Name: גלים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: למד ליצור ג'לי פוליאקרילאמיד לבחינת פעילות אינבדופודיה וכוחות גרירה בתאי סרטן. השיטה מאפשרת לחקור את השפעת הקשיחות המכנית של המטריקס על פלישת תאי סרטן ועל חוזקות האקטומיוזין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

יש לי המחברים אין לחשוף.

<ol><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction gone awry.</a> Nature. 10, 63-73 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension+mounts%3A+mechanics+meets+morphogenesis+and+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+mammary+gland+biology+and+neoplasia%22%5BJournal%5D)">The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy.</a> Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).</li>
<li>Parekh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+modulation+of+invadopodia+across+a+wide+range+of+rigidities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities.</a> Biophysical. 100, 573-582 (2011).</li>
<li>Jerrell, R. J., Parekh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+mediate+extracellular+matrix+degradation+by+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia.</a> Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7, e32572(2012).</li>
<li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2014).</li>
<li>Haage, A., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+contractility+and+extracellular+matrix+stiffness+regulate+matrix+metalloproteinase+activity+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells.</a> FASEB J. , (2014).</li>
<li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+specialized+cell+structures+for+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion.</a> Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).</li>
<li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia.</a> Curr Biol. 18, R362-364 (2008).</li>
<li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+breast+cancer+risk+prediction+model+for+women+undergoing+screening+mammography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projecting+absolute+invasive+breast+cancer+risk+in+white+women+with+a+model+that+includes+mammographic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).</li>
<li>Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tense+situation%3A+forcing+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tense situation: forcing tumour progression.</a> Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).</li>
<li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+density-induced+mechanoregulation+of+breast+cell+phenotype%2C+signaling+and+gene+expression+through+a+FAK-ERK+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage.</a> Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).</li>
<li>Rosel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+Rho%2FROCK+signaling+in+sarcoma+cells+drives+invasion+and+increased+generation+of+protrusive+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces.</a> Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).</li>
<li>Indra, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+correlation+of+mechanical+forces+and+metastatic+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity.</a> Phys Biol. 8, 015015(2011).</li>
<li>Parekh, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+invasiveness+by+the+physical+extracellular+matrix+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+adhesion+%26+migration%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment.</a> Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).</li>
<li>Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples).</a> Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wang, J. H., Lin, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+traction+force+and+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+modeling+in+mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Cell traction force and measurement methods.</a> Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).</li>
<li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).</li>
<li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+elasticity%3A+measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+toward+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+and+branching+of+PC12+cells+on+very+soft+substrates+sharply+decreases+below+a+threshold+of+substrate+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity.</a> J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).</li>
<li>Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+stiffening+of+embryonic+tissues+via+microtubules%2C+RhoGEF+and+the+assembly+of+contractile+bundles+of+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin.</a> Development. 137, 2785-2794 (2010).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).</li>
</ol>

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס K25CA143412 (פארח). ברצוננו להכיר בכך שתמיכה נוספת סופקה על ידי המחלקה אף אוזן הגרון. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

אנו מציגים שיטה לבודת PaaS שיכול לשמש כבסיס למבחני invadopodia וכוח המתיחה לתאם התנהגויות סלולריות פולשנית והתכווצות. בעוד PaaS כבר מזמן משמש להסתכל על השפעות נוקשות בתאים ולחשב כוחות המתיחה 18,24,27, פרוטוקול זה הוא ראשון לפתח מבחני מקבילים המבוססים על PaaS עם אותו הקשיחויות לתאם התנהגויות סלולריות פולשנית והתכווצות בתגובה למטריצה תכונות מכאניות. כראוי הפעלת coverslips של המנות תחתית הזכוכית מבטיחה כי PaaS יהיה לאגד אותם ולא יורד. אמנם יש לנו ואחרים הסתמכו על חומרים כי...

הנוקשות של ECM גידולים הקשורים זוהתה כגורם משמעותי בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת התכווצות actomyosin 1-3. בעוד השפעה זו בעיקר הודגמה עם תאי סרטן השד, נמצאו נוקשות מטריצה ​​לשנות תכונות פולשנית של תאים שמקורם במגוון רחב של סוגי הסרטן 4-8 טוענים כי נוקשות גידול עשוי לשחק תפקיד בסוג אחר של סרטן. לחדור רקמות צולבות במהלך נדידה פולשנית, תאים סרטניים לנצל בליטות דבקים אקטין עשיר הידוע בשם invadopodia שלמקם proteinases להשפיל ECM 9 focally. Invadopodia נחשב לסימן היכר של תאים פולשניים והיה מעורב בפלישת תאי גידול וגרור 10,11. מחקרים קודמים הראו כי נוקשות מטריצה ​​יכולות לווסת מספרי invadopodia וקשורים השפלה ECM 4,12 באמצעות פעילות שרירן השני וחלבוני mechanosensitive 12. בהתחשב במתאם בין צפיפות גידול ותוקפנות סרטן 13,14, משתמע מתוצאות אלה מנגנון שבאמצעותו תאי הסרטן עשויים להגיב לרקמות גידול נוקשה לנהוג פלישה וגרורות דרך התכווצות actomyosin. בקשיחות ECM מבחנה ובצפיפות רקמת vivo הוכח לווסת התנהגות פולשנית של תאים סרטניים 1,15-17. בעוד התכווצות actomyosin נראית חשוב בתהליך זה, סכסוך לימודים נוכחי, האם יכולת גרורתי מתואמת לעלתה או ירד כוחות התכווצות 6,18-20. יתר על כן, הוא נשאר לא ידוע אם כוחות אלה ישירות לתווך פעילות invadopodia 21. מצאנו לאחרונה כי כוחות התכווצות תאי הסרטן היו תלויים בנוקשות מטריצה ​​והיו חזוי של השפלה ECM על ידי invadopodia 5. תוצאות אלו מצביעות על כך שכוחות סלולריים עשויים לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות סרטן על ידי תיווך ac invadopodiativity בתגובה לתכונות מכאניות של מייקרו-הסביבה של הגידול. על מנת לתאם את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאים סרטניים 5, שינינו פרוטוקול ליצירת PaaS עם קשיחויות שונות ששימשו בעבר לחקירת פעילות invadopodia קשיחות תלויה 4,12,22. על ידי כימי crosslinking פיברונקטין פלזמה האנושי לאורך PaaS, יכול לשמש הידרוג שונה אלה כבסיס לשני invadopodia ומבחני כוח המתיחה על מנת להבטיח שתאים חוו את אותו הקשיחויות בשני הניסויים 5. במבחני invadopodia, פיברונקטין מספק תחום מחייב טבעי לג&#39;לטין לקשר ECM המעולף לPaaS לזהות הפחתת מטריצה. במבחני כוח המתיחה, פיברונקטין מספק ליגנד להידבקות סלולרית ישירה לאתר התקות microsphere המשמשות לחישוב כוחות מתיחה הסלולר. תוצאות שיטה זו במה שאנו קוראים רכים, קשים,וPaaS הנוקשה שחייבים מנות תחתית זכוכית ויש לי moduli אלסטי, E, של 1,023, 7307, והאבא 22692 5 שמשתרעים על פני מגוון רחב של תכונות מכאניות דיווחו לרקמות נורמליות וסרטניות 23.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyltrimethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide (40%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אקרילית NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>להכין טרי במכסה אדים 10 מ"ג/מ"ל ב-DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A22283</td><td>יכול גם להשתמש ברודמין</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>הכינו תמיסה טרייה של 10% ב-1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606</td><td>השתמשו ב-6 טיפות למילוי מיקרו-בארות</td></tr><tr><td>BIS (2%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td>מייצרים 3% לחסימת תמיסה ב-1x PBS ומאחסנים ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Coverslips (12 מ"מ)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>שיווי משקל מראש במאגר בוראט למשך 15 - 30 דקות</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>שימוש לייצור invadopodia בינוני</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>שימוש לייצור תמיסת אסתר חומצה אקרילית</td></tr><tr><td>NHS גורם גדילה אפידרמיס</td><td>חיים טכנולוגיות</td><td>PHG0311</td><td>להשתמש בהן כדי להפוך את invadopodia בינוני אתנול</td></tr><tr><td></td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td><td>לדלל עם מים טהורים במיוחד ל-70%</td></tr> <tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>שימוש לייצור invadopodia בינוני</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>להגן מפני אור</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>Polysciences</td><td>00639</td><td>בדרך כלל מכינים 10 מ"ל של תמיסת סוכרוז 1% / 1% ג'לטין ב- PBS ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות; C (חימום מראש PBS להמסת ג'לטין בקלות)</td></tr><tr><td>כלי תחתית זכוכית (כיסויים 35 מ"מ)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>כיסויים אינם מצופים</td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד (25%)</td><td>Polysciences</td><td>01909</td><td>מדלל עם 1x PBS עד 0.5%</td></tr> <tr><td>עיזים נגד עכבר Alexa Fluor 633 נוגדן</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין פלזמה אנושית</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>הוסף 5 מ"ל מים טהורים במיוחד להכנת 1 מ"ג/מ"ל; aliquot בנפחים המבוססים על שימוש כדי למנוע מחזורי הקפאה והפשרה מוגזמים</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>שימוש לייצור מלאי PBS 10x</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-קורטקטין 4F11 נוגדן</td><td>EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>לשימוש לייצור מלאי PBS פי 10</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>משמש לייצור מלאי PBS פי 10 ומאגר בוראט</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>מדולל במים טהורים במיוחד ל-0.1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (סרום דל חלבון)</td><td>BD Biosciences</td><td>355500</td><td>משמש לייצור מדיום invadopodia</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Acros</td><td>416785000</td><td>בדרך כלל מכינים 10% מלאי ב-1x PBS, מכינים במכסה אדים, ומוסיפים כמה מ"ל של NaOH חזק כדי להמיס פרפורמלדהיד בקלות ואז להחזיר ל-pH 7.4 עם HCl חזק)</td></tr> <tr><td>PBS (סטרילי)</td> <td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>שימוש לתרבית תאים</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>לשימוש להכנת invadopodia בינוני</td></tr><tr><td>נתרן בורוהידריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>להכין טרי במכסה אדים 1 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS</td></tr><tr><td>נתרן מטבוראט טטרה-הידראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0251</td><td>משמש להכנת חוצץ בוראט</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>מכין בדרך כלל 10 מ"ל של 1% סוכרוז/1% תמיסת ג'לטין ב-PBS ומאחסנים ב-4 מעלות; C (חימום מראש PBS להמסת ג'לטין בקלות)</td></tr> <tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa</td><td>Aesar A16046</td><td>מייצרים 10% מלאי ב-1x PBS ומשתמשים כפי שהוא להסרת תאים בבדיקת כוח משיכה או מדללים עם 1x PBS לצביעה</td></tr></tbody></table>

ג&#39;לים polyacrylamide לinvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

רקמות גידול נוקשה היו מעורבות מאוד בויסות נדידת תאי הסרטן ופלישה. נדידה פולשנית דרך רקמות צולבות היא הקלה על ידי בליטות אקטין עשיר בשם invadopodia שproteolytically לבזות את המטריצה ​​תאית (ECM). פעילות Invadopodia הוכחה להיות תלוי בכוחות קשיחות ECM והתכווצות תאים סרטניים המצביעים על כך אותות קשיחות יכולים לווסת מבני subcellular אלה באמצעות התכווצות actomyosin. מאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן יכולים להיות מתואמים במבחנה באמצעות מבחני invadopodia וכוח המתיחה המבוססים על ג&#39;לים polyacrylamide (PaaS) של קשיחויות שונות. מאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן יכולים להיות מתואמים במבחנה באמצעות מבחני invadopodia וכוח המתיחה המבוססים על ג&#39;לים polyacrylamide (PaaS) של קשיחויות שונות. בעוד כמה וריאציות בין שני מבחני קיימות, הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה ליצירת PaaS הבניתן להשתמש בשני מבחני והם בקלות להתאמה לצרכים הביולוגיים וטכניים הספציפיים של המשתמש.

בassay invadopodia, invadopodia מזוהה בדרך כלל על ידי colocalization של סמנים כמו אקטין וcortactin במבני punctate בתוך גוף התא (איור 1). שני invadopodia פעיל המשפיל ולא משפיל ניתן לספור ונבדלים באם מבנים אלה colocalized עם אזורים שחורים חסרי אות ניאון בפיברונקטין FITC שכותרתו (איור 1). Invadopodia נספרים באופן ידני, והשפלה ECM לכל תא נקבעה על ידי thresholding ידני האזורים השחורים האלה בתוך קווי המתאר של התאים. <p class="jove_content" style=";t...

קשיחות מכאנית במייקרו-הסביבה של הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת פעילות invadopodia וactomyosin התכווצות. ג&#39;לים באמצעות polyacrylamide (PaaS), יכולים להיות מנוצלים מבחני invadopodia וכוח המתיחה ללמוד את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן בתגובה למטריצת קשיחות.

ג&#39;לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור ג'לים של poly acrylamide שניתן להשתמש בהם הן בבדיקות invader, podia והן בבדיקות traction force, כדי לחקור את התכונות הפולשניות והמכווצות של תאי סרטן. הדבר משיג תחילה על ידי הפעלה של ה-cover slips בגודל 14 מילימטר בתוך glass blossom dishes כדי להבטיח שג'לי ה-poly acrylamide יהיו קשורים לזכוכית. לאחר מכן, מוכנים תמיסאות poly acrylamide עבור שתי הבדיקות כדי להפיק ג'לים בעלי קשיחויות או תכונות מכניות שונות.לאחר מכן, מכינים את בדיקות הפודיה הפולשות עם שכבה דקה של מטריצה חוץ-תאית מסומנת פלואורסצנטית כדי לזהות פירוק. לבסוף, זורעים בבדיקות תאי סרטן לדגירה למשך לילה, ולאחר מכן מקבעים וצובעים את לוחות הפולשים והפודיה, ומבצעים דימות של תאים חיים של לוחות כוח המתיחה. לבסוף, משתמשים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לדמות את הפולשים, הפודיה ואת פירוק המטריצה החוץ-תאית.בעוד שמיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה בשדה רחב משמשות להדמיית מיקרוספירות ותאים, בהתאמה, לצורך חישובי כוחות מתיחה (traction force), את הפרוצדורה תדגים רחל ג'ארל, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. כדי להכין כיסויות זכוכית עבור ג'לי poly equi mite, התחילו בניקוי כיסויות של 12 מילימטר באמצעות מגבונים ללא סיבים. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק כיסויות של 12 מילימטר וצלחות עם תחתית זכוכית של 35 מילימטר המכילות כיסוי

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה ​​(ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

אנו מתארים את שיטת האבטיפוס לייצור coverslips מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצופה ג'לטין להמחשת הפחתת מטריצת invadopodia בתיווך. טכניקות חישוב באמצעות תוכנה זמינה מוצגות לכימות הרמות כתוצאה של proteolysis מטריצה ​​של תאים בודדים בתוך אוכלוסייה מעורבת וקבוצות תאיות המקיפות את השדות מיקרוסקופים שלמים.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

סרטון זה מתאר את בדיקת מיקרוסקופ כוח המתיחה. הבדיקה קובעת את המתיחה התאית של תאי סרטן המעי הגס האנושי על המטריצה החוץ תאית הקיימת על הידרוג'ל אלסטי רך בעל חרוזים פלואורסצנטיים משובצים. התזוזה המתקבלת של חרוזים פלואורסצנטיים נמדדת באמצעות תוכנה מתאימה.

בדיקת ציטומטריית מתיחה: שיטה לכימות כוח המתיחה המופעל על ידי תאים סרטניים ב- ECM

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

המעבדה שלנו פיתחה הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide, מערכת הידרוג'ל דינמית, כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של ויסות רקמות נוקשות על תפקוד תא. כאן, אנו מספקים שרטוטים, תיאור, ופרוטוקולים להכנת הידרוג אלה.

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

מתואר פרוטוקול לחילוץ תאים אנושיים ראשוניים מגידול כירורגי במעי הגס ורקמות תקינות. לאחר מכן התאים המבודדים מתורבתים על מצעים אלסטיים רכים (הידרוג'לים פוליאקרילאמיד) המתפקדים על ידי חלבון מטריצה חוץ-תאי, ומשובצים במיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים. ציטומטריית מתיחה מבוצעת כדי להעריך מתחי התכווצות תאים.

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

כאן מתוארת שיטה המאפשרת הכנה מהירה, יעילה וזולה של ג'לים פוליאקרילאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד וניתן לאמץ אותה בקלות על ידי כל מעבדת מחקר. זה יהיה שימושי במיוחד במחקר המתמקד בהבנת תגובות תאים תלויות נוקשות.

Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה

התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

למד ליצור ג'לי פוליאקרילאמיד לבחינת פעילות אינבדופודיה וכוחות גרירה בתאי סרטן. השיטה מאפשרת לחקור את השפעת הקשיחות המכנית של המטריקס על פלישת תאי סרטן ועל חוזקות האקטומיוזין.

ג'לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

גלה סרטונים נוספים