Name: איתור של foodborne פתוגנים חיידקיים מזבובי הפרט Filth (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: למדו פרוטוקול PCR לזיהוי פתוגנים חיידקיים כמו Salmonella ו-Listeria מזבובי פרת. שיטה זו מאפשרת גילוי מהיר ואמין של חיידקים ממקורות סביבתיים במהלך חקירת התפרצויות מזון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה לבן ד. טאל, יי צ'ן ותומאס האמאק ממינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA), המרכז לבטיחות מזון ותזונה יישומית (CFSAN) על הסקירה הביקורתית של כתב היד. המחברים מודים גם לחנה לי (תוכנית התמחות מחקרית, המכון המשותף לבטיחות מזון ותזונה יישומית (JIFSAN), אוניברסיטת מרילנד) על סיוע במעבדה ולדיוויד ויינגרטנר (FDA, CFSAN) על הכנת איור הסקירה הסכמטית המוצגת בסרטון.

<ol><li>Voeller, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZurek%2C+L+%22Wiley+Handbook+of+Science+and+Technology+for+Homeland+Security%22">Wiley Handbook of Science and Technology for Homeland Security</a>. , Wiley Inc. 1-16 (2008).</li>
<li>Olsen, A. R., Gecan, J. S., Ziobro, G. C., Bryce, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+action+criteria+for+filth+and+other+extraneous+materials+V.+Strategy+for+evaluating+hazardous+and+nonhazardous+filth%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulatory action criteria for filth and other extraneous materials V. Strategy for evaluating hazardous and nonhazardous filth.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 33 (3), 363-392 (2001).</li>
<li>Hald, B., Skovgård, H., Pedersen, K., Bunkenborg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influxed+insects+as+vectors+for+Campylobacter+jejuni+and+Campylobacter+coli+in+Danish+broiler+houses%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Influxed insects as vectors for Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in Danish broiler houses.</a> Poultry Science. 87 (7), 1428-1434 (2008).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Houseflies%3A+Not+simple+mechanical+vectors+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Houseflies: Not simple mechanical vectors of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 61 (4), 625-629 (1999).</li>
<li>Pava-Ripoll, M., Pearson, R. E. G., Miller, A. K., Ziobro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+relative+risk+of+Cronobacter+spp.%2C+Salmonella+spp.%2C+and+Listeria+monocytogenes+associated+with+the+body+surfaces+and+guts+of+individual+filth+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and relative risk of Cronobacter spp., Salmonella spp., and Listeria monocytogenes associated with the body surfaces and guts of individual filth flies.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (22), 7891-7902 (2012).</li>
<li>Hewitt, C. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHewitt%2C+CG+%22Houseflies+and+how+they+spread+disease%22">Houseflies and how they spread disease</a>. , Cambridge University Press. (1912).</li>
<li>Rochon, K., Lysyk, T. J., Selinger, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+Escherichia+coli+by+house+fly+and+stable+fly+%28Diptera%3AMuscidae%29+during+pupal+metamorphosis+and+eclosion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Retention of Escherichia coli by house fly and stable fly (Diptera:Muscidae) during pupal metamorphosis and eclosion.</a> Journal of Medical Entomology. 42 (3), 397-403 (2005).</li>
<li>Greenberg, B., Kowalski, J. A., Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+transmission+of+Salmonella+by+flies%3A+natural+resistance+to+colonization+and+bacterial+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the transmission of Salmonella by flies: natural resistance to colonization and bacterial interference.</a> Infection and Immunity. 2 (6), 800-809 (1970).</li>
<li>Mramba, F., Broce, A. B., Zurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+of+stable+flies%2C+Stomoxys+calcitrans+L.+%28Diptera%3AMuscidae%29%2C+for+Enterobacter+sakazakii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Ecology%22%5BJournal%5D)">Vector competence of stable flies, Stomoxys calcitrans L. (Diptera:Muscidae), for Enterobacter sakazakii.</a> Journal of Vector Ecology. 32 (1), 134-139 (2007).</li>
<li>Ekdahl, K., Normann, B., Andersson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Could+flies+explain+the+elusive+epidemiology+of+campylobacteriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Could flies explain the elusive epidemiology of campylobacteriosis.</a> Bmc Infectious Diseases. 5 (11), 11(2005).</li>
<li>Nayduch, D., Noblet, G. P., Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+potential+of+houseflies+for+the+bacterium+Aeromonas+caviae%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+and+Veterinary+Entomology%22%5BJournal%5D)">Vector potential of houseflies for the bacterium Aeromonas caviae.</a> Medical and Veterinary Entomology. 16 (2), 193-198 (2002).</li>
<li>Multistate and Nationwide Foodborne Outbreak Investigations: A Step-by-Step Guide. , CDC. Atlanta, GA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/foodsafety/outbreaks/investigating-outbreaks/investigations/index.html">http://www.cdc.gov/foodsafety/outbreaks/investigating-outbreaks/investigations/index.html</a> (2013).</li>
<li>Sievert, K., Messler, S., Klimpel, S., Feffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+study+on+the+occurrence+and+distribution+of+pathogenic+microorganisms+carried+by+synanthropic+flies+caught+at+different+rural+locations+in+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive study on the occurrence and distribution of pathogenic microorganisms carried by synanthropic flies caught at different rural locations in Germany.</a> Journal of Medical Entomology. 46 (5), 1164-1166 (2009).</li>
<li>Hernández-Escareño, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Enterobacteriaceae%2C+Listeria+spp.%2C+Vibrio+spp.+and+Staphylococcus+spp.+in+house+fly+%28Musca+domestica+L.%29%2C+collected+and+macerated+from+different+sites+in+contact+with+a+few+animals+species%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Cientifica-Facultad+De+Ciencias+Veterinarias%22%5BJournal%5D)">Presence of Enterobacteriaceae, Listeria spp., Vibrio spp. and Staphylococcus spp. in house fly (Musca domestica L.), collected and macerated from different sites in contact with a few animals species.</a> Revista Cientifica-Facultad De Ciencias Veterinarias. 22 (2), 128-134 (2012).</li>
<li>Mian, L. S., Maag, H., Tacal, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Salmonella+from+muscoid+flies+at+commercial+animal+establishments+in+San+Bernardino+county%2C+California%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Ecology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Salmonella from muscoid flies at commercial animal establishments in San Bernardino county, California.</a> Journal of Vector Ecology. 27 (1), 82-85 (2002).</li>
<li>Olsen, A. R., Hammack, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Salmonella+spp.+from+the+housefly%2C+Musca+domestica+L.%2C+and+the+dump+fly%2C+Hydrotaea+aenescens+%28Wiedemann%29+%28Diptera%3AMuscidae%29%2C+at+caged-layer+houses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Isolation of Salmonella spp. from the housefly, Musca domestica L., and the dump fly, Hydrotaea aenescens (Wiedemann) (Diptera:Muscidae), at caged-layer houses.</a> Journal of Food Protection. 63 (7), 958-960 (2000).</li>
<li>Holt, P. S., Geden, C. J., Moore, R. W., Gast, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis+from+houseflies+%28Musca+domestica%29+found+in+rooms+containing+Salmonella+serovar+Enteritidis-challenged+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Salmonella enterica serovar Enteritidis from houseflies (Musca domestica) found in rooms containing Salmonella serovar Enteritidis-challenged hens.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (19), 6030-6035 (2007).</li>
<li>Mramba, F., Broce, A., Zurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Enterobacter+sakazakii+from+stable+flies%2C+Stomoxys+calcitrans+L.+%28Diptera%3AMuscidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Isolation of Enterobacter sakazakii from stable flies, Stomoxys calcitrans L. (Diptera:Muscidae).</a> Journal of Food Protection. 69 (3), 671-673 (2006).</li>
<li>Koyuncu, S., Andersson, M. G., Haggblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+Sensitivity+of+Commercial+PCR-Based+Methods+for+Detection+of+Salmonella+enterica+in+Feed%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and Sensitivity of Commercial PCR-Based Methods for Detection of Salmonella enterica in Feed.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (9), 2815-2822 (2010).</li>
<li>Gagné, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+and+mite+pests+in+food%2C+an+illustrated%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Insect and mite pests in food, an illustrated.</a> 1, U.S. Department of Agriculture and U.S. Department of Health and Human Service. 269-296 (1991).</li>
<li>Greenberg, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenberg%2C+B+%22Flies+and+disease%2C+Vol+I.+Ecology%2C+classification+and+biotic+associations%22">Flies and disease, Vol I. Ecology, classification and biotic associations</a>. , Princeton University Press. (1971).</li>
<li>Wallace, H. A., Jacobson, A., Hammack, T. S. Chapter 5 Salmonella. Bacteriological Analytical Manual. , 
 Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/downloads/Food/FoodScienceResearch/UCM244774.pdf">http://www.fda.gov/downloads/Food/FoodScienceResearch/UCM244774.pdf</a> (2007).</li>
<li>Barro, N., Aly, S., Tidiane, O. C. A., Sababenedjo, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carriage+of+bacteria+by+proboscises%2C+legs%2C+and+feces+of+two+species+of+flies+in+street+food+vending+sites+in+Ouagadougou%2C+Burkina+Faso%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Carriage of bacteria by proboscises, legs, and feces of two species of flies in street food vending sites in Ouagadougou, Burkina Faso.</a> Journal of Food Protection. 69 (8), 2007-2010 (2006).</li>
<li>Ugbogu, O. C., Nwachukwu, N. C., Ogbuagu, U. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Salmonella+and+Shigella+species+from+house+flies+%28Musca+domestica+L.%29+in+Uturu%2C+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Salmonella and Shigella species from house flies (Musca domestica L.) in Uturu, Nigeria.</a> African Journal of Biotechnology. 5 (11), 1090-1091 (2006).</li>
<li>Brownlie, J. C., Johnson, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont-mediated+protection+in+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Symbiont-mediated protection in insect hosts.</a> Trends in Microbiology. 17 (8), 348-354 (2009).</li>
<li>Feldhaar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+symbionts+as+mediators+of+ecologically+important+traits+of+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Bacterial symbionts as mediators of ecologically important traits of insect hosts.</a> Ecological Entomology. 36 (5), 533-543 (2011).</li>
<li>Foodborne disease outbreaks: Guidelines for investigation and control. , World Health Organization. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/foodsafety/publications/foodborne_disease/outbreak_guidelines.pdf">http://www.who.int/foodsafety/publications/foodborne_disease/outbreak_guidelines.pdf</a> (2008).</li>
<li>Wright, A. P., Gould, L. H., Mahon, B., Sotir, M. J., Tauxe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Impact+of+Epidemic-Assistance+Investigations+of+Foodborne+and+Other+Enteric+Disease+Outbreaks%2C+1946-2005%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Overview of the Impact of Epidemic-Assistance Investigations of Foodborne and Other Enteric Disease Outbreaks, 1946-2005.</a> American Journal of Epidemiology. 174, S23-S35 (2011).</li>
</ol>

השימוש במכשור ספציפי אינו אישור של מינהל המזון והתרופות האמריקאי. המחברים מאשרים כי אין ניגוד אינטרסים עם ארגון פיננסי כלשהו בנוגע לחומר הנדון במאמר זה.

מחקרים קודמים שגילו פתוגנים foodborne מחרקים פראיים השתמש במגוון גדול של פרוטוקולים שאולי לא כולל את המידע הדרוש כדי להעריך נכון את הסיכון הקשורות למזון של הנוכחות של זבוב אחד במזונות או סביבות הקשורות למזון 13,15, 23,24. הנה, הראינו כי שימוש בפרוטוקול סטנדרטי זה, ניתן לזהות ולבודד spp Cronobacter., ס &#39; enterica, ול &#39; חיידקים ממשטח הגוף ואת מערכת העיכול של זבובים יחידים שנלכדו בטבע. בגלל חרקים עשויים לשאת מספרים נמוכים של הפתוגן foodborne היעד ומספרים גבוהים של חיידקי ילידים אחרים 25,26, פרוטוקול זה דורש העשרה העיקרית (ולפעמים שני) של הדגימות בתקשורת והתרבות הספציפית כדי להגדיל את הרגישות של זיהוי של הפתוגן foodborne היעד . תוצאות ממערכת האיתור מבוסס PCR התקבלו בתוך כ -30 שעות (לDetection של spp Cronobacter. וס enterica) ו -48 שעות (לצורך זיהוי של חיידקי L.) לאחר התחלת עיבוד הדגימות. כך, פרוטוקול זה הוא אמין כמו גם מהיר ורגיש מספיק כדי להקרין זבוב אחד לנוכחות של פתוגנים foodborne. אישור לתוצאות PCR חיובי ובידוד של חיידקי קיימא הוא חלק מהליך ההפעלה הסטנדרטי של מעבדות רבות. בנוסף, למטרות אפידמיולוגיה, תרבויות חיידקים טהורות מדגימות PCR החיוביות נדרשות לאשר נוסף וסרוטיפ הפתוגן foodborne באמצעות יוכימיים, חיסוני, או שיטות גנטיות. למרות שאף תוצאות חיוביות שגויות נצפו כאשר גילוי S. enterica ול &#39; חיידקים מחלקי הגוף של זבובים-נתפס פראיים אחת, תוך שימוש בפרוטוקול זה, שמצאנו עד לשיעור של 50% של תוצאות חיוביות שגויות לspp Cronobacter. הדבר מצביע על כך מערכת האיתור מבוסס PCR לCronobact הסוגאה יכול לחצות להגיב עם Enterobacteriaceae אחר הנמצא בין החיידקים המורכבים ביותר שבוצעו על ידי זבובים. לפיכך, בידוד וטיהור של מושבות טהורות של Cronobacter הסוג מדגימות PCR החיוביות דורשים ציפוי סלקטיבית יותר מ פתוגנים האחרים שנבדקו. פרוטוקול זה בעיקר היה סטנדרטי למסך זבובים ניצודים פרט לנוכחות של spp Cronobacter., ס &#39; enterica, ול &#39; חיידקים באמצעות מערכת איתור מבוססת PCR מסחרית. עם זאת, פרוטוקול זה גם להתאים בקלות למסך חלקי גוף של זבובים יחידים לנוכחות של פתוגנים foodborne האחרים כגון O157 enterohemorrhagic החיידק: H7 (באמצעות E. coli O157: H7 ערכת assay הסטנדרטי MP או החיידק O157: H7 ערכת assay בזמן אמת) וא &#39;השיג-toxigenic coli קבוצה (STEC) (באמצעות חבילת STEC בזמן אמת), רגישויות קבלת&gt; 80% (ללא פרסוםנתונים ed). כמו כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם פוטנציאלי כדי לזהות פתוגנים foodborne מחרקים אחרים שידועים כי הם וקטורים של מחלות (מקקים ונמלים), אך יש צורך במחקר נוסף בתחום זה. חקירות פרוץ המחלה foodborne הן דינמיות מאוד ומהוות תהליך רב שלבים שעשויים להשתנות בהתאם למצב הספציפי ולהיות הסביבה המקומית חקרו 12,27. חקירות אלה חשובות משום שהם מספקים הגנה על בריאות הציבור מיידית על ידי מניעת מחלות בעתיד. בנוסף, חקירות אלה יכולים להבהיר מנגנונים חדשים על ידי מיקרואורגניזמים הfoodborne מפוזרים, ומעלות שאלות חשובות שיובילו לתחומים חדשים למחקר 28. טכניקות חקירה, כמו גם פרוטוקולים סטנדרטיים, מהירים, ורגישים הנדרשות לאיתור גורמי המחלה foodborne מחרקים בודדים. פרוטוקול סטנדרטי זה מפותח את ההזדמנות כדי לאסוף סביבה נקיה מחיידקי חרקים כמו זבובים, which יכול וקטור הפתוגן חיידקי foodborne, כחלק מתכנית דגימה סביבתית. המידע אפידמיולוגיים שניתן להשיג מזה יהיה שימוש בבניית תמונה מדויקת של המנגנונים של העברת פתוגנים foodborne על ידי חרקים (כלומר, משך זמן חשיפה: זבוב על ידי נחיתה לעומת זבובי נחיתה, עושים את צרכיהם, ומעלה גירה). לבסוף, למרות שמערכת האיתור מבוססת PCR המסחרי שתוארה כאן היא מעשית לשימוש ומפשטת הגברה PCR ויזואליזציה של amplicon ברמת סוג, זה בשום אופן לא את המערכת המתאימה בלבד. Lysate מדגימות מועשרות לחלופין יכול לשמש מסך לנוכחות של פתוגנים foodborne באמצעות זוגות פריימר מינים ספציפיים זמינים בפומבי. עם זאת, רגישות זיהוי צריכה להיות הפגינה לפני השימוש בם.

חרקים לשחק תפקיד חשוב בהעברת מחלות הקשורות למזון, כי הם יכולים להתפשט פתוגנים על משטחי מזון או במגע עם מזון וכלי 1. בין חרקים, זבובים, תיקנים, נמלים והתנהגויות המעדיפות את התפשטות פתוגנים foodborne. התנהגויות אלה כוללות שיתוף עם עניין מתפורר, מסרבים וצואה, (בניינים שנכנסו) endophily, וsynanthropy (הלא נשוא עם בני אדם) 2. .. פתוגנים foodborne כגון סלמונלה spp, חיידקים ליסטריה, קמפילובקטר spp, Escherichia coli O157: H7, וחברי Cronobacter (לשעבר sakazakii Enterobacter) הסוג דווח להיות מועבר על ידי חרקים 3-5. זוהמת קרבת אדם זבובים מכאנית להפיץ חיידקי foodborne ידי העברת פתוגנים מהמשטחים המזוהמים בגוף שלהם. עם זאת, הנוכחות של פתוגנים foodborne בתעלת העיכול של זבובים יכולה להיות עד שלוש פעמיםגדול יותר מזה שנצפה בשטח שלהם הגוף (גוף, ראש, רגליים, וכנפיים) 5. פתוגנים foodborne יכולים גם להישאר בתעלת העיכול של הזבוב לזמן ארוך יותר מאשר על פני השטח גוף 6,7 ובמקרים מסוימים, הם יכולים להתרבות, ומיישבי 4,8,9 מערכת העיכול של הזבוב. זה מגדיל את פוטנציאל הווקטור של זבובים, כי הם עוד יכולים להתפשט פתוגנים foodborne דרך עשיית הצרכים וregurgitation 10,11. כיום, יש שיפור מערכות מעקב שמסוגלים לזהות התפרצויות המחלה foodborne במהירות רבות יותר. בעת ביצוע חקירות פרוץ foodborne, פקידי בריאות ציבור לחפש מזון שעשוי להיות מקור (ים) או הרכב (ים) של זיהום. חוקרים יכולים גם לבצע הערכה סביבתית של המתקן (או מתקנים) המעורב כדי לברר כיצד האוכל היה מזוהם ועשויים לאסוף דגימות כחלק מהחקירה 12. DespITE הכמות העצומה של ספרות מדעית הנוגע לחרקים כנישאים של פתוגנים foodborne, המקשר חרקים כוקטורים של הפתוגן גורם להתפרצות המחלה foodborne מסוימת הייתה מאתגרת. זה בעיקר בגלל חרקים אינם נאספים סביבה נקיה מחיידקים, כחלק מתוכניות דגימה סביבתית במהלך חקירות פרוץ foodborne. כדי לכלול חרקים, במיוחד אלה שמפגינים התנהגויות המעדיפות את התפשטות פתוגנים foodborne, כחלק מהליך דגימה סביבתי, פרוטוקול סטנדרטי, מהיר, רגיש ואמין לגילוי פתוגנים foodborne מחרקים יחידים צריך להיות במקום. טכניקות ציפוי מסורתיות לגילוי של פתוגנים foodborne מחרקים הן מייגע ותלויות בצמיחה התחרותית של חיידקי היעד בתקשורת ותרבות שונה כדי להתגבר על הצמיחה המהירה של חיידקי commensal המולדים של החרקים. רוב המחקרים שקשורים עם החרקים baפתוגנים cterial הגדילו את הרגישות של השיטה על ידי איגום יחד כמה חרקים ולא מזהה את הנוכחות של פתוגנים לבסיס פרטני. כך, מחקרים אלו לא הבדילו חלק הגוף של החרקים שבו פתוגנים נמצאו 13-18. היכולת לזהות אם פתוגנים foodborne נמצאים על פני השטח הגוף או בתעלת העיכול של חרק בודד היא חשובה כמו זה עשוי להיות השלכות אפידמיולוגיים ועשוי להוביל לאסטרטגיות להפחתת סיכון שונות. כוקטורים מכאניים, זבובי אדמה שעל מזון לזמן קצר עלולים רק להעביר רמות נמוכות של חיידקים ממשטח גופם, בעוד שאלו שזבובים להקיא ולעשות את צרכיו על המזון להגדיל את ההסתברות של פתוגנים העברה ברמות גבוהות יותר פוטנציאל לזיהום. כתוצאה מכך, חשוב להעריך את השכיחות של הפתוגן foodborne לחרק בודד ולהבדיל חלק הגוף של חרקים שבי p החיידקים<html> athogen ממוקם. למרות שהשימוש בשיטות תרבות עצמאית כדי לזהות פתוגנים foodborne יותר ויותר להיות מיושם, הם לא היו בשימוש מסחרי כדי לזהות פתוגנים foodborne מחרקים בודדים. נכון לעכשיו, יש תוקף פרוטוקולים מולקולריים כי הם זמינים מסחריים לזיהוי המהיר של פתוגנים foodborne ממזונות הנמצאים בשימוש על ידי תעשייה ורשויות רגולטוריות. שיטות אלה כוללות מערכות מבוססות DNA לצורך זיהוי של פתוגנים במגוון רחב של דוגמאות מזון. למרות שפרוטוקולים מולקולריים הם מהירים יותר מאשר שיטות ציפוי מסורתיות, העשרה של המדגם היא עדיין נדרשה להשיג את רמת הרגישות של 10 2 יחידות מושבה להרכיב (CFU) של הפתוגן חיידקי צורך בתגובת השרשרת של פולימראז (PCR) שיטות מבוססות 19. בנוסף, יש צורך בבידוד של מושבות חיידקים טהורות מדגימות PCR החיוביות כדי לאשר את הפתוגן בשיטות מתאימות. תוכן &quot;&gt; המטרה של פרוטוקול זה הוא כדי לתקן מערכת מבוססת PCR זמינה מסחרי המשמשת לאיתור גורמי מחלה מדגימות מזון ואיכות הסביבה לצורך זיהוי של חיידקי foodborne ממשטח הגוף ואת מערכת העיכול של זבוב בודד ולבודד נוסף אלה פתוגנים מרגישות samples.The של הפרוטוקול המתואר כאן היה מכוילים ראשון עם זבובים שגדל במעבדה הבית המבוגר (domestica Musca) שהואכלו בניסוי עם דילולים סדרתי של כל פתוגן חיידקים. הפרוטוקול הסטנדרטי היה לאחר מכן נהג לסקור 100 ניצוד עף לנוכחות של פתוגנים foodborne מהשטח שלהם הגוף ו / או תעלות עיכול. פרוטוקול סטנדרטי זה יאפשר מעבדות בריאות הציבור כדי לזהות איומי בריאות מציבים חרקים, המאפשרים לאפשרות של איסוף אותם כחלק מתכנית הדגימה הסביבתית בעת ביצוע foodborne חקירות פרוץ.

<table><tbody><tr><td>ביסמוט סולפיט (BS) אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>R452402</td><td>*ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>מרק עירוי לב מוח (BHI)</td><td>בקטון, דיקסון ושות</td>' <td>299070</td><td>*מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Brilliance Listeria agar (BLA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CM1080B</td><td>*ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>מי פפטון חוצצים (BPW)</td><td>בקטון, דיקסון ושות</td>' <td>212367</td><td>*מחוממים מראש ל-37 מעלות; C או 42&deg;C. ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen Formula/DFI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CM1055B</td><td>*ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>chromID Sakazakii Agar</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>43741</td><td>*התקשרו למידע: 800.682.2666</td></tr><tr><td>R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) ציפוי כרומוגני בינוני</td><td>R & F מעבדות</td><td>שונות</td><td>*התקשרו למידע: +1.630.969.530</td></tr><tr><td>מו"פ & F Enterobacter sakazakiii מרק העשרה ותוסף</td><td>R & F מעבדות</td><td>שונות</td><td>*התקשרו למידע: +1.630.969.530</td></tr><tr><td>Hektoen enteric (HE) agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXCM0419B</td><td>*מספר ספקים.</td></tr><tr><td>24 מרק העשרה ליסטריה (24LEB)</td><td>Oxoid</td><td>CM1107</td><td>*מוכן טרי בטמפרטורת החדר. ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>תוסף העשרה סלקטיבי ליסטריה</td><td>Oxoid</td><td>SR0243</td> <td>* ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>Novobiocin</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXSR0181E</td><td>*ספקים מרובים. יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות; C</td></tr><tr><td>Vancomycin hydrochloride hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861987</td><td>לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות; C</td></tr><tr><td>Cefsulodin נתרן מלח הידרט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8145</td><td>חנות ב-2-8 מעלות; C</td></tr><tr><td>רפפורט-וסיליאדיס (RV) בינוני</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>CM0669B</td><td>*ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>מרק טטרתיונאט (TT)</td><td>בקטון, דיקסון ושות</td>' <td>249120</td> <td>* ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>אגר סויה טריפטיקס (TSA)</td><td>בקטון, דיקסון ושות</td>' <td>236930</td><td>*ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>קסילוז ליזין דסוקסיקולאט (XLD) אגר</td><td>בקטון, דיקסון ושות</td>' <td>221284</td><td>*ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>מערכת זיהוי ביוכימית API</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>Various</td><td>*התקשרו למידע: +1.800.682.2666</td></tr><tr><td>VITEK 2: בטיחות המוצר</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>Various</td><td>*התקשרו למידע: +1.800.682.2667</td></tr><tr><td>BAX System Q7</td><td>DuPont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAX E. ערכת בדיקה סטנדרטית</td><td>DuPont</td><td>D11801836</td><td></td></tr><tr><td>BAX L. monocytogenes ערכת בדיקה 24E DuPont</td><td></td><td>D13608125</td><td></td></tr><tr><td>BAX Salmonella 2 ערכת בדיקה סטנדרטית</td><td>DuPont</td><td>D14368501</td><td></td></tr><tr><td>כלי מכסה</td><td>DuPont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D11677028 כלי דקאפינג</td><td>DuPont</td><td>D11134095</td><td></td></tr><tr><td>PCR מתלה/מחזיק צינור</td><td>DuPont</td><td>D12701663</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים במשקל נוצה, קצה רחב</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>לעקר לפני השימוש. ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>מלקחיים בעלי קצה ישר</td><td>BioQuip</td><td>4731</td><td>יש לעקר לפני השימוש. ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>חרוזי זירקוניה/סיליקה, 0.5 מ"מ</td><td>Bio Spec Products, Inc.</td><td>11079105z</td><td>ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>צלחות פטרי - 60X15 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-772B</td><td>מספר ספקים.</td></tr><tr><td>לולאות חיסון חד פעמיות, 10 ומיקרו; L</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-606</td><td>ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>מפזרי תאים בצורת L</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-665-230</td><td>ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 2 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>שונים</td><td>לעקר לפני השימוש בעת הצורך. עדיף מכסה מאובטח. ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>צינורות אשכול</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-500-13</td><td></td></tr><tr><td>מכסי צינורות אשכול</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-500-23</td><td></td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט (אקונומיקה כלור נוזלי)</td><td></td><td></td><td>*יש לדלל ל-0.05% במים. ספקים מרובים.</td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td>סטריליים דה-יונים</td><td>ספקים מרובים.</td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td>מזוקקים סטריליים</td><td>ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי 190 הוכחה</td><td></td><td></td><td>*יש לדלל ל-70% במים בעת הצורך. ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>משבש תאי ג'יני, 120V - עבור מיקרו-צינורות של 1.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-D238</td><td>ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>בלוק</td><td></td><td></td> חימום <td>מספר ספקים.</td></tr><tr><td>בלוק</td><td></td><td></td> קירור <td>מספר ספקים.</td></tr><tr>אמבט <td></td><td></td><td>מים מחזורי</td><td>ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> סטריאו <td>ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>ספקים מרובים.</td></tr><tr><td>חממה</td><td></td><td></td><td>מספר ספקים.</td></tr></tbody></table>

איתור של foodborne פתוגנים חיידקיים מזבובי הפרט filth

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

יש תמימות דעים שחרקים הם וקטורים חשובים של פתוגנים הנישאים במזון. עם זאת, קישור חרקים כווקטורים של הפתוגן הגורם להתפרצות מחלה מסוימת הנישאת במזון היה מאתגר. הסיבה לכך היא שחרקים אינם נאספים באופן אספטי כחלק מתוכנית דגימה סביבתית במהלך חקירות התפרצויות הנישאות במזון ומכיוון שאין שיטה סטנדרטית לאיתור חיידקים הנישאים במזון מחרקים בודדים. כדי לעשות צעד לקראת פתרון בעיה זו, התאמנו פרוטוקול ממערכת מבוססת PCR זמינה מסחרית המזהה פתוגנים הנישאים במזון מדגימות מזון וסביבה, כדי לזהות פתוגנים הנישאים במזון מזבובים בודדים. באמצעות פרוטוקול סטנדרטי זה, סקרנו 100 זבובים שנתפסו בטבע לנוכחות של Cronobacter spp., Salmonella enterica ו-Listeria monocytogenes והראינו שניתן לזהות ולבודד עוד יותר את הפתוגנים הללו מפני השטח של הגוף ותעלת העיכול של זבוב בודד. 22% מתעלות העיכול ו-8% ממשטחי הגוף של זבובי בר שנאספו היו חיוביים לפחות לאחד משלושת הפתוגנים הנישאים במזון. השכיחות של Cronobacter spp. בשני חלקי הגוף של הזבובים הייתה גבוהה סטטיסטית (19%) מהשכיחות של S. enterica (7%) ו-L.monocytogenes (4%). לא נצפו תוצאות חיוביות כוזבות בעת זיהוי S. enterica ו-L. monocytogenes באמצעות מערכת מבוססת PCR זו מכיוון שהתקבלו תרביות חיידקים טהורות מכל התוצאות החיוביות ל-PCR. עם זאת, מושבות קרונובקטר טהורות לא התקבלו מכ-50% מהדגימות החיוביות ל-PCR, מה שמצביע על כך שמערכת הזיהוי מבוססת ה-PCR לפתוגן זה מגיבה עם Enterobacteriaceae אחרים הקיימים בקרב המיקרוביוטה המורכבת ביותר הנישאת על ידי זבובי בר. הפרוטוקול הסטנדרטי המוצג כאן יאפשר למעבדות לזהות פתוגנים חיידקיים הנישאים במזון מחרקים שנאספו באופן אספטי, ובכך לתת לפקידי בריאות הציבור שורה נוספת של ראיות כדי לגלות כיצד המזון זוהם בעת ביצוע חקירות התפרצויות הנישאות במזון.

פרוטוקול זה היה מכויל ראשון על סט של זבובי בית שגדל במעבדה שהואכלו באופן ניסיוני עבור שעות 24 עם מזון נוזלי זבוב (2% אבקת חלב) המכיל דילולים סדרתי (פבואר 10 - אוגוסט 10 CFU / ml) של ג sakazakii, S. enterica, ל &#39; חיידקים, או C. jejuni (n = 21 לכל פתוגן חיידקים). תקשורת העשרה, כמו גם פעמים דגירה וטמפרטורות הותאמו לכל פתוגן foodborne עד שהמערכת מבוססת PCR הייתה מסוגלת לזהות הרמות הנמוכים ביותר של חיידקים (10 2 CFU / ml) ממשטח הגוף ואת מערכת העיכול של אחת האכיל בניסוי לטוס. שימוש במדיה ההעשרה ותנאים שתוארו בסעיף הפרוטוקול, המערכת מבוססת PCR זוהתה ג sakazakii, S. enterica, ול &#39; חיידקים ממשטח הגוף של זבובים מוזנים עם&gt; 10 3 CFU / ml חיידקי inocula (איור 1 א) 100%. כאשר זבובים הואכלו עם 102 CFU / ml, אחוז הגילוי של ג sakazakii, S. enterica, ול &#39; חיידקים ממשטח גופם היו 100%, 66%, ו -33%, בהתאמה (איור 1 א). המערכת מבוססת PCR גם זוהתה שלושה פתוגנים foodborne אלה מהתעלה העיכול של זבובים נמאס עם כל ריכוזי החיידקים בשיעורים ≥33% (איור 1). עם זאת, זיהוי של ג jejuni היה רק מושגת כאשר זבובים שגדל במעבדה הואכלו בניסוי עם מזון נוזלי המכיל הבידוד הגבוה ביותר בקטריאלי (10 8 CFU / ml). לפיכך, ג jejuni לא נכלל בקבוצה של פתוגנים foodborne שאפשר לבדוק את זוהמה מקרבת אדם בודדת זבובים באמצעות מערכת איתור מבוסס PCR זה. עם פרוטוקול סטנדרטי זה, היינו יכול לקבוע את השכיחות של spp Cronobacter., Enterica ס, ול &#39; חיידקים ממשטח הגוף ו / או הדואר תעלת עיכול של 100 זבובים פראיים שהיו בנפרד וסביבה נקיה מחיידקים נתפסו מאזור המזבלה של עשר מסעדות עירוניות הממוקמים באזור המטרופולין של וושינגטון 5 זבובי זוהמה שנאספו היה נציג של לפחות שישה מינים הכוללים מ &#39; domestica (47%), cuprina Lucilia (33%), ל &#39; sericata (14%), macellaria Cochliomyia (2%), (2%) haemorrhoidalis Sarcophaga, וleucostoma Ophyra (1%). זבוב אחד זוהה רק לרמת משפחה (אנתומיתיים; 1%). פרוטוקול משטח-החיטוי היה יעיל במניעת זיהום צולב בין חלקי הגוף של הזבוב, כי אין צמיחת חיידקים נצפתה על צלחות TSA למים משטיפת החיטוי האחרונה של כל זבוב בודד. לפיכך, הבחנה יכולה להתבצע בין חיידקי foodborne הווה בחלקי הגוף של כל זבוב. אין תוצאות חיוביות שגויות התגלו מדגימות של משטח הגוף ואת מערכת העיכול שלזבובים בודדים בעת שימוש במערכת מבוססת PCR מסחרי זה לגילויו של ס &#39; enterica ול &#39; חיידקים, והאישור של פתוגנים קיימא על צלחות אגר היו בהסכם עם תוצאות PCR חיוביות. עם זאת, לא ניתן היה לבודד תרבויות טהורות של spp Cronobacter. מכל המדגמים PCR החיוביים. לפיכך, המבוסס על PCR זיהוי של הפתוגן זאת על ידי מערכת הראתה תוצאות חיוביות שגויות ממשטח הגוף (50%; 9/18) ועיכול (48%; 16/33) של זבובים-נתפס פראיים אחת. דגימות PCR שלילי שנבחרו באקראי שהיו מצופות על תקשורת ספציפית, אישרו את היעדר פתוגנים foodborne. לפיכך, לא שליליים שווא התגלו מכל הדגימות בעת השימוש במערכת מבוססת PCR מסחרית זו כדי לזהות spp Cronobacter., ס &#39; enterica, או L. חיידקים. רק מי דגימות PCR החיוביות שבו הפתוגן היה מבודדת ואישרו נחשבו חיוביותוכלל לניתוח סטטיסטי. הנוכחות הכוללת של פתוגנים foodborne בתעלת העיכול של זבובי זוהמה ניצודים הייתה גבוהה יותר באופן משמעותי מאשר על פני השטח הגוף (χ 2 = 6.8772, df = 1, p = .0087). 22% מתעלות העיכול ו -8% ממשטחי הגוף של זבובים פראיים שנאספו היו חיוביים לפחות אחד משלוש גורמי המחלה foodborne (איור 2). בסך הכל, השכיחות של spp Cronobacter. שני משטחי הגוף או תעלות עיכול של זבובים שנאספו היה סטטיסטי גבוה יותר (19%; p של פישר המדויק בדיקה = .0165) מאשר שכיחותו של ס &#39; enterica (7%) וחיידקי L. (4%). עם זאת, לא נמצא הבדלים סטטיסטיים נצפו בעת ביצוע השוואות pairwise בין חלקי הגוף של הזבובים לכל פתוגן חיידקים (איור 3; p של פישר המדויק בדיקה = .1464, p = .1184, וp = .6212 לCronobacterspp., ס &#39; enterica, ול &#39;חיידקים, בהתאמה). אף אחד מהזבובים היו חיוביים לכל שלושת גורמי המחלה מוערכים. עם זאת, שלושה מהזבובים (שתי cuprina L. ואחד sericata L.) spp סלמונלה ביצע. ול &#39; חיידקים על פני השטח או בתעלת העיכול. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52372/52372fig1.jpg" /> רמות איור 1. איתור של sakazakii Cronobacter, enterica סלמונלה, חיידקים ליסטריה, וקמפילובקטר jejuni ממשטח הגוף () ותעלת העיכול של זבובי בית שגדל במעבדה בודדת מואכלת באוכל נוזלי המכיל חיידקים שונה inocula (B) (n = 21 לכל פתוגן חיידקים, n = 3 לכל ריכוז חיידקים). <img alt="איור 2"src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,372 / 52372fig2.jpg&quot; /&gt; אחוז איור 2. משטחי גוף ותעלות עיכול של זבובים בודדים נמצא חיוביות לכל אחד מגורמי מחל foodborne היעד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52372/52372fig3.jpg" /> שכיחות איור 3. spp Cronobacter., Enterica סלמונלה, וחיידקים ליסטריה ממשטח הגוף ואת מערכת העיכול של זבובים ניצודים קרבת אדם. ערכי p המדווחים מהשוואות pairwise בין משטח גוף ואת מערכת העיכול לכל פתוגן חיידקים (מבחן המדויק של פישר, ערך p &lt;0.05 מציין מובהקים סטטיסטי). חברת Copyright © האמריקנית למיקרוביולוגיה, Journal of Applied והסביבה מיקרוביולוגיה 78 (22): 7,891-902, 2012. doi: 10.1128 / AEM.02195-12.

פרוטוקול מבוסס PCR הותאם לאיתור Cronobacter spp., Salmonella enterica ו-Listeria monocytogenes ממשטחי גוף ותעלות עיכול של זבובים בודדים שנלכדו בטבע. מטרת פרוטוקול זה היא לזהות ולבודד פתוגנים חיידקיים מחרקים בודדים שנאספו כחלק מתוכנית דגימה סביבתית במהלך חקירות התפרצויות הנישאות במזון.

איתור של foodborne פתוגנים חיידקיים מזבובי הפרט Filth

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לסרוק לקיומם של פתוגנים חיידקיים העוברים דרך מזון מפני פני השטח של הגוף ומהמעי של זבובים בודדים, באמצעות מערכת גילוי מבוססת PCR הזמינה מסחרית. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף זבובים ברים מאזור הפסולת של מסעדות. זבובים בודדים טובלים בציר תרבית (nutrient broth) כדי לאסוף מיקרוביוטה מפני השטח של הגוף.לאחר מכן מוצא את התעלה הראשונית, מניחים אותה במבחנה אחרת המכילה מרק תזונתי ומפרקים אותה כדי לשחרר את החיידקים מתוך הרקמה. השלב הבא הוא העברת הדגימות למרק העשרה ספציפי לנתיב הפתוגן לצורך גידול חיידקי, שיעלה את ריכוז החיידקים מעל סף הגילוי של הבדיקה. לאחר מכן, הדגימות המועשרות עוברות ליזיס ומוספות למבחנות PCR המכילות טבליות מוכנות לשימוש לזיהוי הפתוגנים המטרה באמצעות PCR.השלב הסופי הוא בידוד מושבות חיידקים טהורות מהדגימות שהיו חיוביות ל-PCR, על ידי זריעת מרק ההעשרה על מצעים סלקטיביים ודיפרנציאליים. בסופו של דבר, השילוב של זיהוי מבוסס PCR ובידוד מושבות טהורות משמש להערכת השכיחות של kob backer, salmonella, ו-listeria monocytogenes מהתעלות המעיים וממשטחי הגוף של זבובים בודדים שנלתפסו בטבע. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון זריעה מסורתית, הוא שהיא מהירה ואמינה, וכן רגישה מספיק לסריקת משטח הגוף ותעלת המעי של זבוב בודד לאיתור פתוגנים חיידקיים.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בחקירה של התפרצויות של מחלות המועברות במזון, כגון מנגנוני ההדבקה על ידי חרקים ומקוריהם של הפתוגנים. ההשלכות של טכניקה זו חורגות מאבחון פתוגנים ממזון וממדגמי סביבה, וכוללות כעת את היכולת לזהות פתוגנים חיידקיים אלו מחרקים בודדים, כגון זבובים. ראשית, יש להניח זבובים שנאספו באופן אספטי במקפיא בטמפרטורה של 20- °C למשך חמש עד שבע דקות כדי להקפיא אותם.לאחר מכן, העבירו זבוב אחד למבחנה סטרילית של 2 mL המכילה 1 mL של מי פפטון עם בופר שחוממו מראש, הידועים כ-BPW. באמצעות פינצטה סטרילית, ערבבו בעדינות את תוכן המבחנה על ידי הפיכה למשך שתי דקות כדי להבטיח שכל גוף הזבוב יבוא במגע עם התווך. פעולה זו מעבירה את המיקרוביוטה שעל פני שטח הזבוב אל ה-BPW.בשלב הבא, העבירו את הזבוב למבחנה חדשה של two milliliter באמצעות פינצטה סטרילית. חטאו את הזבוב על ידי טבילה ב-70% ethanol וערבבו בעדינות במשך דקה אחת, ולאחר מכן הסירו את ה-ethanol. שטפו את הזבוב במים מזוקקים סטריליים, ולאחר השטיפה, הוסיפו למבחנה תמיסת bleach 0.05% שהוכנה טרייה.ערבבו בעדינות במשך דקה אחת ולאחר מכן הסירו את אקונומיקה. שטפו את הזבוב שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים כדי לאשש את הסטריליזציה. העבירו את המים משטיפה האחרונה לשפופרת סטרילית של 2 mL ובדקו נוכחות של חיידקים מזוהמים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.בשלב הבא, הניחו את הזבוב על נייר סופג שעבר עיקור כדי להסיר עודפי מים. לאחר הייבוש, העבירו את הזבוב לצלחת פטרי סטרילית חד-פעמית בנתב של 60 מילימטר והניחו את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (מיקרוסקופ לדיסקציה). משכו בזהירות את פי הטבעת ואת כל תעלת העיכול אל מחוץ לזבוב באמצעות פינצטה סטרילית בעלת חוד דק.בשלב הבא, באופן אספטי, העבר את התעלה הראשית למבחנה אחרת של 2 ml המכילה 1 ml של BPW שחומם מראש וחרוזי זירקוניה-סיליקה של 0.5 mm. השתמש במכשיר לפירוק תאים (cell disruptor) כדי לערבב את המבחנה המכילה את התעלה הראשית למשך 5 עד 10 דקות כדי לשחרר חיידקים מתוך הרקמה.העבירו את שאר גוף הזבוב למבחנה נקייה של 2 mL המכילה 95% ethanol לאחסון ארוך טווח בטמפרטורה של 20°C- . לצורך העשרה בקטריאלית ראשונית, חלקו את ה-BPW המכיל מיקרוביוטה מהפני השטח או מהתעלת העיכול לשלוש מבחנות של 2 mL. עם המצע המחומם מראש המתאים, דגרו את המבחנות בטמפרטורה ובזמן המצוינים הנדרשים עבור כל פתוגן להעשרה שניונית של salmonella ו-kob backer. העבירו 100 µL מהתרבית המועשרת למבחנות קריוסטטיות סטריליות המכילות 400 µL של מצע brain heart infusion broth מחומם מראש.דגרו את המבחנות בבלוק חימום בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. כדי להכין לליזיס של התאים, הוסיפו 150 µL של הפרוטאז המסופק בערכה לבקבוק אחד של 12 mL של בופר ליזיס וערבבו. העבירו 200 µL של ריאגנט הליזיס לכל אחת מהמבחנות המסומנות של הצבירים (cluster tubes). לאחר מכן, העבירו 20 µL של הדגימות המועשרות המשניות למבחנות הצבירים המתאימות באמצעות טיפים ארוכים של פיפטה עבור ביקורות שליליות.הוסף 20 µL של מצע סטרילי עבור ביקורות חיוביות. הוסף 20 µL מתרביות חיידקים בן לילה של זני salmonella או kob backer ידועים. לאחר הוספת כל הדגימות, סגור את הפקקים של מבחנות הצבר באמצעות כלי הסגירה.בשלב הבא, בצעו ליזיס לתאים על ידי הנחת רכבת מבחנות האשכול (cluster tubes) בבלוק חימום אוטומטי והפעילו את התוכנית הספציפית עבור הפתוגן המטרה כדי להתחיל את הגילוי מבוסס ה-PCR. ראשית, קררו רכבת מבחנות PCR על בלוק קירור. לאחר מכן, הניחו במחזיק את מבחנות ה-PCR המתאימות המכילות טבליות מוכנות ל-PCR עבור הפתוגן המעורר מחלה במזון המטרה.הסרו בזהירות את הפקקים מבחוליות ה-PCR באמצעות כלי הפתיחה והשליכו אותם. ודאו שבכל בחלובית ישנה טבליה. לאחר מכן, העבירו 50 µL של ליזאט לבחוליות ה-PCR המתאימות.סגרו את מבחנות ה-PCR באמצעות מכסי אופטיקה חדשים בעזרת כלי הסגירה. לאחר הרכבת התגובות, העמיסו את מבחנות ה-PCR למערכת הגילוי של ה-PCR cycler. לאחר מכן, הפעילו את התוכנית ועיינו בתוצאות כפי שמתואר בפרוטוקול היצרן.כדי לבודד מושבות חיידקים טהורות, יש לבחור את מבחנות ההעשרה הראשוניות של הדגימות שהיו חיוביות ל-PCR. עבור salmonella, יש להוסיף 100 µL מתרבית ההעשרה ל-10 mL של מצע Rappaport vasilis, ול-1 mL של ציר tetra anate. יש לדגור את המבחנות בטמפרטורה של 42.5 °C למשך 22 עד 24 שעות; לאחר הדגירה, יש לזרוע בעזרת לולאה של 3 mm ממלאה מכל מצע על מצעי bismuth sulfite agar, XLD agar, hector agar ו-enteric agar.לאחר מכן, הניחו את הצלחות הפטריה באינקובטור בטמפרטורה של 35 °C. לאחר 22 עד 24 שעות של גידול, בחנו את הצלחות לאיתור מושבות Salmonella טיפוסיות בכל קו של זריעה; העבירו מושבה חיובית ממצע סלקטיבי ובודדו מושבות בודדות לאחר האינקובציה.השתמשו במושבה טהורה אחת כדי לאשר את זהותן של חיידקי סלמונלה משוערים באמצעות בדיקה ביוכימית מסחרית, כגון בדיקת API 20 E עבור KOB backer streak. העבירו לולאה מלאה מהמבחנה של העשירה הראשונית לשני צלחות של מצע גידול כרומוגני, כגון מצע גידול כרומוגני RNF enterobacter Sakaki eye. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 35 °C למשך 22 עד 24 שעות, ולאחר מכן בחנו אותן לקיומן של מושבות כחולות, שחורות או כחולות-אפורות עבור listeria monocytogenes streak.העבירו לולאה מלאה משפחור ההעשרה לשתי צלחות של brilliance Listeria agar, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 35 °C למשך 22 עד 26 שעות, ולאחר מכן בחנו אותן לנוכחות של מושבות בצבע כחול-ירוק. פרוטוקול סטנדרטי זה נבדק על 100 זבובים ברים שנלכדו מאזור פחי האשפה של 10 מסעדות עירוניות.מוצג כאן אחוז הזבובים שנמצאו חיוביים לפתוגנים המותירים. 22% מהתעלות הראשוניות ו-8% ממשטחי הגוף היו חיוביים לפחות לאחד משלושת הפתוגנים המועברים במזון שנבדקו.הנוכחות הכוללת של חיידקים המועברים במזון בתעלת העיכול של הזבובים הייתה גבוהה משמעותית מזו שעל פני השטח של הגוף. השכיחות של מיני kob backer על פני השטח של הגוף ובתעלות העיכול של הזבובים הייתה גבוהה סטטיסטית מהשכיחות של salmonella ו-tarica ו-listeria monocytogenes. עם זאת, לא נצפו הבדלים סטטיסטיים בעת ביצוע השוואות זוגיות בין פני השטח של הגוף לתעלות העיכול של הזבובים עבור כל פתוגן חיידקי לאחר התפתחותו.טכניקה זו סללה את הדרך עבור אנשי מקצוע אחרים בתחום חקירת התפרצויות של מחלות המועברות במזון לסריקת זבובים בודדים לצורך זיהוי נוכחות של פתוגנים חיידקיים, ולהשגת מידע נוסף על המנגנוים שבאמצעותם מופצים מיקרואורגניזמים המועברים במזון. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שאישור של תוצאות PCR חיוביות הוא חלק מנוהל העבודה הסטנדרטי של מעבדות רבות, ולמטרות רגולטוריות, מומלץ לבודד את התרבית לצורך אישור לאחר ביצוע פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון yp, טביעת אצבע של DNA או ריצוף גנומי מלא כדי לענות על שאלות נוספות, כגון זיהוי הזן של הפתוגן החיידקי המועבר במזון שנשא על ידי הזבוב.

detection-of-foodborne-bacterial-pathogens-from-individual-filth-flies

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מקור: Dodge, R., et al. ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בפורמט צלחת של 96 בארות המיושמת על המיקרוביום של דרוזופילה . J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים את הכימות של יחידות יוצרות מושבה (CFUs) של חיידקים הקשורים למעיים בזבובי דרוזופילה באמצעות גישת דילול וציפוי סדרתי. דגימות זבובים הומוגניות המכילות חיידקי מעיים מדוללות באופן סדרתי, מצופות על אגר ומודגרות כדי לאפשר צמיחת מושבה. לאחר מכן מנותחים תמונות של הלוחות באמצעות תוכנה ליישור, פילוח וספירת מושבות בכל נקודה, מה שמאפשר כימות מדויק של CFU.

כימות יחידות יוצרות מושבה של חיידקים הקשורים למעיים בזבובי דרוזופילה

מקור: סיווה-ג'ותי, ג'. א. ואחרים. זיהום חיידקי דרך הפה ונשירה ב-Drosophila melanogaster. J. vis. exp. (2018)הסרטון מדגים את ההדבקה בפה של Drosophila melanogaster בחיידקים פתוגניים. הוא כולל הכנת בקבוקי זיהום והעברת זבובים רעבים כדי לאפשר בליעת חיידקים. ההליך מתעד קולוניזציה במעי, ואחריה עיקור פני השטח והומוגניזציה של זבובים. לבסוף, הוא מראה כימות של עומס חיידקים פנימי באמצעות דילול סדרתי וספירת מושבות.

זיהום פה של דרוזופילה מלנגסטר עם חיידקים פתוגניים

מקור: Pava-Ripoll ואחרים. זיהוי פתוגנים חיידקיים המועברים במזון מזבובי לכלוך בודדים. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון הזה מדגים שיטה מבוססת PCR שמגבירה DNA חיידקי מטרה מדגימות זבובים מועשרות באמצעות טבליות ייחודיות לפתוגן, ומאפשרת זיהוי פלואורסצנציה בזמן אמת וניתוח עקומת התכה לאישור נוכחות פתוגנים המועברים במזון בחרקים בודדים.

זיהוי מבוסס PCR של פתוגנים המועברים במזון מדגימות זבובים מועשרות

סרטון זה מדגים טכניקה להדביק דרוזופילה על ידי החדרת חיידק פתוגני ישירות לחלל גופם. שיטה זו עוקפת מחסומי אפיתל ומנגנוני הגנה פסיביים אחרים, ומאפשרת השראת זיהום מערכתי. עם ההדבקה, התגובה החיסונית המתקבלת מוערכת על ידי ניטור תמותת זבובים וביצוע בדיקות במורד הזרם.

טכניקת דקירה ספטית להחדרת זיהום חיידקי מערכתי בזבובים

במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה.

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב דרוזופילה

המטרה הכללית של מחקר זה הייתה כדי להדגים את מנגנון זיהום לחצות הפוטנציאלי של חיידקי ליסטריה הפתוגן במזון בהגדרת מעדנייה הקמעונאי. מתודולוגיה זו ניתן ליישם במגוון רחב של סביבות שונות כדי לעקוב אחר זיהום הפתוגן.

מעקב מיקרוביאלית זיהום בסביבות קמעונאיות באמצעות פלורסנט אבקה - קמעונאות מעדני סביבת דוגמא

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

פרוטוקול לפיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA הכוללת של אלקטרודות פחמן חלקיקי-לאחרונה, המסך המודפס מיוצב חומצה, זהב polylactic לזהות ויבריו parahaemolyticus מוצג.

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי לחשוף ולהדביק את זבוב הפירות הים דרוזופילה melanogaster עם פתוגנים חיידקיים אורלית, וכדי למדוד את מספר חיידקים זיהומיות המחסן בעקבות זיהום במעיים. בהמשך נתאר את ההשפעה של החיסון מוטציות על הישרדות לעוף בעקבות זיהום חיידקי הפה.

זיהום חיידקי הפה ו Shedding ב דרוזופילה melanogaster

שיטה זו מכמתת את השפע המיקרוביאלי באמצעות תבנית צלחת של 96 בארות ליחידות יוצרות מושבות לוחות (CFUs) ומיושמת על המיקרוביום Drosophila בדגימות הומוגניות של זבובים שלמים. יחידות CFU נספרות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות אוטומטית המסופקת כאן.

ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בתבנית צלחת 96 בארות המיושמת על מיקרוביום הדרוזופילה

הגברת האיתור של זבובי פירות טפריטידים לא בוגרים בשטח יכולה לעורר מאמצים בזמן לחסל אוכלוסיות של מזיקים הרסניים אלה. איתור זחלי אינסטאר מאוחרים הוא מהיר ומדויק יותר כאשר מועכים פירות פונדקאי בשקית ומעבירים את הציפה דרך סדרה של מסננות מאשר חיתוך ידני ובדיקה חזותית.

ניפוי עיסת פירות לאיתור זבובי פירות טפריטידים לא בשלים בשדה

למדו פרוטוקול PCR לזיהוי פתוגנים חיידקיים כמו Salmonella ו-Listeria מזבובי פרת. שיטה זו מאפשרת גילוי מהיר ואמין של חיידקים ממקורות סביבתיים במהלך חקירת התפרצויות מזון.

איתור של foodborne פתוגנים חיידקיים מזבובי הפרט Filth

גלה סרטונים נוספים