הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

מטרתו של הליך זה היא למדוד במדויק את ההשפעה של נוירוטוקסינים של Clostridia על התמסורת הסינפטית בתרביות רשתיות של נוירונים המופקים מתאי גזע עובריים של עכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי התאמת תאי גזע עובריים לתרבית סספנסיות נטולת תאי מאכילה (feeder cell-free) ושמירת התאים המותאמים במצב פלוריפוטנטי. השלב השני הוא גילוי תאי הגזע המותאמים לסספנסיות לנוירונים או ESNs, תוך שימוש בוריאציה של טכניקת הדיפרנציאציה הארבע-ארבע.

בשלב הבא, מטפלים ב-ESNs בסדרה של מצעי גידול כדי לעודד הבשלה לנוירונים רשתיים פעילים סינפטית. השלב הסופי הוא טיפול של ESNs ב-clostridial neurotoxins או נוירוטוקסינים אחרים, ומדידת ההשפעות על פעילות מונוסינפטית באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של whole cell patch clamp. לבסוף, שינויים בייצור הספונטני של פעילות מונוסינפטית מכמתים מתוך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות המנורמלות לנוירוני ביקורת תואמי גיל וסדרה, ומושווים בין תנאים שונים כגון מינונים, זמנים או טיפולים תרופתיים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא ש-ESNs הם המודל התאי הראשון המשחזר את הפתולוגיות התפקודיות האחראיות לביטויים הקליניים של בוטוליזם וטטנוס. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר מצאנו ש-ESNs רגישים מאוד לכל הנוירוטוקסינים של ה-clostridia על בסיס פירוק של חלבוני snare, והפגינו גם פעילות סינפטית ספונטנית בהתנהגות רשתית מתהווה. את הפרוצדורה תדגים גב' Megan Lyman, טכנאית מהמעבדה שלי. התחילו בהעברת תרבית סספנסיות מותאמת ללא תאי מאכילה (feeder cell-free).

העבירו את אגרגטי ה-ESC למבחנה קונית של 15 milliliter והמתינו עד שהאגרגטים ישקעו לכדי pellet דחוס. לאחר ששקעו האגרגטים, שאבו את ה-SUP natant תוך זהירות כדי לא להפריע ל-pellet התאים. לאחר מכן, הוסיפו חמישה milliliters של PBS כדי לשטוף את התאים וסובבו בצנטריפוגה ב-100 times G למשך 2.5 minutes.

שאבו בזהירות את ה-PBS ולאחר מכן הוסיפו 500 µL של trypsin והפכו את המבחנה מספר פעמים כדי לפרק בעדינות את משקע התאים. לאחר מכן, הניחו את המבחנה באמבט מים של 37 °C והדגירו למשך שלוש דקות. לאחר סיום זמן הדגירה, החזירו את המבחנה למנדף תרביות הרקמה והוסיפו 500 µL של מצע ESC כדי לדלל את ה-trypsin.

לאחר מכן, בצעו טריטורציה (titrate) של תרחיף ה-CEL חמש עד 10 פעמים באמצעות פיפט P 1000 כדי להגיע לתרחיף של תאים בודדים. ספרו אליקוטה של התאים באמצעות המוציטומטר וסובבו את שאר תרחיף התאים בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך שלוש דקות. לאחר שאיבת העלייה (supernatant), תלו את התאים לריכוז סופי של 1×10⁷ תאים למילליטר באמצעות מצע ESC.

בשלב הבא, העבירו 150 µL מהסספנסיה ל-10 mL של מצע ESC בצלחת חיידקים של 10 cm, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. תאי ESC מועברים באופן שגרתי באמצעות פרוטוקול זה. מדי 48 שעות מתחיל תהליך התמיינות של תאי ESC לנוירונים במהלך מעבר תאים שגרתי.

בצע הפרדה של ה-ESCs כפי שנעשה קודם לכן, אך הוסף צלחת נוספת עבור התמיינות נוירונלית. העבר 350 microliters של תגלי התאים לתוך צלחת low attachment בקוטר 10 centimeter המכילה 25 milliliters של differentiation Medium. הנח את הצלחת על מנער אורביטלי (orbital shaker) המכוון ל-30 עד 45 RPM בתוך אינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide, והדגר למשך 48 שעות.

לאחר 48 שעות, השתמשו בפיפט של 25 מיליליטר כדי להעביר את אגרגטי התאים המבדילים למבחנה קונית של 50 מיליליטר. מיד לאחר מכן, הוסיפו 25 מיליליטר של מצע בידול טרי לצחנת הפטרי.

המתינו שתי עד חמש דקות להשקעת האגרגטים, עד להיווצרות משקואה נראית לעין בעומק של 1 עד 2 מילימטרים. שאבו בזהירות את המצע, תוך התעלמות מתאים בודדים או מאגרגטים קטנים שעדיין נמצאים בסספנסיה, והשתמשו בפיפט P 1000 כדי להעביר את משק התאים בחזרה לצלחת הפטרי. החזירו את הצלחת למנער הסיבובי שבתוך האינקובטור.

לאחר 48 שעות נוספות, חזור על הליך החלפת המצע. הפעם השתמש ב-30 milliliters של מצע דיפרנציאציה המועשר ב-six micromolar all trans retinoic acid. המשקע שייווצר יהיה כעת בעומק של שני עד ארבעה מילימטרים לאחר דגירת התאים.

כפי שבוצע קודם לכן, חזור על הליך החלפת המצע עם תוספת של רטינואיק אסיד בפעם האחרונה. בנקודה זו, למחרת, עומק המשקע יהיה ארבעה עד שמונה מילימטרים. הכן את משטחי הזריעה כפי שמתואר בחלק הכתוב של הפרוטוקול בשעות אחר הצהריים של יום הזריעה, או הכן 5 mL של מצע טריפסין MPC מצופה מראש ו-0.1% מעכב טריפסין מפוליסויה בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר מכן, השתמשו בפיפט של 25 מיליליטר כדי להעביר את המקבצים המבדילים מהצלחת התרבית לפראקום קוני של 50 מיליליטר. המתינו שלוש עד חמש דקות עד שהמקבצים ישקעו, ואז שאבו בזהירות את המצע מבלי להפריע למשקע. לאחר מכן, שטפו את המשקע עם 5 עד 10 מיליליטר של PBS לאחר שהמקבצים שקעו.

שאבו את ה-PBS וחזרו על השטיפה. לאחר שטיפת ה-PBS השנייה, הוסיפו חמישה מיליליטרים של MPC ization medium למשקע והדגירו אותו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך חמש דקות.

יש לנער בעדינות את המבחנה פעמיים עד שלוש פעמים במהלך הדגירה. לאחר מכן, יש להוסיף לתאים 5 milliliters של מעכב טריפסין מפוליסויה 0.1% ולערבב במהירות על ידי היפוך. לאחר מכן, יש לבצע טריטורציה עדינה של התאים 10 עד 15 פעמים באמצעות פיפטה של 10 milliliter עד לקבלת תרחיף תאים הומוגני יחסית.

סננו לאט את תרחיף התאים דרך מסנני תאים של 40 או 70 מיקרון המוצב על גבי מבחנה קונית של 50 מיליליטר. לאחר שכל התרחיף סונן, הוסיפו 1 מיליליטר של מצע N2 למסנן כדי לשטוף את התאים שנותרו דרכו. העבירו את תרחיף התאים למבחנה קונית של 15 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה במשך שש דקות ב-200×g. לאחר שאיבת המצע מבלי להפריע למשקע, בצעו טריטורציה ב-2 מיליליטר של מצע N2, ולאחר מכן הוסיפו מצע N2 עד לנפח כולל של 10 מיליליטר.

סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 ×g. שאבו את המדיום וחזרו שוב על תהליך שטיפת המשקע. השביו את המשקע ב-10 milliliters של מדיום N2.

הסיר מנה (aliquot) של התאים וספור אותם באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer), ולאחר מכן חזור על תהליך הצנטריפוגה. השהה את התאים במצע N2 עד לריכוז סופי של 1×10⁷ תאים למילליטר, והעבר אותם לצלחת בריכוז של 150,000 עד 200,000 תאים לסנטימטר רבוע. הכן את ה-Indic ב-DIV מינוס 1 והנח אותו באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37°C.

יש לתחזק את ה-ESNs בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב. ראשית, יש לדלל רעל בוטולינום מסוג סרוטיפ A לריכוז הגבוה פי 100 מהריכוז הסופי הרצוי בתרבית ESN, במדיה, ולחמם ל-37 °C. לאחר מכן, יש להוסיף נפח מתאים של רעל לתרביות DIV 21 פלוס ESN.

הנחו את צלחת התרבית להתנפח והחזירו אותה לאנקובטור בזמן הרצוי. שאבו באופן נקודתי את מצע התרבית ESN ושטפו פעמיים עם חוצץ להקלטה חוץ-תאית או ERB. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטרים של ERB מועשר ב-5 µM טטרודוטוקסין לחסימת פוטנציאלי פעולה וב-10 µM ביקולין לעיכוב פעילות קולטני gabaa.

בשלב הבא, העבירו את הצלחת למערכת האלקטרופיזיולוגיה. לא נדרשים פרפוזיה או בקרת טמפרטורה עבור מדידת העכבה של ההעברה הסינפטית או עבור בדיקת ה-mist. לאחר שימוש במכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות כדי למשוך פיפטות בורוסיליקט עם התנגדות של 5 עד 10 mega ohms, מלאו פיפטה בבופר להקלטה תוך-תאית.

לאחר מכן, טבול בעדינות את הפ pipette בריאגנט סיליקון. חבק את הפ pipette להקלטה על תומך האלקטרודה וחבר מזרק מלא באוויר לצינור המחובר לתומך האלקטרודה. הגש לחץ חיובי קבוע באמצעות המזרק תוך כדי הורדת הפ pipette להקלטה אל תוך ה-ERB.

לאחר הנחה עדינה של פיפט ההקלטה על ה-SOR של הנוירון המיועד להקלטה, בדוק את הלחץ החיובי על ידי שבירת האטם במזרק. חבר מחדש את המזרק והפעל לחץ שלילי מתמשך באמצעות שאיפה עדינה כדי ליצור אטם בגודל ג'יגה-אוהם (giga ohm seal).

לאחר שנוצר אטום ה-giga ohm, הפחית את מתח השמירה ל-70- millivolts. לאחר מכן, החל בזהירות בפולסים קצרים של לחץ שלילי באמצעות המזרק כדי לעבור לקונפיגורציית תא שלם (whole cell). עקוב אחר קפיצות בקיבול (capacitance spikes) למשך 30 שניות כדי לוודא שהפאץ' יציב.

בטלו את קפיצות הקיבול (capacitance spikes) בתוכנת ה-HEA ועברו למצב current clamp כדי לנטר ולהקליט את פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה ללא התאמה עבור פוטנציאלי צומת נוזליים. פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה עשוי להיות בין 67- ל-82- מיליוולט. כווננו את ההגבר (gain) לשני מיליוולט ל-pico amp.

עברו למצב clamp של מתח ובצעו הקלטה רציפה של 70- millivolts למשך שלוש עד חמש דקות כדי לזהות זרמים פוסט-סינפטיים עירורי מיניאטוריים. נתחו שלוש עד חמש דקות של נתונים שהוקלטו כדי לזהות me PSCs באמצעות הגדרות ברירת המחדל עבור EPCs של קולטן AMPA בניתוח mini, ואספו ושמרו מידע על האירועים שזוהו. לאחר מכן, אספו תדרי m-e-p-s-c עבור שמונה עד 12 ביקורות ושמונה עד 12 דגימות שטופלו בבוטולינום נוירוטוקסין עבור כל תנאי חשיפה.

נתחו את השכיחות אל מול ביקורות תואמות לגיל ואומה, ולאחר מכן קבעו את המובהקות הסטטיסטית של אחוז העכבה של הפעילות הסינפטית באמצעות מבחנים סטטיסטיים מתאימים; מיום שביעי ליום 49 (div 7 עד div 49), ESNs מבטאים מדורים נוירוטרופיים ומגבשים נקבים סינפטיים. ממשקים דנדריטיים טקסו. ESNs עוברים עכבה של הפעילות הסינפטית בעת חשיפה לסרוטיפי botulinum neurotoxin a TG ורעל טטנוס.

עקבות מייצגים אלו מ-ESNs נאספו 20 שעות לאחר הוספה למקלחת של סרוטיפים של נוירוטוקסין בוטולינום A, נוירוטוקסין של טטנוס או חומר נשאי (vehicle). כל נוירוטוקסין הפחית את הפעילות הסינפטית ביותר מ-95% בהשוואה לבקרות. ארבע התמונות הבאות מראות את הרגישות של שימוש ב-mEPSC למדידת פעילות מונו-סינפטית ב-ESNs שטופלו בסרוטיפ A של נוירוטוקסין בוטולינום.

תמונה ראשונה זו מציגה עקבות מייצגים ממדידות של פעילות סינפטית 20 שעות לאחר הוספה לאמבט של botulinum neurotoxin serotype A. מקטעי עקבות ה-voltage clamp הראו ירידה בתדירות ה-M-E-P-S-C בעקבות חשיפה ל-botulinum neurotoxin serotype A. תמונה זו מציגה כימות של תדירות ה-M-E-P-S-C ומאשרת ירידה תלוית-מינון בתדירות ה-M-E-P-S-C. הריכוז העיקבי החציוני נקבע באמצעות התאמת ריבועים פחותים של רגרסיה לא-ליניארית תוך שימוש במדרון משתנה בעל ארבעה פרמטרים. שימו לב, גבול הגילוי ב-SNS הוא לפחות 0.005 picaMolar.

תרשים עמודות זה מציג כימות ציטומטרי של ביקוע SNAP 25 שנמדד באמצעות western blot. שימו לב לרגישות המופחתת של ביקוע חלבוני snare כמדד להרעלה. בהשוואה ל-mist, כוכבית בודדת מציינת ערך P של פחות מ-0.05.

שלוש כוכביות מצביעות על ערך P הנמוך מ-0.001. ממצאים אלו מוכיחים כי אוכלוסיות מרושתות של נוירונים המופקים מתאי גזע מהוות מודל תאי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית להרעלת נוירוטוקסין קלוסטרידיאלי. השימוש ב-SNS צפוי להפחית באופן משמעותי את הסבל והמוות של בעלי חיים, על ידי כך שישמש כתחליף מתאים לבדיקת קטלניות בעכברים, עם היתרון הנוסף של מהירות, סגוליות ורגישות משופרות.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הנוירו-טוקסיקולוגיה להשתמש בשיטות סריקה בעלות תפוקה בינונית, המבוססות על פעילות רשת עצבית, כדי להקל על סריקה טיפולית וזיהוי רעלים עבור רעלנים עצביים של קלוסטרידיום.