משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לצפות בשינויים במטען קרום התא לאחר היצמדות למצעי חומר שונים. זה מושג על ידי גידול המיקרואורגניזמים במדיום עשיר בחומרים מזינים כדי להגדיל את מספרם. לאחר מכן, משטחי החומר שהמיקרואורגניזמים ידבקו בהם מנוקים ומתפקדים לשיעורי התקשרות מיקרוביאליים אופטימליים.

לאחר מכן המיקרואורגניזמים מצופים על מצעי החומר השונים כדי לאפשר מיקרוסקופ כוח בדיקה של קלווין או הדמיית KPFM. התוצאות מראות כי לסוג המצע של החומר ולמטען הטבוע בו יש השפעה על פעילות התא כפי שניתן לראות על ידי שינויים במטען קרום התא ובהיצמדות התאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלקטרופורטית, פיזור אור וקביעת נקודה איזואלקטרית הוא ש-KPFM מאפשר לבחון את המטען של תאים בודדים וביופילמים במקום תרביות או מושבות שלמות.

זה מועיל כאשר רוצים להשוות תא לתא כמו גם מאפיינים חשמליים של ביופילם בדיוק ודיוק גבוהים. כדי להתחיל, הכינו 5% צלחות אגר דם של כבשים מפספסות את חיידקי ה-MRSA על הצלחות המוכנות ודוגרות במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי ליצור מושבות בודדות היטב. הכינו 500 מיליליטר של מרק סויה טריפטיכון, בתוספת חיטוי של 1% גלוקוז ו-0.1% נתרן כלורי, יחד עם שתי מבחנות זכוכית נקיות וקופסה אחת של לגימות פיפטה של מיליליטר.

לאחר שאפשרתם למדיום ולמבחנות להתקרר מתחת לארון בטיחות ביולוגית או ליד לחמניות ומבער, פיפטה שישה מיליליטר של ה-TSB לכל מבחנה. בעזרת אחת מצלחות אגר הדם של הכבשים שהוכנו בעבר, חסנו מושבה אחת של MRSA לתוך אחד הצינורות. השתמש בצינור השני כבקרה שלילית כדי להבטיח סטריליות לדגור את הצינורות בחממה הדדית למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד.

צינור ה-MRSA אמור להראות צמיחה או ששום דבר לא היה צריך לצמוח במבחנת הביקורת. לאחר מכן, צור תת-תרבות על ידי שימוש במיליליטר אחד מהתרבית של 24 שעות כדי לחסן שישה מיליליטר של מרק סויה טריפטי טרי ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך שש שעות נוספות. לאחר מכן פיפטה מיליליטר אחד של התרבית לתוך צינור אפוס וצנטריפוגה ב 850 פעמים G למשך שלוש דקות.

הסר את הסופינט והשתמש במים נטולי יונים כדי לשטוף את הכדור פעמיים עם מלקחיים ביד הדומיננטית. החזק נירוסטה 20 מילימטר דיסק דגימת FM והשתמש בחמישה מיליליטר מים נטולי יונים כדי לנקות כל צד. הנח את הדיסקים הנקיים בכוס מים נטולי יונים וסוניקט למשך דקה אחת לאחר הסוניקציה.

השתמש במלקחיים כדי להסיר את דיסקיות הדגימה מהכוס והשען אותם בזווית של כ-60 מעלות כנגד קצה צלחת פטרי פתוחה על מגבת נייר לייבוש מלא השתמש במכסה הכלי כדי לכסות את דיסקיות הייבוש. לאחר הייבוש, העבירו את הדיסק לצלחת פטרי כדי לתפקד את פני הדיסק. פיפטה 200 עד 400 מיקרוליטר של 0.1% פוליאול ליזין על הדיסקים בארון בטיחות ביולוגית וטמפרטורת החדר מודגרת למשך שעה באמצעות מלקחיים להחזקת הדיסקים.

השתמש במים נטולי יונים כדי לשטוף אותם כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. הצלחת הבאה, 200 עד 400 מיקרוליטר של תאים תלויים שנשטפו פעמיים על דיסקיות הדגימה המצופות. לאחר דגירה של טמפרטורת החדר למשך 30 דקות, השתמש בעדינות במיליליטר אחד של מים נטולי יונים כדי לשטוף את הדיסקים.

הניחו לדיסקים להתייבש למשך הלילה לפני ההדמיה כדי לבצע הדמיית מיקרוסקופיה של Kelvin Probe Force. הפעל את המחשב יחד עם מיקרוסקופ הכוח האטומי או AFMs, בקר HEB ו-MAC שלוש. פתח תוכנת הדמיה A FM כגון Ulence P ovu overview.

בחר A-C-A-F-M או את הייעוד הנכון להדמיה במצב מגע לסירוגין. בעזרת מלקחיים FM ביד הדומיננטית והחזקת מחזיק הקליפ הקפיץ פתוח ביד השנייה, הנח בזהירות שלוחה A-K-P-F-M לתוך כיסוי הראש. טען בזהירות את כיסוי הראש לתוך A FM וחבר את אור הלייזר ואת חוטי מנוע ההרמה.

לאחר מכן יישר את הלייזר על קצה השלוחה. כדי ליישר את הלייזר על קצה השלוחה. סובב את הכפתור הקדמי לאחור בכיוון השעון כמה פעמים כדי להזיז את הלייזר על גבי שבב השלוחה.

כאשר הלייזר יגיע לשבב, הוא ייחסם ולא יהיה גלוי יותר. לאחר מכן סובב את הכפתור הקדמי לאחור נגד כיוון השעון עד שנקודת הלייזר תופיע שוב. הלייזר נמצא כעת על קצה השבב.

סובב את הכפתור משמאל לימין כדי למקם את הלייזר על השלוחה. כאשר הלייזר עובר מעל השלוחה הוא ייעלם ויופיע שוב ברצף מהיר. נקודת הלייזר צריכה להיות גלויה בכיסוי הזכוכית החלבית שבו תשב מאוחר יותר יחידת דיודות הצילום.

סובב את הכפתור הקדמי לאחור נגד כיוון השעון כדי להזיז את הנקודה במורד השלוחה לכיוון הקצה עד שהנקודה על הזכוכית החלבית נעלמת. כעת סובב את הכפתור הקדמי לאחור בכיוון השעון רק מעט על מנת למקם את הלייזר כך שישב רק על קצה השלוחה, נקודת הלייזר תופיע שוב על הזכוכית החלבית. לאחר יישור הלייזר, החזק את מנוע הרמת השלבים במצב פתוח למשך 10 שניות כדי להבטיח מספיק מקום בין השלוחה לדגימה.

בעת חיבור הדגימה ל-A FM, הנח כעת את הדגימה על KPFM stagה. השתמש בחוט נחושת כדי לקרקע את הדגימה ולחבר את החוטים המתאימים מה-A FM לדגימהtagה. לאחר מכן חבר את ה-stagה ל-A FM בתוכנת A FM.

ודא שזמן ההגדרה הוא לא יותר מ-10 אלפיות השנייה ושמהירויות הגישה אינן עולות על שני מיקרון לשנייה. על מנת למנוע נזק לקצה, כוון את השלוחה והתחל להזיז את קצה השלוחה לכיוון הדגימה. לאחר שקצה השלוחה מגיע למשטח דגימה, בחר גודל חלון הדמיה ואזור הדמיה אידיאלי, מטב את רווחי העין והזרחן יחד עם נקודת ההגדרה של השלוחה כך שההדמיה הטופוגרפית תהיה אופטימלית.

כאשר הדמיה טופוגרפית ממוטבת, הפעל את מודול KPFM במצב FM. הגדר את חלון ההדמיה לחמישה מיקרון על חמישה מיקרון עם חמש רזולוציה של 12 על חמש או מהירויות סריקה איטיות. עבור הגדרות FM KPFM, הגדר את הכונן בין חמישה ל-10%הגדר את תדר הכונן בין אחד לחמישה קילו-הרץ עם רוחב פס של שני קילו-הרץ.

הגדר את רווחי ה-NP של הברזל עבור ה-F-M-K-P-F-M ל-0.3%לאחר רכישת תמונות KPFM, השתמש בתוכנת עיבוד לאחר הדמיה כדי לנתח את התמונות ולאסוף נתוני SP באמצעות ההגדרות המתוארות בהדגמת וידאו זו. תמונות KPFM צולמו על 15 תאי MRSA על משטחי נירוסטה וזהב. מוצגים כאן סוגי התמונות שנאספו.

מכיוון ש-KPFM פועל באמצעות תדרים כפולים, נאספו בו זמנית תמונות טופוגרפיות ונתונים חשמליים של פני התא. מסננים תרמיים הוחלו על מפות פוטנציאל פני השטח על מנת להבחין ביתר קלות בשינויים קטנים בפוטנציאל פני השטח. בגרף זה, התמונות נותחו כדי לקבוע את פוטנציאל פני השטח של הממברנה המיקרוביאלית, ולאחר מכן שימשו להשוואה לגידול על מצעים שונים.

סריקות פוטנציאל פני השטח של נירוסטה חשופה ומצעי זהב חשופים הראו פוטנציאל פני שטח שלילי כולל. דיסקי נירוסטה וזהב מצופים פוליאול ליזין הציגו שניהם מעבר לפוטנציאל משטח חיובי. פוטנציאל קרום התא MRSA השתנה בין משטחי הנירוסטה לזהב.

כאשר הנירוסטה מציגה פוטנציאל משטח ממברנה חיובי גדול משמעותית לתאים בהשוואה לתאי MRSA על מצע הזהב שהראו פוטנציאל משטח שלילי. כדי להדגים את מלוא היכולות של KPFM, דוגמה לגרף גובה מדרגות של MRSA על נירוסטה מוצגת כאן. זה מראה את ההבדל בפוטנציאל פני השטח בין משטח המצע לקרום המיקרוביאלי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוסקופ כוח בדיקה של קלווין כדי לבחון את ההשפעות של מטען חשמלי על התקשרות ופעילות תאים מיקרוביאליים על משטחי מצע חומר שונים.