פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להומוגניזציה מהירה של שברי רקמות אנושיות לתרחיף תא בודד ללא עיכול אנזימטי לצורך ניתוח איכותי וכמותי ובידוד של תת-אוכלוסיות לימפוציטים ספציפיות. זה מושג על ידי שימוש תחילה באזמל סטרילי כדי לחתוך את שברי הרקמה לקוביות קטנות. לאחר מכן, תמיסת הרקמה מועברת לצינור מנותק מכני שבו השברים הומוגניים עוד יותר לתרחיף תא בודד.

לאחר מכן התאים נאספים על ידי צנטריפוגה לניתוח במורד הזרם. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בזרימה ציטומטרית כדי לנתח את הלימפוציטים החודרים, תת-אוכלוסיות אסייתיות. המעבדה שלי פיתחה את הטכניקה הזו מכיוון שחיפשנו דרך שבה נוכל לדמות לימפוציטים חודרים לגידול מבלי להשפיע באופן דרמטי על מצבם הטבעי.

רצינו משהו שבו נוכל לבודד במהירות את התאים ולנתח אותם כפי שהם היו בניתוח. טכניקה זו שימשה על יותר מ-300 גידולי שד ורקמות תקינות במעבדה שלנו, והיא קלה לשימוש וניתן להשתמש בה על בסיס יומיומי. ניתן להשתמש בו כדי לבחון סמנים פרוגנוסטיים, תגובה לטיפול ותוצאות קליניות ארוכות טווח.

מי שידגים את הטכניקה הזו היום יהיה ג'ון ניקולה לואיק. טכנאי במעבדה שלי מתחיל בשקילת דגימת הרקמה ולאחר מכן מודד את אורך, רוחב וגובה הרקמה. לאחר מכן העבירו את שבר הרקמה לצלחת פטרי קטנה המכילה מיליליטר אחד של מדיום התאים ההמטופויאטי המתאים והמוגדר כימית, והשתמשו באזמל סטרילי כדי לחתוך את הדגימות לקוביות קטנות של מילימטר עד שניים רבועים.

לאחר מכן, העבירו את תכולת המנה לצינור C דיסוציאציה מכני ושטפו את הכלי והאזמל בשני מיליליטר בינוני. הוסף את השטיפה לצינור C ולאחר מכן הפעל את תוכנית הדיסוציאציה המכנית של 0.01 פעמיים ברציפות כדי להומוגניזציה עדינה של שברי הרקמה לתרחיף תא בודד. לאחר המחזור השני, שפכו את ההומוגנאט דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן השתמש באותו מזיק שפיפטה שלך משטיפת צלחת הפטרי כדי להעביר את כל הנוזלים שנותרו בצינור C לתוך מסננת התאים. לאחר מכן, השתמש במיקרו פיפטה של מיליליטר אחד כדי להעביר את הנוזל המסונן לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ולשטוף את צינור C בשלושה מיליליטר נוספים של מדיום. העבירו את השטיפה הזו דרך מסננת התאים לתוך הצינור של 50 מיליליטר.

לאחר מכן הזיזו בעדינות את הרקמה הלא הומוגנית סביב המסננת עם קצה נקי של מיליליטר אחד כדי לסחוט את הכמות המקסימלית של שאריות הנוזל הכלואות ברקמה לתוך הצינור של 50 מיליליטר. כעת, הניחו את מסננת התאים הפוכה על גבי צינור ה-C המקורי ושטפו את המסננת עם שלושה מיליליטר נוספים של מדיום כך שהרקמה הלא הומוגנית תיפול בחזרה לתוך צינור C. הומוגניזציה מחדש של הרקמה למשך שני מחזורים נוספים כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן שפכו את ההומוגנאט השני הזה דרך מסננת התאים.

שוב, שטפו את צינור C עם עוד שלושה מיליליטר מדיום. לאחר מכן יש לסנן את הנוזל העל-טבעי דרך המסננת ולסחוט את שאריות הנוזל מהרקמה כפי שהודגם זה עתה. בשלב זה, נפח של כ -2.5 מיליליטר של תרחיף תאים בודדים צריך להיות נוכח בצינור של 15 מיליליטר, ויש להקפיד על כתשעה מיליליטר בצינור של 50 מיליליטר.

כדי להפריד את הסופרנטנט של הרקמה מהתאים הצנטריפוגה הראשונה, שתי השפופרות של ההומוגנט למשך 15 דקות ב-600 ג'י-שניות ובטמפרטורת החדר, משליכות את הסופרנטנט מצינור ה-15 מיליליטר לתוך שפופרת של 1.5 מיליליטר, ממקמות אותו בארבע מעלות צלזיוס ומשליכות את הסופרנטנט מצינור ה-50 מיליליטר. לאחר מכן הקש בעדינות על כל צינור על משטח קשה כדי לפרק כל אחד מכדורי התא. השעו מחדש את כדור התא הרופף בצינור של 50 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של מדיום, והעבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר כדי להשעות מחדש את הגלולה השנייה.

לאחר מכן שטפו את צינור ה-50 מיליליטר עם עוד 500 מיקרוליטר של מדיום והעבירו את הכביסה לצינור 15 מיליליטר להתאוששות תאים מקסימלית. לאחר ספירת מספר התאים ברי הקיימא על ידי כדור הדרה כחול טריאן תרחיף את תרחיף התאים. לבסוף, סובב את הרקמה השמורה.

לאחר מכן העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור נקי אחד לפחות מבלי לגעת או להפריע לגלולה ואחסנו אותה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי במורד הזרם. בגרפים אלה, תרשימי נקודות זרימה מייצגת של הומוגנטים של תאי גידול מנותקים, ואחריהם תיוג עם נוגדנים ספציפיים נגד לויקוציטים וסמני תאי אפיתל מוצגים כפי שמודגם. פרוטוקול זה אינו משנה באופן משמעותי את הכדאיות של התאים החיוביים ל-CD 45.

עם זאת, יש אובדן ניכר של תאים חיוביים ל-EPAM ברי קיימא. למרות זאת, ניתן להפריד תת-קבוצות חיוביות ל-EPAM ו-CD 45 חיוביות על בסיס גודלן ומבנהן לתאי גידול אפיתל גדולים, תאי אפיתל קטנים או תאים חיוביים CD 45 גדולים וקטנים. תרשימי נקודות ציטומטריית זרימה מייצגת של תת-הקבוצות העיקריות החודרות לגידול מוצגות כאן עם הלימפוציטים מגודרים על הכדאיות של התאים החיוביים CD 45.

לבסוף, ניתן להשוות את ביטוי הציטוקינים או סך האימונוגלובולינים הקיימים בסופרנטנט של סרטן השד עם הסופרנטנט מרקמת שד רגילה החושפת כפי שהודגם בניסוי מייצג זה, עלייה בשני סוגי החלבונים הקשורים לרקמת הגידול בזמן שהמשתתף הוא הליך, חשוב לזכור לעבוד במהירות ולנקות ולשחזר את כמות החומר המקסימלית בכל שלב של ההליך כדי להשיג מספר מספיק של תאים עבור ניתוח נקודות הקצה שלך.