פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

המטרה הכללית של הליך זה היא להומוגניזציה מהירה של שברי רקמה אנושית לתמיסות תאים בודדים ללא עיכול אנזימטי, לצורך ניתוח איכותני וכמותי ובידוד של תתי-אוכלוסיות ספציפיות של לימפוציטים. דבר זה מושג תחילה על ידי שימוש בסכין מנתחים (scalpel) סטרילית לחיתוך שברי הרקמה לחתיכות קטנות. לאחר מכן, תמיסת הרקמה מועברת למבחנה לפירוק מכני, שבה שברי הרקמה עוברים הומוגניזציה נוספת לתמיסת תאים בודדים.

לאחר מכן, התאים נאספים באמצעות סנטריפוגציה לצורך אנליזות המשך. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בציטומטריה זורמת כדי לנתח את הלימפוציטים המסתננים ותתי-אוכלוסיות שלהם. המעבדה שלי פיתחה טכניקה זו מכיוון שחיפשנו דרך שבה ניתן לדמות את הלימפוציטים המסתננים לגידול מבלי להשפיע באופן משמעותי על מצבם הטבעי.

רצינו שיטה שתאפשר לנו לבודד את התאים במהירות ולנתח אותם כפי שהיו בזמן הניתוח. טכניקה זו שימשה עבור יותר מ-300 גידולי שד ורקמות נורמליות במעבדה שלנו; היא קלה לשימוש וניתנת ליישום על בסיס יומי. ניתן להשתמש בה לבחינת סממנים פרוגנוסטיים, תגובה לטיפול ותוצאות קליניות ארוכות טווח.

מי שידגים את הטכניקה כיום הוא ג'ון ניקולא לואיס, טכנאי במעבדה שלי. התחילו בשקילת דגימת הרקמה ולאחר מכן מדדו את אורך, רוחב וגובה הרקמה. לאחר מכן, העבירו את מקטע הרקמה לצחנת פטרי קטנה המכילה 1 mL של מדיום תאי המטופואטי ללא סרום, המוגדר כימית ומתאים, והשתמשו בסכין מנתח סטרילית כדי לקצץ את הדגימות לחתיכות קטנות של 1 עד 2 mm².

בשלב הבא, העבירו את תוכן הצלחת לתוך מבחנת C לפירוק מכני ושטפו את הצלחת ואת הסכין עם שני מיליליטרים של מדיום. הוסיפו את תמיסת השטיפה למבחנת ה-C והפעילו את תוכנית הפירוק המכני 0.01 פעמיים ברצף כדי להומוגניזציה בעדינות של חלקי הרקמה לתליה של תאים בודדים. לאחר המחזור השני, שפכו את ההומוגנאט דרך מסנן תאים של 40 מיקרומטר לתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, השתמש באותה פיפט ששימשה לשטיפת פטריית הפטרי כדי להעביר כל נוזל שנותר במבחנה C אל מסננת התאים. לאחר מכן, השתמש במיקרו-פיפט של 1 ml כדי להעביר את הנוזל המסונן למבחנה קונית של 15 ml, ושטוף את מבחנה C עם 3 ml נוספים של מצע. העבר שטיפה זו דרך מסננת התאים אל המבחנה של 50 ml.

לאחר מכן, הזיזו בעדינות את הרקמה שלא עברה הומוגניזציה סביב המסננת בעזרת טיפ נקי של 1 ml כדי לסחוט את כמות הנוזל השארית המקסימלית הכלואה ברקמה אל תוך המבחנה של 50 ml. כעת, הניחו את מסננת התאים הפוכה מעל למבחנה C המקורית ושטפו את המסננת עם 3 ml נוספים של מדיום, כך שהרקמה שלא עברה הומוגניזציה תיפול חזרה למבחנה C. בצעו הומוגניזציה חוזרת לרקמה למשך שני מחזורים נוספים כפי שהודגם, ולאחר מכן שפכו הומוגנאט שני זה דרך מסננת התאים.

שטפו שוב את מבחנה C עם שלושה מיליליטרים נוספים של מדיום. לאחר מכן, סננו את הנוזל העליון דרך המסננת וסחטו את הנוזל שנותר מהרקמה כפי שהודגם זה עתה. בשלב זה, נפח של כ-2.5 מיליליטרים של תרחיף תאים בודדים אמור להיות במבחנה של 15 מיליליטרים, וכ-שבעה מיליליטרים אמורים להיראות במבחנה של 50 מיליליטרים.

כדי להפריד את העל-נוזל (supernatant) של הרקמה מהתאים, ראשית סבבו במרכז פוגה (centrifuge) את שני מבחלות ההומוגנאט למשך 15 דקות ב-600 Gs ובטמפרטורת החדר; העבירו את העל-נוזל מהמבחלה בנפח 15 מיליליטר למבחלה בנפח 1.5 מיליליטר, והניחו אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשליכו את העל-נוזל מהמבחלה בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן, הקישו בעדינות כל מבחלה על משטח קשיח כדי לפרק את משקעי התאים. השעיקו מחדש את משקע התאים הרפוי במבחלה בנפח 50 מיליליטר עם 500 microliters של מצע, והעבירו את התאים למבחלה בנפח 15 מיליליטר כדי להשעיק מחדש את המשקע השני.

לאחר מכן, שטפו את המבחנה בנפח 50 milliliter עם 500 microliters נוספים של מדיום והעבירו את השטיפה למבחנה בנפח 15 milliliter להשגת מקסימום של השגיית תאים. לאחר ספירת מספר התאים החיים בשיטת הדחת trypan blue, צנטריפגו את תרחיף התאים למשקע. לבסוף, צנטריפגו את העל-נוזל של הרקמה ששמרתם.

לאחר מכן, העבירו בזהירות את העילוי לפחות למבחנה נקייה אחת, ללא נגיעה או הפרעה של המשקע, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 80- °C לצורך ניתוחים המשכיים בעתיד. בגרפים אלו מוצגים דגמים מייצגים של תרשימי נקודות (dot plots) מציטומטריה של זרימה של הומוגנאטים של תאי גידול שפוצלו, לאחר סימון בנוגדנים ספציפיים נגד לוקוציטים וסמנים של תאים אפיתליאליים, כפי שהודגמה. פרוטוקול זה אינו משנה באופן משמעותי את החיוניות של התאים החיוביים ל-CD 45.

עם זאת, קיים אובדן ניכר של תאים חיוביים ל-EPAM בעלי חיוניות. למרות זאת, ניתן להפריד בין תתי-אוכלוסיות חיוביות ל-EPAM וחיוביות ל-CD 45 בעלות חיוניות, על בסיס גודלן ומבנהן, לתאי גידול אפיתליים גדולים, תאים אפיתליים קטנים, או תאים חיוביים ל-CD 45 גדולים וקטנים. תרשימי פיזור (dot plots) מייצגים של ציטומטריה זרימה עבור תתי-האוכלוסיות העיקריות החודרות לגידול מוצגים כאן, כאשר הלימפוציטים נבחרו (gated) על בסיס החיוניות של התאים החיוביים ל-CD 45.

לבסוף, ניתן להשוות את ביטוי הציטוקינים או את סך האימונוגלובולינים שנמצאים בסילוף (supernatant) של סרטן השד לסילוף מרקמת שד נורמלית, מה שחושף, כפי שמוצג בניסוי מייצג זה, עליות בשני סוגי החלבונים הקשורים לרקמת הגידול. במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במהירות ובנקיון ולהוציא את כמות החומר המקסימלית בכל שלב של הפרוצדורה כדי להשיג מספר מספיק של תאים עבור ניתוח נקודת הסיום שלכם.