דוגמנות מחזור החיים של נגיף האבולה תחת 2 תנאים ברמת בטיחות ביולוגיים עם חלקיקים כמו וירוס המכילים Tetracistronic Minigenomes

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לדגמן את מחזור החיים של נגיף האבולה הפתוגני ביותר תחת תנאי בטיחות ביולוגית רמה 2 (biosafety level two). דבר זה מושג על ידי ייצור חלקיקים דמויי-נגיף (virus-like particles), להם הרכב חלבונים זהה לזה של חלקיקי נגיף האבולה, אך הם נושאים מיני-גנום במקום את הגנום הנגיפי. מיני-גנום הוא גרסה ממוזערת של הגנום הנגיפי שבה הוסרו גנים נגיפיים והוחלפו בגן דגלי (reporter gene) כגון לוסיפראז.

חשוב לציין כי המיני-גנום המשמש לניסוי זה עדיין נושא מספר גנים ויראליים, המקודדים עבור החלבונים הוויראליים VP40, GP-one two ו-VP24. חלקיקים דמויי נגיף (Virus like particles) מיוצרים על ידי ביטוי של מיני-גנום בתאי 293T, הנקראים תאי יצרן, יחד עם החלבונים הוויראליים np, VP35, VP30 ו-L, אשר יחד מכונים גם חלבוני RNP.

לאחר מכן, המיני-גנום משוכפל ומועתק ל-mRNAs על ידי החלבונים הוויראליים. ה-mRNAs מקודדים לדיווח ה-Luciferase ולחלבונים הוויראליים הנוספים VP40, GP-one two ו-VP24. שלושה חלבונים אלו מובילים יחד לייצור של חלקיקים דמויי נגיף, הנקראים חלקיקים דמויי נגיף בעלי יכולת שחזור ותעתוק או TRVLPs, מכיוון שהנוקלאו-קפסידים שבהם מסוגלים לעבור שחזור ותעתוק של הגנום. מכיוון ש-TLPs נושאים את הגליקופרוטאין של נגיף האבולה GP-one two, הם מסוגלים להדביק תאי מטרה.

תאי מטרה אלו עברו טרנספקציה מוקדמת עם פלסמיד ביטוי עבור np, VP35, VP30 ו-L. יחד, חלבוני RNP אלו מזהים את המיני-גנום שהוכנס לתאי המטרה בתוך ה-TRVLPs. לאחר מכן המיני-גנום עובר שכפול ושעתוק, מה שמוביל לפעילות של חלבון דגל (reporter activity), וכן לייצור של TRVLPs חדשים, שניתן להשתמש בהם שוב כדי להדביק תאי מטרה חדשים.

חשוב לציין כי המיני-גנום אינו נושא את המידע הגנטי הדרוש לשכפולו. לפיכ労, TRVLPs אינם יכולים להדביק באופן יעיל תאים שאינם מבטאים את ארבעת חלבוני ה-RNP. עובדה זו הופכת את המערכת לבטוחה לשימוש תחת תנאי רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).

היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת לנו למדל את מחזור החיים המלא של הנגיף, כולל שכפול הגנום, ביטוי של תוצרי גנים ויראליים, ייצור של חלקיקי נגיף והדבקה של תאי מטרה לאורך מספר מחזורי גורמי הזרקה, תחת תנאי בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2). משמעות הדבר היא שניתן לבצע עבודה זו ללא מעבדת הכלה מקסימלית, הדרושה בדרך כלל לעבודה עם נגיפי Ebola חיים. ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקות אחרות, כגון השתקה (knockdown) של גורמים תאיים באמצעות RNA או ביטוי יתר של גורמים אלו, כדי לחקור את תפקידם של גורמים אלו בביולוגיה של הנגיף. כמו כן, אנו יכולים להחדיר מוטציות לגנים של הנגיף כדי לחקור את תפקידם של גנים אלו ושל תוצרי הגנים בביולוגיה של הנגיף.

בצעו פיצול תאים (Split) על ידי הסרת המצע מתאי 293T שהגיעו ל-80 עד 90% התמסרות (confluency), שטיפתם פעמיים ב-PBS והוספת שני מיליליטר של trypsin לתאים. המתינו עד שהתאים יקבלו צורה עגולה.

לאחר מכן, שחררו אותם על ידי הקשה על הבקבוק והוספת 8 mL של מצע עם 10%FBS אל התאים. ספרו את התאים באמצעות סופר תאים אוטומטי, לאחר מכן דללו את התאים לריכוז של 2×10⁵ תאים למיליליטר וזריעו 2 mL לכל באער של פלטת 6 באערים. החזירו את התאים לאינקובטור לח עם 37 °C ו-5%CO2. לאחר 24 שעות, בצעו טרנספקציה לתאים עם הפלסמידים הדרושים להפקה של TRVLPs. בתוך BSC, פלפלו את ה-DNA לשפופרת באמצעות טיפים עם פילטר. כביקורת שלילית, באחד הבאערים יש להשמיט את הפלסמיד המקודד ל-viral polymerase L; במקומו, ניתן לבצע טרנספקציה לפלסמיד המקודד ל-GFP כדי להדמיות את יעילות הטרנספקציה. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של optimum לכל באער אל ה-DNA. ערבבו את השפופרת ב-Vortex וסובבו אותה בצנטריפוגה (spin down).

בשלב הבא, הוסף 7.5 µL של ריאגנט הטרנספקציה transIT LT-one ל-DNA המדולל. ערבב בעדינות את המבחנה באמצעות וורטקס והדגרה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, ערבב בעדינות את תערובת הטרנספקציה על ידי שאיבה והזרקה חוזרת בפיפט, ולאחר מכן הוסף 100 µL לכל באער בלוח של שישה באערים בטפטוף.

לאחר הוספת קומפלקסי התעתוק לתאים, נעו את הפלטה קדימה ואחורה ומצד לצד. אין לסובב את הפלטה בתנועה מעגלית, שכן הדבר יוביל לתעתוק לא אחיד. לאחר מכן, החזירו את התאים לאינקובטור. 24 שעות לאחר התעתוק, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) מהתאים. לאחר מכן, הוסיפו לתאים ארבעה מיליליטרים של מצע גידול עם 5% FBS והחזירו אותם לאינקובטור.

24 שעות לאחר טרנספקציה של תאי המפיק, פצלו את תאי 293T כפי שתואר בעבר. 24 שעות לאחר הפיצול, בצעו טרנספקציה של הפלסמידים המקודדים עבור חלבוני RNP של נגיף האבולה, וכן עבור Tim-one, המשמש כגורם הידבקות עבור נגיפי האבולה. 72 שעות לאחר טרנספקציה של תאי המפיק ו-24 שעות לאחר טרנספקציה של תאי המטרה, אספו את העלון (supernatant) מתאי המפיק והעבירו אותו בפיפט למבחנה של 15 מיליליטר.

לאחר קצירת הנוזל העליון (supernatant), הסיר כל שארית נוזל והוסף 250 µL של glow lysis buffer על התאים והדגס אותם למשך 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, קבע את פעילות הלוציפראז (luciferase) כפי שמתואר בשלב השלישי של סרטון זה. בינתיים, סבב את הנוזל העליון מתאי היצרן (producer cells) במשך חמש דקות ב-800 g ובטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את המצע מהתאים המטרה והוסף שלושה מיליליטר של העליון המזוקק (clarified supernatant) מתאי ה-P-zero לתאי המטרה. בצע זאת בבאר אחת בכל פעם. בסיום, החזר את תאי המטרה לאינקובטור. 24 שעות לאחר ההדבקה.

הסיר את תרחיף העל ממעלה התאים המטרה. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיליליטרים של מצע עם 5%FBS לתאים והחזר אותם לאינקובטור. כדי לקבוע את פעילות הדו"ח (reporter activity) בתאי יצרן או בתאי מטרה, קצור תאים אלו 72 שעות לאחר הטרנספקציה במקרה של תאי יצרן, ו-72 שעות לאחר ההדבקה במקרה של תאי מטרה.

כדי לעשות זאת, הסר את הנוזל העליון (supernatant) מהתאים, הוסף לתאים 250 µL של glow lysis buffer והדגש אותם למשך 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. במידת הצורך, ניתן להשתמש בנוזל העליון כדי להדביק קבוצה חדשה של תאי מטרה. במקרה זה, אסוף את הנוזל העליון והדבק תאי מטרה כפי שמתואר בשלב השני של סרטון זה.

בינתיים, הפשיר 40 µL לבאר של בופר לבדיקת לוסיפראז והוסף לבופר נפח של 1/100 מתסריט (substrate) לוסיפראז. ערבב בוורטקס את ריאגנט הלוסיפראז המוכן, וודא שהוא הגיע לטמפרטורת החדר לפני ההמשך. לאחר מכן, פפט 40 µL מהריאגנט לתוך פלטת 96 בארות לבנה ואטופה. כדי למנוע בעיות של crosstalk, מומלץ להשאיר באר אחת ריקה בין בארות הדגימות. לאחר סיום הדגירה של 10 דקות, שטוף את התאים לתוך בופר הליזה באמצעות פיפטור והעבר את ליזאט התאים למבחנה. סבב (Spin down) את הליזאטים למשך שלוש דקות ב-10,000 g ובטמפרטורת החדר. לאחר מכן, פפט 40 µL מהליזאטים לתוך פלטת 96 הבארות המכילה את ריאגנט הלוסיפראז. דגרי את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, מדוד את פעילות הלוסיפראז באמצעות לומינומטר. זמן האינטגרציה למדידת הלומינסנציה צריך להיות שנייה אחת. בלומינומטר מיקרופלטה של Modulus, אותות לומינסנציה טיפוסיים עבור הביקורת החיובית צריכים להיות סביב 1x10⁶ עד 1x10⁷, בעוד שהאות עבור הביקורת השלילית צריך להיות נמוך לפחות בשניים עד שלושה סדרי גודל (logs). במעברים (passages) הבאים, פעילות הרפורטר בביקורות החיוביות צריכה להישאר יציבה, בעוד שפעילות הרפורטר בביקורות השליליות צריכה לרדת לרמות הרקע.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להיות מסוגלים להפיק חלקיקים דמויי נגיף (VLPs) בעלי יכולת לשכפול ותעתוק של נגיף האבולה, להשתמש בהם כדי להדביק תאי מטרה ולמדוד פעילות של גן דגל (reporter activity) בתאי היצרן ובתאי המטרה.

חשוב לציין כי ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקות אחרות, כגון השתקה (knockdown) של גורמים תאיים באמצעות RNA, כדי לחקור את תפקידם של גורמים אלו בביולוגיה של נגיפים. כמו כן, ניתן להחדיר מוטציות לרכיבי הנגיף המשמשים בשיטה זו, על מנת לבחון את תפקידם של רכיבים אלו במחזור החיים של נגיף האבולה. פרטים ניסיוניים נוספים וריאגנטים ספציפיים ניתן למצוא במאמר המצורף לסרטון זה.