Name: שיטות להערכת Cytotoxicity ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרים דליקים טבק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: חקור את השפעות תכשירי טבק דליקים על תפקוד תאי דם לבנים מונונוקליאריים (PBMCs) באמצעות שיטות זרימה ציטומטריה. המחקר מעריך דיכוי ציטוקינים והפחתת פעילות ציטוליטית בתאי מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי RJ Reynolds חברת הטבק (RJRT) במסגרת הסכם לשיתוף פעולה מחקרית עם בית הספר לאוניברסיטת Wake Forest לרפואה. GL פראסאד הוא עובד במשרה מלאה של RJRT.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22How+Tobacco+Smoke+Causes+Disease%3A+The+Biology+and+Behavioral+Basis+for+Smoking-Attributable+Disease%2C+A+Report+of+the+Surgeon+General%22">How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General</a>. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).</li>
<li>Zeller, M., Hatsukami, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strategic+Dialogue+on+Tobacco+Harm+Reduction%3A+a+vision+and+blueprint+for+action+in+the+US%5BTitle%5D)+AND+%22Tob.+Control%22%5BJournal%5D)">The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US.</a> Tob. Control. 18, 324-332 (2009).</li>
<li>Sopori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cigarette+smoke+on+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effects of cigarette smoke on the immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).</li>
<li>Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tobacco-smoke+on+key+signaling+pathways+in+the+innate+immune+response+in+lung+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages.</a> J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).</li>
<li>Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+inhibits+lipopolysaccharide-induced+production+of+inflammatory+cytokines+by+suppressing+the+activation+of+activator+protein-1+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells.</a> J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).</li>
<li>Moodie, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+cigarette+smoke+alter+chromatin+remodeling+but+differentially+regulate+NF-kappaB+activation+and+proinflammatory+cytokine+release+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells.</a> Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).</li>
<li>Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+induces+IL-8%2C+but+inhibits+eotaxin+and+RANTES+release+from+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle.</a> Respir. Res. 6, 74(2005).</li>
<li>Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+coordinate+activation+of+HSF+and+inhibition+of+NFkappaB+in+human+monocytes%3A+effects+on+TNFalpha+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).</li>
<li>Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+alveolar+type+II+epithelial+cell+chemokine+release%3A+effects+of+cigarette+smoke+and+neutrophil+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).</li>
<li>Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+and+nicotine+product+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nicotine+Tob.+Res%22%5BJournal%5D)">Tobacco and nicotine product testing.</a> Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).</li>
<li>Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+Regulatory+Science%3A+Research+to+Inform+Regulatory+Action+at+the+Food+and+Drug+Administration%27s+Center+for+Tobacco+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Nicotine+Tob.+Res%22%5BJournal%5D)">Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products.</a> Nicotine Tob. Res. , (2014).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytotoxicity+of+different+tobacco+product+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Regul.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).</li>
<li>Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cell-specific+cytotoxic+responses+of+oral+cavity+cells+to+tobacco+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations.</a> Toxicol In Vitro. , (2012).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combustible+and+non-combustible+tobacco+product+preparations+differentially+regulate+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).</li>
<li>Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead+cell+discrimination+with+7-amino-actinomycin+D+in+combination+with+dual+color+immunofluorescence+in+single+laser+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 204-208 (1992).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).</li>
<li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים.

אנו ואחרים הוכיחו בעבר כי הטיפול בPBMCs עם עקר מדכא כמה תגובות, כוללים ביטוי והפרשה של ציטוקינים ופעולות פונקציונליות כגון תא המטרה להרוג 14. השיטות הניסיוניות שתוארו בעבודה הקודמת דורשות תקופות דגירה ארוכות יותר והיו צנועים בגודל 14. בהתחשב ביישומים הפוטנציאליים של מודל אטרקטיבי זה vivo לשעבר למחקר בסיסי והיישומים, אנחנו בדקנו אם כל אחד מפרמטרי assay במבחנים ביולוגיים אלה רבי שלבים יכול להיות מותאם. כאן, אנו מציגים פשוטים שיטות למדידת תגובות חיסוני ...

גוף משמעותי של נקודות ידע לתופעות לוואי הבריאותיות של עישון סיגריה כרוני, כולל מחלות לב וכלי דם (CVD), מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) וסרטן 1,2. עישון סיגריות כרוני כבר ידוע לגרום לדלקת ודיכוי מערכת חיסונית, ושינויים אלה דיווחו לתרום לעלייה בסיכון לזיהום חיידקים וסרטן במעשנים 3. במבחנה וטכניקות vivo לשעבר שימושיות בהבהרת הבסיס המולקולרי של תופעות pathophysiological של עשן סיגריות 4-9 (טבלת 1) ומוכרות ככלים חשובים להדרכת תקנה החדשה של מוצרי טבק שונים 10,11. לדוגמא, יש לנו הפגנו כי הכנות דליקים מוצר טבק (בעקר) כגון בינוני כל-מותנה עשן (WS-CM) וחומר חלקיקים כולל (TPM) הן הרבה יותר רעילות לתאים ומזיק לDNA מאשר בעקר או ניקוטין 12,13 אינו דליקים. עולה בקנה אחד עם העבודה שפורסמה, היא דיווחה לאחרונה כי בעקר או ניקוטין 12,13 דליקים. עולה בקנה אחד עם העבודה שפורסמה, שדיווחנו לאחרונה כי בעקר דליק גרם דיכוי חיסוני משמעותי. זה מעיד דיכוי Toll- כמו קולט -ligands (TLR), מגורה הפרשת ציטוקינים, וממוקד תא (K562) ההמתה בPBMCs במודל vivo לשעבר 14. בהתחשב במשמעות של דלקת בתהליכי מחלה נגרמים על-עשן סיגריות, אופטימיזציה נוספת של תנאי assay כדי להעריך את השפעות modulatory חיסון של עשן סיגריות מוצגת בדוח זה. Vivo לשעבר מבחני בדרך כלל נמדדים תוך-תאיים ומופרשים ציטוקינים כמו גם הפונקציה של cytolytic ציטוטוקסיות תאי T וNK בתא K562 הורגת מבחני 14. מבחני מעורבים מראש דגירה עם WS-CM וניקוטין והגירוי הבא של PBMCים עם TLR אגוניסטים על פני תקופה של 3 ימים; הקריאות הסופיות מבוצעות באמצעות מבחני צמודי אנזים immunosorbent (ELISAs) ו / או cytometry זרימה. אנו מנוצלים lipopolysaccharide חיידקים (LPS), אשר נקשר לקולטנים TLR-4 ומעורר PBMCs כתוצאה מכך הייצור של ציטוקינים והפרשה של ציטוקינים תאיים. בנוסף לאופטימיזציה של צעדי assay השונים להערכת השפעות המערכת החיסונית של עקר, אנחנו גם שיטות הנוכחיות לPBMCs בידוד, מבחני מוות של תאים, ו- IL-8 כימות. שיטות אלה עשויות להיות מיושמות מטרה לענות על שאלות מחקר אחרות ומעודנות יותר כדי להעריך מוצרי טבק בהקשר הרגולטורי. טבלת 1. פורסם דיווחים על במבחנה ושיטות לשעבר vivo משמשות ללמוד אפקטי pathophysiological varilus של הכנות מוצר טבק CS, בינוני עשן סיגריות.; CSC, עיבוי עשן סיגריות; מנוע חיפוש מותאם אישית, תמצית עשן סיגריות; ELISA, אנזים צמוד immunosorbent assay; GADPH, glyceraldehyde dehydrogenase 3-פוספט; qPCR, תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים; RT, תגובת השרשרת של פולימראז כמותיים זמן אמת; TS, עשן טבק. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מחבר (שנת הלימוד) </td><td> אל Laan et. (2004) </td><td> אל מודי et. (2004) </td><td> אל Oltmanns et. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> אל Witherden et. (2004) </td><td> אל Birrell et. (2008) </td></tr><tr><td> תאים המשמשים </td><td> תאים אנושיים הסימפונות האנדותל (BEAS-2B), נויטרופילים אדם </td><td> תאים אנושיים alveolar אפיתל (A549) </td><td> תאי שריר חלקים בדרכי נשימה אנושיות (HASMC) </td><td> תאים אנושיים premonocytic U937, מונוציטים אדם </td><td> סוג מכתשי II תאי אפיתל (ATII) </td><td> monocytic אדםשורת תאים (THP-1), מקרופאגים ריאות אנושיים </td></tr><tr><td> TPP משמש </td><td> מנוע חיפוש מותאם אישית </td><td> CSC </td><td> מנוע חיפוש מותאם אישית </td><td> TS </td><td> מנוע חיפוש מותאם אישית </td><td> CS </td></tr><tr><td> שיטה </td><td> ELISA, qPCR, הגירה, שינוי electromobility </td><td> Immunohisto-כימיה, אלקטרופורזה, ערכת Arrayscan, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR, אלקטרופורזה </td><td> משמרת ג&#39;ל ניידות </td><td> מיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ אלקטרונים, אלקטרופורזה, ELISA </td><td> qPCR, ELISA, ערכת E-toxate (Sigma), assay צלחת p65 (TransAM), אלקטרופורזה, ערכות immunoassay שונות </td></tr><tr><td> מדד </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, הגירה </td><td> acetyltransferases היסטון, deacetylases היסטון, NF-κB, IL-8, PI κB-α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxin </td><td> חלבוני הלם / עומס חום (HSP / Hsp70), גורם שעתוק HF, NF-κB,TNF-α </td><td> חלבון פעילי שטח (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / זירחון ERK, cJUN: DNA מחייב, גלוטתיון, p65: DNA מחייב </td></tr><tr><td> תוצאה סופית </td><td> מנוע חיפוש מותאם אישית מטה-מווסת את ייצור ציטוקינים באמצעות דיכוי ההפעלה AP-1. </td><td> H 2 O 2 וCSC לשפר acetylation של חלבוני היסטון, להקטין פעילות deacetylase היסטון, באופן דיפרנציאלי להסדיר שחרור ציטוקינים מעודדי דלקת. </td><td> עשן סיגריות עלול לגרום לשחרורו של IL-8 מHASMC, משופר על ידי TNF-α, CSE 20% פחות שחרור IL-8, עיכוב של eotaxin וטווחים על ידי עשן סיגריות. </td><td> TS הופעל גורם שעתוק HF, שהיה קשור עם ביטוי יתר Hsp70 ועיכוב של NFkB מחייב פעילות ושחרור TNF-α. </td><td> alveo רמות chemokine תאים שמקורם ATII מופחת פשרהתיקון lar, תורם לנזק סיגריה מושרה עשן alveolar ואמפיזמה. </td><td> נתונים לספק הסבר מכניסטי לזיהומים בדרכי הנשימה מדוע מעשנים גדלו. דיכוי התגובה המולדת מלווה בעלייה בIL-8. </td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>12 x 75 מ"מ צינורות</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>קורנינג</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל מיקרו-צינורות</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>3R4F סיגריות ייחוס</td><td>אוניברסיטת קנטקי, המכללה לחקלאות</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>קורנינג</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתונה שטוחה 96 בארות</td><td>Termo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תחתונות עגולות 96 בארות</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים תרבית תאים</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 סדרה A2</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>בדיקות מולקולריות Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אשכול</td><td>קורנינג</td><td>4401</td><td>מזיק בבליעה,</td></tr><tr><td>ציטופיקס / ציטופרם (Permwash)</td> <td>BD Biosciences</td><td>555028</td> DMSO <td>דליק</td></tr><tr><td>(דימתיל סולפוקסיד)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Array</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>Software מנתחת נתוני CBA</td></tr><tr><td>יחידת סינון</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td>8 צבעים, ב-Ex 405 ו-Em 785.</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td>4 צבעים ב-Ex 495 ו-Em 785.</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה</td> מיכל <td>הקפאה Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>מכיל DMSO,</td></tr> מגרה <tr><td>GogliPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>מסרטן, מגרה, קורוזיבי</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>ערכת</td> <td>ציטוקינים דלקתיים אנושייםBD Biosciences</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma; V-500 נוגדן</td><td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>רגיש לעור</td></tr><tr><td>IL-8 ELISA Kit</td><td>R and D Systems</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>מאגר בידוד</td><td>Isolymph, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>נוזל דליק,</td></tr><tr><td>אלכוהול איזופרופיל</td> מגרה <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-ואלפא; נוגדן PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554730</td><td>רעילות חריפה, דרך הפה</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>רעילות חריפה, סכנה סביבתית</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>" מ"</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>דליק, גירוי בעור</td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ריצה</td><td>MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>TNF ואלפא; Alexa Fluor 488 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות להערכת cytotoxicity ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרים דליקים טבק

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

בין שינויי pathophysiological אחרים, חשיפה כרונית לעשן סיגריות גורמת לדלקת ודיכוי מערכת חיסונית, אשר נקשר לרגישות מוגברת של מעשנים לזיהומי חיידקים ושכיחות גידולים. Ex vivo דיכוי של מערכת חיסונית בתיווך קולט בתאי הדם היקפיים mononuclear אנושיים (PBMCs) טופל במרכיבי עשן הוא גישה אטרקטיבית ללמוד מנגנונים ולהעריך את ההשפעות ארוכת הטווח הסבירה של חשיפה למוצרי טבק. כאן, אנו מותאמים שיטות לבצע מבחני vivo לשעבר באמצעות PBMCs מגורה על ידי lipopolysaccharide חיידקים, יגנד רצפטור-4-כמו אגרה. ההשפעות של מדיום כל ממוזג עשן (WS-CM), הכנת מוצר טבק דליק (TPP), וניקוטין נחקרו על הפרשת ציטוקינים והרג תאי מטרה על ידי PBMCs במבחני vivo לשעבר. אנו מראים כי ציטוקינים מופרשים IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-8 וציטוקינים תאיים IFN-47 ;, TNF-α, וMIP-1α דוכאו בPBMCs החשופה-WS-CM. פונקצית cytolytic של PBMCs מפעיל, כפי שנקבעו על ידי assay תא מטרת K562 הורג גם מופחתת על ידי חשיפה לWS-CM; הניקוטין היה מינימאלי יעיל במבחנים אלה. לסיכום, אנו מציגים סדרה של מבחני השתפרו להעריך את ההשפעות של עקר במבחני vivo לשעבר, ושיטות אלה יכולים להתאים בקלות לבדיקת מוצרים אחרים בעלי עניין.

התוצאות הוצגו כשגיאת ± סטנדרטית הממוצעת של הממוצע (ארבע דגימות תורם). מבחן t של הסטודנט בין דגימות בקרה שטופלו ולא טופלו בוצע באמצעות תוכנת Excel וכן השוואות מבחן t לכל הטיפולים עם הפקדים המתאימים שלהם. המובהקות הסטטיסטיות שצוינו על ידי: *, P &lt;0.05; **, P &lt;0.005; ***, P &lt;0.0005. כדי למדוד את ההשפעה של חשיפה לWS-CM וניקוטין, טופלו PBMCs עם ריכוזים שונים של WS-CM וניקוטין למשך 3 שעות או 24 שעות. מוות של תא...

באמצעות מבחני תאים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי (PBMC) ex vivo, הראינו כי תכשיר מוצר טבק דליק מדכא באופן ניכר ציטוקינים המופרשים תוך תאיים בתיווך קולטנים ויכולת ציטוליטית של PBMCs אפקטיביים. בדיקות מהירות אלה עשויות להיות שימושיות בהערכת המוצר והבנת ההשפעות הפוטנציאליות ארוכות הטווח של חשיפה לטבק.

שיטות להערכת Cytotoxicity ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרים דליקים טבק

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את השפעות הכנת מוצרי טבק על הפרשת ציטוקינים ועל הריגת תאי מטרה על ידי P BMCs. מטרה זו מושגת תחילה על ידי טיפול ב-P BMCs במעבדה בתנאי עשן מלא, מzדיום או ניקוטין, ולאחר מכן מבוצע צביעה תוך-תאית של ה-p BMCs המטופלים כדי לקבוע את ייצור הציטוקינים שלהם. לחלופין, תאי K 5 62 המסומנים ב-CFSE מגודלים בתיקביה עם תאי אפקטור PBMC שטופלו במzדיום המעובד בעשן מלא, וחיוניות תאי K 5 62 נבדקת באמצעות צביעת seven A a d.בסופו של דבר, ההשפעות של תכשירי מוצרי טבק דליקים על ה-P BMCs משני הבדיקות נמדדות באמצעות ציטומטריה זורמת. היתרונות המרכזיים של הטכניקות שלנו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת שחרור כרום או ALI spot, הם שהשיטות שלנו הן בעלות תפוקה גבוהה, אינן רדיואקטיביות, ואנו יכולים למדוד את התפקוד התאי. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההשפעות הביולוגיות של תכשירי מוצרי טבק.ניתן ליישם זאת גם להערכה של תרכובות אחרים המשפיעות על תפקודי ה-STIC והפעלת הרספטורים מסוג Toll של תאי אפקטור PBMC. לפני תחילת הליך הצביעה, יש לדלל את תנאי העשן השלם, המדיום והניקוטין בריכוזים המפורטים, בתוך מדיום RPMI מלא לנפח כולל של 100 microliters לבאר בלוחית 96 בארות.לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של P BMCs, התלויים במדיום מלא בריכוז של 1x10⁶ תאים לבאר, לנפח כולל של 200 µL לבאר. לאחר מכן, כסו את הפלטה והדגירו אותה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. לאחר שלוש שעות, שטפו את התאים ושאבו את העלייה.לאחר מכן, כסו את הפלטה שוב ובצעו ערבול (vortex) כדי לפרק את המשקעים. שטפו את התאים פעמיים נוספות, פעם אחת בבופר הרצה (running buffer) קר בקרח, ופעם אחת במדיום מלא לאחר השטיפה השנייה. טפלו בהם ב-200 microliters לכל באר של מדיום מלא המועשר ב-Golgi plug וב-LPS למשך שש שעות ב-37 degrees Celsius ו-5%CO2.לאחר מכן, שטפו את התאים עם בופר שטיפה (running buffer) קר מאוד והטפילו אותם ב-100 µL של cyto fix לכל באר בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. שטפו את התאים שלוש פעמים עם perm wash קר מאוד. לאחר מכן, הוסיפו 45 µL של cyto perm לכל באר, ולאחריהם 5 µL מכל אחד מהנוגדנים המפורטים. לאחר 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, שטפו את התאים שלוש פעמים וקבעו אותם ב-200 µL של para formaldehyde בריכוז 2%, קר מאוד.לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנות של 12 על 75 מילימטר ונתחו את הדגימות בציטומטר זרימה. לאחר הכנת פלטה של pbmc שטופלו במוצרי טבק כפי שהודגם כעת, שטפו תרבית של תאי K 5 62, שנאספו בצפיפות של 80%, ב-10 מיליליטר של DPBS. השהו את המשקע בחמישה מיליליטר של DPBS וספרו את התאים.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת עבודה טרייה של CFSE ל-1 עד 2 כפול 10⁷ תאי K 5 62 במיליליטר אחד של מצע מלא, ופזרו את צבע התאים באמצעות וורטקס. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר, ולאחר בדיוק שתי דקות, הוסיפו 200 µL של FBS וערבבו את התאים שוב בוורטקס, תוך דגירה למשך שתי דקות נוספות. לאחר הדגירה השנייה, שטפו את התאי ב-10 mL של מצע מלא, ולאחר מכן השעיו את המשקע ב-10 mL נוספים של מצע מלא וספרו את התאים.כעת סנטריפוגו את ה-p BMCs שעובדו עם טבק ושפכו את העילוי. לאחר מכן, החזירו את המכסה, השעיקו את התאים על ידי וורטקס (vortexing) ושטפו אותם ב-200 µL של מצע מלא לכל באר. כדי להתחיל את בדיקת ההריגה (killing assay), הוסיפו את תאי ה-K 5 62 המסומנים ב-CFSE ל-pbmc ביחס של 1:15 והדגרימו את התרבית המשולבת ב-37 °C ו-5% CO2.לאחר חמש שעות, סובב את התאים בצנטריפוגה והסר את הנוזל העליון (supernatant). השהה את המשקעים (pellets) באמצעות וורטקס ולאחר מכן שטוף את התאים עם 200 µL של running buffer לכל באר, ואז הוסף 95 µL של running buffer, ולאחריו 5 µL של seven A a d לנפח כולל של 100 µL לכל באר. לבסוף, הדגר את התאים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של running buffer לכל באר והעבירו את כל הנפח למבחנות ה-fax המתאימות כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים ל-7-AAD ו-CFSE. בניתוח פלוו-ציטומטרי, נצפתה עלייה תלוית-מינון במוות התאים עם מצע מותנה מעשן סיגריות שלם (whole smoke conditioned medium) לאחר 24 שעות, עם כמעט 80% מהתאים מתים בריכוז של 4 µg/mL של יחידות ניקוטין שוות. עם זאת, טיפול ב-p BMCs למשך שלוש שעות בלבד אינו גורם לרעילות משמעותית, אפילו בריכוז של 5 µg/mL של יחידות ניקוטין שוות של מצע מותנה מעשן סיגריות שלם לאחר 24 שעות.רמה דומה של מוות תאי אינה נרשמת לפני טיפול ב-3000 micrograms per milliliter של nicotine לאחר שלוש שעות; טיפול ב-nicotine אינו גורם למוות תאי מדיד לפני הטיפול בריכוז של 2000 microgram per milliliter. תנאי של whole smoke condition, medium ו-nicotine, שבסיומם גירוי של קולטן TLR 4 על ידי LPS, מובילים לירידה תלוית-מינון של cytokines מופרשים, אם כי מידת הדיכוי משתנה בין ה-cytokines הבודדים. יתרה מכך, כאשר תאים מטופלים באופן משולב עם LPS ו-Golgi plug למשך שש שעות בלבד, נצפית ירידה במספר התאים החיוביים ל-cytokine תוך-תאי לאחר חשיפה ל-whole smoke condition medium, אפילו בריכוזי nicotine נמוכים יותר בהשוואה לחשיפה ל-nicotine.אכן, תוצאות בדיקת ההרג (killing assay) זו ממחישות כי חשיפה ל-1.56 µg/mL של תווך בתנאי עשן מלא מפחיתה באופן משמעותי את יכולת ההרג של אוכלוסיית ה-PBMC האפקטורית בהשוואה לבקרה ולריכוזי המינון הנמוכים יותר. זאת, בעוד שטיפול בניקוטין, הן בריכוזים גבוהים והן בנמוכים, אינו מפריע ליכולת ההרג של אוכלוסיית ה-PBMC האפקטורית. בעת ביצוע פרוצדורות אלו, חשוב לדייק בסימון ה-CFSE, כמו גם בדילוציות הנוגדנים, בזמן הסימון ובטמפרטורות האינקובציה.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשתמש בטכניקות סימון בנוגדנים בציטומטריית זרימה כדי לקבוע את השפעותיהם של תכשירי מוצרי טבק או טיפולים אחרים על תאים מונונוקלאריים של דם פריפרי

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד, culturing וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים, כדי ללמוד התגובות מולקולרית רעלן זה סביבתיים.

בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

סרטון זה מדגים את ההשפעה של תכשירי מוצרי טבק, TPPs, על ייצור ציטוקינים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים באמצעות ציטומטריית זרימה. הטיפול בתאים עם TPP מוריד את הייצור של ציטוקינים מעודדי דלקת, אשר מוערך לאחר גירוי lipopolysaccharide, ואחריו immunostaining וניתוח ציטומטריה זרימה.

ניתוח ההשפעה של תכשירי טבק על ייצור ציטוקינים באמצעות צביעה תוך-תאית וציטומטריית זרימה

בסרטון זה אנו חוקרים את ההשפעה של מדיום שלם המותנה בעשן, הכנת מוצר טבק דליק, על הרג תאי K562 על ידי תאי דם חד-גרעיניים היקפיים.

הריגת תאי K562 על ידי תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם שנחשפו לתכשירי מוצרי טבק

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת ציטוטוקסיות בפרוסות ריאה חתוכות במדויק בבני אדם באמצעות בדיקת WST-1. פרוסות ריאה אנושיות שנחתכו בדייקנות חשופות לריכוזים מצטברים של כימיקל ציטוטוקסי כדי לכמת את ציטוטוקסיות שלהן. ירידה בעוצמת הצבע משמשת אישור להשפעתו המזיקה של הכימיקל על תאי הריאה.

בדיקה למדידת ציטוטוקסיות כימית בפרוסות ריאה חתוכות במדויק בבני אדם

מטרת פרוטוקול זה היא לחשוף מודלים תלת-ממדיים של רקמות הסימפונות והאף האורגנוטיפיים האנושיים לעשן סיגריות מיינסטרים (CS) בממשק אוויר-נוזל. לאחר מכן נחקרת ההשפעה של CS על הרקמות באמצעות בדיקת פעילות ציטוכרום P450, מדידת פעימות ריסים וגישה של ביולוגיה מערכתית.

הערכת השפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של דוגמניות תרבות רקמות Organotypic 3D הסימפונות ובאף לעשן סיגריות שלמות

מטרת המחקר הייתה להעריך את ההשפעה הביולוגית של 15 מרכיבי עשן סיגריות באמצעות שילוב של מנתח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה ופלטפורמה מבוססת סינון בעל תוכן גבוה (HCS) להערכה טוקסיקולוגית במבחנה. מחקר זה מספק מידע על מינונים יעילים, רעילות ודרכי פעולה של התרכובות שנבדקו.

ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחשוף מכרסמים אדי סיגריה אלקטרונית (E-אדי) ועשן סיגריות. תאי החשיפה בנויים על ידי שינוי תאי הרדמה עם מערכת שאיבה אוטומטית המספקת עשן אדים או עשן סיגריות למכרסמים. מערכת זו יכולה בקלות להיות שונה כדי להתאים רבים endpoints ניסיוני.

השוואת ההשפעות של אדי סיגריה אלקטרונית עשן סיגריה ברומן<em&gt; בויבו</em&gt; מערכת חשיפה

כאן, אנו מתארים את התקן מעבדה לתכנות יכול לשמש ליצירת תמציות של תרסיס עשן ואלקטרוניקה סיגריה סיגריה קונבנציונלי. שיטה זו מספקת כלי שימושי עבור ביצוע ההשוואה הישירה בין סיגריות קונבנציונאלי סיגריות אלקטרוניות, הוא נקודת כניסה נגישה לתוך המחקר סיגריה אלקטרונית.

מיקרו-בקר המופעל התקן לדור של נוזלי תמציות קונבנציונאלי סיגריה סיגריה עשן ואלקטרוניקה תרסיס

על רקע העיקרון 3Rs, מודלים הנשימה חלופות מחקרים שנעשו בבעלי חיים כמו מתפתחים. במיוחד עבור הערכת סיכונים מחומרים בדרכי הנשימה, יש מחסור של מבחני המתאים. כאן, אנו מתארים את השימוש אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות להערכה לחומרים הנישאים באוויר.

הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

סיגריה אלקטרונית (e-סיגריה) משתמשים הן הגוברת ברחבי העולם. מעט, עם זאת, ידוע על ההשפעות הבריאותיות המושרה על ידי אירוסולים בשאיפה e-סיגריה. מאמר זה מתאר שיטת דור תרסיס e-cig מתאים חשיפות בעלי חיים, מחקרים מאוחרים יותר רעילות. פרוטוקולים כזה נדרש להקים מערכות חשיפה מתוקננת הדירים השפעול e-סיגריה.

דור של תרסיס סיגריה אלקטרונית על ידי מכשיר הדור השלישי המכונה-Vaping: יישום מחקרים רעילות

אנו מקימים מודל מבחנה סטנדרטי לחקר חשיפה לאדי קנאביס בממשק אוויר-נוזל. מודל זה מספק גישה שיטתית לבחינת ההשפעות של קנאביס מאודה, תוך התייחסות לעניין הגובר במכשירי אידוי קנאביס כחלופה לעישון.

במבחנה חשיפות קנאביס של תאי אפיתל ריאה בממשק אוויר-נוזל

חקור את השפעות תכשירי טבק דליקים על תפקוד תאי דם לבנים מונונוקליאריים (PBMCs) באמצעות שיטות זרימה ציטומטריה. המחקר מעריך דיכוי ציטוקינים והפחתת פעילות ציטוליטית בתאי מערכת החיסון.

שיטות להערכת Cytotoxicity ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרים דליקים טבק

גלה סרטונים נוספים