שיטות להערכת Cytotoxicity ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרים דליקים טבק

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את ההשפעות של הכנת מוצרי טבק על הפרשת ציטוקינים והרג תאי מטרה על ידי P BMCs. זה מושג על ידי טיפול תחילה ב-BMCs P מתורבתים במצב עשן מלא, בינוני או ניקוטין, ולאחר מכן מבוצעת צביעה תוך-תאית של ה-p BMCs המטופלים כדי לקבוע את ייצור הציטוקינים שלהם. לחלופין, תאי CFSE המסומנים K 5 62 הם תרבית משותפת עם תאי אפקטור PBMC שטופלו במדיום מותנה בעשן שלם והכדאיות של תאי K 5 62 מוסמכת על ידי צביעה של שבעה A a d.

בסופו של דבר, ההשפעות של תכשירי מוצרי הטבק הדליקים על ה-P BMCs משתי הבדיקות נמדדות על ידי זרימה ציטומטרית. היתרונות העיקריים של הטכניקות שלנו או השיטות הקיימות, כגון בדיקת שחרור כרום או נקודת ALI הם שהשיטות שלנו הן תפוקה גבוהה, לא רדיואקטיביות, ואנו יכולים למדוד את פונקציונליות התא. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשפעות הביולוגיות של תכשירי מוצרי טבק.

ניתן ליישם אותו גם להערכה של תרכובות אחרות המשפיעות על תפקודי הקולטן המתווך ו-STIC של תאי אפקטור PBMC לפני תחילת הליך הצביעה. לדלל עשן מלא, בינוני וניקוטין בריכוזים המפורטים. ב- RPMI בינוני שלם עד נפח כולל של 100 מיקרוליטר לבאר בצלחת של 96 בארות.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של P BMCs, תלויים במדיום שלם בריכוז של אחד כפול 10 לששת התאים לבאר לנפח כולל של 200 מיקרוליטר לבאר. לאחר מכן, כסו את הצלחת ודגרו אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר שלוש שעות יש לשטוף את התאים ולשאוף את הסופרנטנט.

לאחר מכן מכסים שוב את הצלחת ומערבלים אותה כדי לנתק את הכדורים. שטפו את התאים פעמיים נוספות, פעם אחת במאגר ריצה קר כקרח, ופעם אחת במדיום שלם לאחר הכביסה השנייה. טפל בהם עם 200 מיקרוליטר לבאר של מדיום שלם בתוספת תקע גולגי ו-LPS למשך שש שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

לאחר מכן שטפו את התאים עם מאגר ריצה קר כקרח וטפלו בהם ב -100 מיקרוליטר ציטו לתקן באר בארבע מעלות צלזיוס לאחר 20 דקות, שטפו את התאים שלוש פעמים בשטיפת סלסול קרה כקרח. לאחר מכן הוסיפו 45 מיקרוליטר של ציטו פרם לכל באר ואחריהם חמישה מיקרוליטרים מכל אחד מהנוגדנים הרשומים. לאחר 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את התאים שלוש פעמים וקבעו אותם ב -200 מיקרוליטר קר כקרח, 2% פרה פורמלדהיד.

לאחר מכן העבירו את התאים לצינורות בגודל 12 על 75 מילימטר ונתחו את הדגימות על ציטומטר זרימה. לאחר הכנת צלחת של מוצר טבק שטופל ב-pbmc כפי שהודגם זה עתה, שטפו תרבית של K 5 62 תאים, שנקטפו בשטף של 80% ב-10 מיליליטר DPBS. החייאה. השעו את הגלולה בחמישה מיליליטר DPBS וספרו את התאים.

לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תמיסת עבודה CFSE טרייה שהוכנה לאחד עד פעמיים 10 לתאי K 5 62 השביעי במיליליטר אחד של מדיום שלם ולפזר את כתם התא על ידי מערבולת. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר לאחר שתי דקות בדיוק, הוסיפו 200 מיקרוליטר FBS ומערבלו שוב את התאים, תוך דגירה למשך שתי דקות נוספות. לאחר הדגירה השנייה, יש לשטוף את התאים ב -10 מיליליטר של מדיום שלם, ואז להשעות את הגלולה בעוד 10 מיליליטר של מדיום שלם ולספור את התאים.

עכשיו צנטריפוגה הטבק טיפל ב-p BMCs ושפך את הסופרנטנט. לאחר מכן החלף את המכסה, השהה מחדש את התאים על ידי מערבולת ושטוף אותם ב -200 מיקרוליטר של מדיום שלם לבאר. כדי ליזום את בדיקת ההרג, הוסף את תאי ה-CFSE המסומנים K 5 62 ל-pbmc ביחס של 1 ל-15 ודגר את התרבות המשותפת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

לאחר חמש שעות, סובבו את התאים והשליכו את הסופרנטנט. השעו את הכדורים על ידי מערבולת ולאחר מכן שטפו את התאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר רץ לבאר ואז הוסיפו 95 מיקרוליטר של מאגר רץ, ואחריהם חמישה מיקרוליטר של שבעה A a d לנפח כולל של 100 מיקרוליטר לבאר. לבסוף דגרו את התאים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר פועל לכל באר והעביר את כל הנפח לצינורות הפקס המתאימים כדי לקבוע את האחוז של שבעה תאים חיוביים a a D ו- CFSE. על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי, נצפתה עלייה תלויה במינון במוות התאים עם מדיום מותנה עשן מלא לאחר 24 שעות עם קרוב ל-80% מהתאים המתים בארבעה מיקרוגרם למיליליטר של יחידות ניקוטין סוסים. עם זאת, טיפול ב-p BMCs במשך שלוש שעות בלבד אינו מביא לרעילות משמעותית אפילו בחמישה מיקרוגרם למיליליטר של יחידות ניקוטין סוסים של מדיום מותנה בעשן מלא ב-24 שעות.

דרגה דומה של מוות תאים לא נצפתה לפני הטיפול ב-3000 מיקרוגרם למיליליטר ניקוטין לאחר שלוש שעות, טיפול בניקוטין אינו גורם למוות תאי מדיד לפני הטיפול בריכוז של 2000 מיקרוגרם למיליליטר במצב עשן מלא, בינוני וניקוטין, ואחריו גירוי של קולטן TLR 4 על ידי LPS מביא לירידה תלוית מינון של ציטוקינים מופרשים. למרות שמידת הדיכוי משתנה בין הציטוקינים הבודדים. יתר על כן, כאשר תאים מטופלים ב-LPS ו-Golgi Plug במשך שש שעות בלבד, נצפית ירידה במספר התאים החיוביים לציטוקינים תוך תאיים לאחר חשיפה למדיום במצב עשן שלם, אפילו בריכוזי יחידות הניקוטין הנמוכים יותר בהשוואה לחשיפה לניקוטין.

ואכן, תוצאות בדיקת ההרג הזו ממחישות כי חשיפה ל-1.56 מיקרוגרם למיליליטר של מדיום במצב עשן מלא מפחיתה משמעותית את יכולת ההרג של אוכלוסיית ה-PBMC האפקטור בהשוואה לביקורת ולריכוזי המינון הנמוכים יותר. בעוד שטיפול בניקוטין בריכוזים גבוהים או נמוכים אינו מפריע ליכולת ההרג של אוכלוסיית האפקטור PBMC בזמן ניסיון הליכים אלה. חשוב לדייק בתיוג CFSE כמו גם בדילול נוגדנים, זמן תיוג וטמפרטורות הדגירה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בטכניקות תיוג נוגדנים בזרימה ציטומטרית כדי לקבוע את ההשפעות של תכשירי מוצרי טבק או טיפולים אחרים על תאים חד-גרעיניים בדם היקפי.