הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

מטרת הליך זה היא למדוד במדויק את ההשפעה שיש לנוירוטוקסינים קלוסטרידיים על העברה סינפטית בתרביות מרושתות של נוירונים שמקורם בתאי גזע עובריים של עכברים. זה מושג על ידי התאמת תאי גזע עובריים תחילה לתרבית תרחיף נטולת תאי הזנה ושמירה על תאים מותאמים במצב פלוריפוטנטי. השלב השני הוא להבדיל תאי גזע מותאמים לתרחיף לנוירונים או ESNs, תוך שימוש בווריאציה של טכניקת ארבע ההתמיינות.

לאחר מכן, ESNs מטופלים בסדרה של מדיה כדי לקדם התבגרות לנוירונים מרושתים פעילים סינפטית. השלב האחרון הוא לטפל ב-ESNs עם קלוסטרידיאל, נוירוטוקסינים או נוירוטוקסינים אחרים ולמדוד את ההשפעות על הפעילות הסינפטית המונוס באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תא שלם. בסופו של דבר, שינויים בייצור הספונטני של פעילות סינפטית מונוס מכומתים על ידי רישומים אלקטרופיזיולוגיים מנורמלים לנוירוני בקרה תואמי גיל ומגבה, ומושווים בין מצבים שונים כגון מינונים, זמנים או טיפולים תרופתיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ש-ESNs הם המודל מבוסס התאים הראשון שמשכפל את הפתולוגיות התפקודיות האחראיות לביטויים הקליניים של בוטוליזם וטטנוס. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר גילינו ש-ESNs רגישים מאוד לכל הנוירוטוקסינים הקלוסטרידיים בהתבסס על מחשוף חלבון מלכודת, וגם הפגינו פעילות סינפטית ספונטנית בהתנהגות רשת מתהווה. תדגים את ההליך גב' מייגן ליימן, טכנאית מהמעבדה שלי Begin על ידי העברת תרבית תרחיף ללא תאי הזנה מותאמת.

אגרגטים ESC לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומאפשרים לאגרגטים להתיישב לכדור קומפקטי. לאחר שהאגרגטים התייצבו, שאפו את ה-SUP natant תוך הקפדה לא לשבש את כדור התא. לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר PBS כדי לשטוף את התאים והצנטריפוגה ב 100 פעמים G למשך 2.5 דקות.

שאפו בזהירות את ה-PBS ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר טריפסין והפכו את הצינור מספר פעמים כדי לשבש בעדינות את כדור התא. לאחר מכן הניחו את הצינור באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס ודגרו למשך שלוש דקות. לאחר שחלף זמן הדגירה, החזירו את הצינור למכסה המנוע של תרבית הרקמה והוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום ESC כדי לדלל את הטריפסין.

לאחר מכן חזר על מתלה CEL חמש עד 10 פעמים עם פיפטה P 1000 כדי להשיג מתלה תא יחיד. ספרו אלוקה של התאים באמצעות המו, ציטומטר וצנטריפוגה את שארית תרחיף התאים ב -200 פעמים G למשך שלוש דקות. לאחר שאיבת הסופינט, אנו משעים את התאים לריכוז סופי של פי אחוז, שבעת התאים למיליליטר עם מדיום ESC.

העברה הבאה, 150 מיקרוליטר של התרחיף ל -10 מיליליטר של מדיום ESC בצלחת חיידקים של 10 סנטימטר ודגירה ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. E ESCs מועברים באופן שגרתי באמצעות פרוטוקול זה. כל 48 שעות מתחילה התמיינות של תאי גזע עובריים לתאי עצב במהלך מעבר תאים שגרתי.

נתק את ה-ESCs כמו קודם, אך כלול צלחת נוספת להתמיינות עצבית. העבירו 350 מיקרוליטר של מתלה התא לתוך צלחת חיבור נמוכה של 10 ס"מ המכילה 25 מיליליטר של התמיינות. בינוני. הניחו את המנה על שייקר אורביטלי המוגדר ל-30 עד 45 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית רקמות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ודגרו למשך 48 שעות.

לאחר 48 שעות, השתמש בפיפטה של 25 מיליליטר כדי להעביר את אגרגטי התאים המבדלים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. מיד לאחר מכן מוסיפים 25 מיליליטר של בידול טרי. בינוני לצלחת הפטרי.

אפשר לאגרגטים להתיישב במשך שתיים עד חמש דקות, וליצור כדור גלוי בעומק של מילימטר עד שניים. שאפו בזהירות את המדיום, התעלמו מכל תא בודד או אגרגט קטן שעדיין בתרחיף, והשתמשו בפיפטה P 1000 כדי להעביר את פלטת התאים בחזרה לצלחת הפטרי. מחזירים את המנה לשייקר הסיבובי בחממה.

לאחר 48 שעות נוספות, חזור על הליך החלפת המדיה. הפעם ב-30 מיליליטר של מדיום התמיינות בתוספת שישה מיקרו-מולרים חומצה טראנס רטינואית. הכדור שנוצר יהיה כעת בעומק של שניים עד ארבעה מילימטרים לאחר הדגירה של התאים.

כמו קודם, חזור על הליך החלפת המדיה עם תוספת חומצה רטינואית בפעם האחרונה. הכדור יהיה בעומק של ארבעה עד שמונה מילימטרים בשלב זה למחרת. הכן את משטחי הציפוי כמתואר בחלק הכתוב של הפרוטוקול בשעות אחר הצהריים של יום הציפוי, או חמישה מיליליטר כל אחד של מדיום טריפסין MPC מצופה מראש ומעכב טריין פולי סויה 0.1% ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן השתמש בפיפטה של 25 מיליליטר כדי להעביר אגרגטים מבדלים מלוח התרבות לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. הניחו לאגרגטים להתיישב במשך שלוש עד חמש דקות ואז שאפו בזהירות את המדיום מבלי להפריע לגלולה. לאחר מכן, שטפו את הגלולה עם חמישה עד 10 מיליליטר PBS ולאחר שהאגרגטים התייצבו.

שאפו את ה-PBS וחזרו על הכביסה. לאחר שטיפת ה- PBS השנייה. הוסף חמישה מיליליטר של מדיום איזלציה MPC לגלולה ודגר אותו 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

יש להניף בעדינות את הצינור פעמיים-שלוש במהלך הדגירה. לאחר מכן, הוסף לתאים חמישה מיליליטר של מעכב טריפסין פולי סויה 0.1% וערבב במהירות על ידי היפוך. לאחר מכן טרטר בעדינות את התאים 10 עד 15 פעמים עם פיפטה של 10 מיליליטר עד ליצירת תרחיף תאים הומוגני יחסית.

סנן לאט את מתלה התאים דרך מסננת תאים של 40 או 70 מיקרון המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן לאחר שכל המתלים סוננו במיליליטר אחד של N שתיים, בינוני למסנן כדי לשטוף את התאים הנותרים דרך המסננת. העבירו את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה למשך שש דקות ב-200 פעמים G.לאחר שאיבת המדיום מבלי להפריע לכדור טריטוראט בשני מיליליטר של N שני מדיום, ואז הוסף N שני בינוני לנפח כולל של 10 מיליליטר.

צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 פעמים. ז. שאפו את המדיה וחזרו שוב על תהליך שטיפת הגלולות. Resus משהה את הגלולה ב -10 מיליליטר של N שני בינוני.

הסר אליקוט של התאים וספור בעזרת ציטומטר המו, ולאחר מכן חזור על הצנטריפוגה ריס. השעו את התאים ב-N שני בינוניים לריכוז סופי של אחד כפול 10 לשבעת התאים למיליליטר וצלחו אותו בצפיפות של 150,000 עד 200,000 תאים לסנטימטר בריבוע. הודית מכינים ב-DIV מינוס אחד ומניחים בחממת תרבית הרקמה ב-37 מעלות צלזיוס.

שמור על ESN בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב. ראשית, יש לדלל את סרוטיפ הנוירוטוקסין של בוטולינום פי 100 מהריכוז הסופי הרצוי בתרבית ESN, בינוני וחם עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף נפח מתאים של רעלן ל-DIV 21 בתוספת תרביות ESN.

נפחו את צלחת התרבות וחזרו לחממה בזמן הרצוי. נקודתי שאפו את מדיום תרבית ה-ESN ושטפו פעמיים עם מאגר הקלטה חוץ-תאי או ERB. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר של ERB בתוספת חמישה טטרודטוקסין מיקרו-מולרי כדי לחסום פוטנציאל פעולה ו-10 מיקרו-מולרי בי קולין כדי לנטרל את פעילות קולטני הגבאה.

לאחר מכן, העבירו את המנה למתקן האלקטרופיזיולוגיה. אין צורך בזילוף או בבקרת טמפרטורה לעיכוב נמדד של העברה סינפטית או בדיקת ערפל. לאחר שימוש במושך מיקרו פיפטה כדי למשוך פיפטות בו סיליקט עם התנגדות של חמישה עד 10 מגה-אוהם, מלא מחדש פיפטה עם מאגר הקלטה תוך תאי.

לאחר מכן טבלו בעדינות את הפיפטה במגיב סיליקון. אבטח את פיפטת ההקלטה על מחזיק האלקטרודה והצמד מזרק מלא אוויר לצינור המועבר למחזיק האלקטרודה. ספק לחץ חיובי יציב דרך המזרק תוך הורדת פיפטת ההקלטה לתוך ה-ERB.

לאחר הנחתת פיפטת ההקלטה בעדינות על ה-SOR של הנוירון להקלטה. ראה לחץ חיובי על ידי שבירת החותם על המזרק. חברו מחדש את המזרק והפעילו לחץ שלילי מתמשך באמצעות השראה עדינה ליצירת אטימה של ג'יגה אוהם.

לאחר שנוצר אטם הג'יגה, הורד את מתח ההחזקה למינוס 70 מילי-וולט. לאחר מכן הפעל בזהירות פולסים קצרים של לחץ שלילי באמצעות המזרק כדי לפרוץ לתצורת תא שלמה. עקוב אחר עליות קיבול למשך 30 שניות כדי לוודא שהתיקון יציב.

בטל את קפיצות הקיבול בתוכנת HEA ועבור למצב מהדק זרם כדי לנטר ולתעד את פוטנציאל הממברנה במנוחה ללא התאמה לפוטנציאל צומת נוזל. פוטנציאל הממברנה במנוחה יכול להיות בין מינוס 67 למינוס 82 מילי-וולט. כוונן את הרווח לשני מילי-וולט לכל פיקו מגבר.

עבור למצב מהדק מתח ובצע הקלטה רציפה של מינוס 70 מילי-וולט למשך שלוש עד חמש דקות כדי לזהות זרמים מעוררים זעירים, פוסט-סינפטיים. נתח שלוש עד חמש דקות של נתונים מוקלטים כדי לזהות לי PSCs באמצעות הגדרות ברירת מחדל עבור EPCs של קולטני AMPA בניתוח מיני, אסוף ושמור מידע על אירועים שזוהו. לאחר איסוף תדרי M-E-P-S-C עבור שמונה עד 12 בקרות ושמונה עד 12 דגימות שטופלו בנוירוטוקסין בוטולינום עבור כל מצב חשיפה.

נתח את התדירות מול בקרות תואמות גיל ומגרש, ולאחר מכן קבע את המובהקות הסטטיסטית של אחוז עיכוב הפעילות הסינפטית באמצעות מבחנים סטטיסטיים מתאימים מ-div 7 עד div 49, ESNs מבטאים תאים נוירוטרופיים ויוצרים ניקוב סינפטי. ממשקים דנדריטיים של טקסו. ESNs עוברים עיכוב של פעילות סינפטית כאשר הם נחשפים לסרוטיפים של רעלן עצבי בוטולינום, רעלן TG וטטנוס.

עקבות מייצגים אלה מ-ESNs נאספו 20 שעות לאחר מהדורת האמבטיה של סרוטיפים נוירוטוקסינים של בוטולינום, טטנוס TG, נוירוטוקסין או רכב. כל נוירוטוקסין הפחית את הפעילות הסינפטית ביותר מ-95% בהשוואה לביקורת. ארבע התמונות הבאות מראות את הרגישות של שימוש בערפל למדידת פעילות סינפטית מונוסית בסרוטוטיפ נוירוטוקסין בוטולינום, ESNs שטופלו A.

תמונה ראשונה זו מציגה עקבות מייצגים ממדידות שהוחמצו של פעילות סינפטית 20 שעות לאחר מהדורת האמבטיה של סרוטיפ נוירוטוקסין בוטולינום A. מקטעי העקבות של מהדק המתח הראו ירידה בתדר M-E-P-S-C בעקבות חשיפה לסרוטיפ נוירוטוקסין בוטולינום A. תמונה זו מציגה כימות של תדר M-E-P-S-C ומאשרת ירידה תלוית מינון בתדר M-E-P-S-C. ריכוז המעכב החציוני נקבע עם התאמת הריבועים הפחותים של רגרסיה לא ליניארית באמצעות שיפוע משתנה של ארבעה פרמטרים. שימו לב, מגבלת הזיהוי על ידי ערפל ב-SNS היא לפחות 0.005 picaMolar.

גרף עמודות זה מציג כימות ציטומטריה של מחשוף SNAP 25 שנמדד על ידי כתם מערבי. שימו לב לרגישות המופחתת של מחשוף חלבון המלכודת כקריאה של שיכרון. בהשוואה לערפל, כוכבית בודדת מציינת ערך P של פחות מ-0.05.

כוכבית משולשת מציינת ערך P של פחות מ-0.001. ממצאים אלה מדגימים כי אוכלוסיות מרושתות של נוירונים שמקורם בתאי גזע מציעות מודל מבוסס תאים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של הרעלת נוירוטוקסין קלוסטרידיאלי. השימוש ב-SNS צפוי להפחית משמעותית את המצוקה והמוות של בעלי חיים על ידי שימוש כתחליף הולם לבדיקת הקטלניות של העכברים, עם היתרון הנוסף של שיפור המהירות, הספציפיות והרגישות.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוטוקסיקולוגיה להשתמש בטכניקות סינון תפוקה מתונות המבוססות על פעילות רשת עצבית כדי להקל על סינון טיפולי וזיהוי רעלים עבור נוירוטוקסינים קלוסטרידיאליים.