פתוח ביד השנייה, מקמו בזהירות את הבלתי-עביר (cantilever) מסוג A-K-P-F-M בתוך ראש המכשיר. הכניסו בזהירות את ראש המכשיר לתוך ה-A FM וחברו את חוטי תאורת הלייזר ואת חוטי מנוע הרמת הבמה.

לאחר מכן, כוון את הלייזר אל קצה הקנטילבר. כדי לכוון את הלייזר אל קצה הקנטילבר, סובב את כפתור ההזזה קדימה-אחורה עם כיוון השעון מספר פעמים כדי להזיז את הלייזר אל מעל השבב של הקנטילבר.

כאשר הלייזר מגיע לשבב, הוא ייחסם ולא יהיה נראה יותר. לאחר מכן, סובב את כפתור ההזזה קדימה-אחורה נגד כיוון השעון עד לופעתו המחודשת של נקודת הלייזר. כעת הלייזר נמצא על קצה השבב.

סובב את כפתור התכוון משמאל לימין כדי למקם את הלייזר על הקנטילבר (cantilever). כאשר הלייזר יעבור מעל הקנטילבר, הוא ייעלם ויחזור להופיע ברצף מהיר. נקודת הלייזר צריכה להיות גלויה במכסה הזכוכית המט, שבה תמוקם מאוחר יותר יחידת הפוטודיודה.

סובבו את כפתור התנועה קדימה-אחורה נגד כיוון השעון כדי להזיז את הנקודה במורד הקנטילבר לכיוון הקצה, עד שהנקודה על הזכוכית המטועה נעלמת. כעת סובבו את כפתור התנועה קדימה-אחורה עם כיוון השעון רק מעט, כדי למקם את הלייזר כך שיישב בדיוק על קצה הקנטילבר; נקודת הלייזר תופיע שוב על הזכוכית המטועה. לאחר יישור הלייזר, החזיקו את מנוע הרמת הבמה במצב פתוח למשך 10 שניות כדי להבטיח מספיק מרווח בין הקנטילבר לדגימה.

בעת חיבור הדגימה ל-A FM, הניחו כעת את הדגימה על במה של ה-KPFM. השתמשו בחוט נחושת כדי להביא את הדגימה לפוטנציאל אפס (ground) וחברו את החוטים המתאימים מה-A FM לבמת הדגימה. לאחר מכן, חברו את הבמה ל-A FM בתוכנת ה-A FM.

יש לוודא שזמן ההתייצבות (setting time) אינו עולה על 10 milliseconds ושמהירויות ההתקרבות אינן עולות על שתי microns לשנייה. כדי למנוע נזק לקולב, כוון את הקנטיליוור והתחל להניע את קצה הקנטיליוור לעבר הדגימה. ברגע שקצה הקנטיליוור מגיע למשטח הדגימה, בחר את גודל חלון הדמיון ואת אזור הדמיון האידיאלי, ואופטימיז את הגבריים (gains) של ה-I וה-P יחד עם נקודת היעד (set point) של הקנטיליוור, כך שהדמיון הטופוגרפי יהיה אופטימלי.

כאשר הדמיה טופוגרפית מותאמת באופן אופטימלי, הפעילו את מודול ה-KPFM במצב FM. הגדירו את חלון ההדמיה ל-5 µm על 5 µm עם רזולוציה של 512 על 512 או מהירויות סריקה איטיות. עבור הגדרות FM KPFM, הגדירו את ה-drive בין 5% ל-10%. הגדירו את תדר ה-drive לטווח שבין 1 ל-5 kHz עם רוחב פס של 2 kHz.

הגדירו את הגבֶר של ה-iron NP עבור ה-F-M-K-P-F-M ל-0.3%. לאחר השגת תמונות KPFM, השתמשו בתוכנה לעיבוד תמונות לאחר הצילום כדי לנתח את התמונות ולאסוף נתוני SP באמצעות ההגדרות המתוארות בסרטון הדגמה זה. תמונות KPFM צולמו של 15 תאי MRSA הן על משטחי פלדה אל-חלודה והן על משטחי זהב. כאן מוצגים סוגי התמונות שנאספו.

מכיוון ש-KPFM פועל באמצעות תדרים כפולים, נאספו בו-זמנית תמונות טופוגרפיות ונתונים חשמליים של פני השטח של התא. מסננים תרמיים הוחלו על מפות הפוטנציאל של פני השטח כדי להבחין בקלות רבה יותר בשינויים קטנים בפוטנציאל פני השטח. בגרף זה, נותחו התמונות כדי לקבוע את פוטנציאל פני השטח של ממברנת המיקרובים, ולאחר מכן שימשו להשוואה של צמיחה על תת-מצעים שונים.

סריקות פוטנציאל פני השטח של מצעי הפלדה אל-חלודה והזהב ללא ציפוי הראו פוטנציאלי פני שטח שליליים באופן כללי. דיסקים של פלדה אל-חלודה וזהב מצופים ב-Polyol lysine הראו שניהם מעבר לפוטנציאלי פני שטח חיוביים. פוטנציאלי ממבנה התא של MRSA השתנו בין פני השטח של הפלדה אל-חלודה לזהב.

הפלדת אל-חלד הראתה פוטנציאל פני שמשטח ממברנה חיובי גדול משמעותית עבור תאים, בהשוואה לתאי MRSA על מצע הזהב שהראו פוטנציאלי שטח שליליים. כדי להדגים את מלוא היכולות של KPFM, מוצגת כאן דוגמה לגרף גובה מדרגה של MRSA על פלדת אל-חלד. גרף זה מראה את ההבדל בפוטנציאל השטח בין פני המצע לבין הממברנה המיקרוביאלית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה באופן שבו ניתן להשתמש במיקרוסקופיית כוח עם גשש קלווין (Kelvin probe force microscopy) כדי לבחון את השפעות המטען החשמלי על היצמדות תאי מיקרוביאליים ועל פעילותם על פני שטח של תתי-מצעים מחומרים שונים.