Name: שקיעת שיווי משקל של חלבון ממברנה הקטן oligomer יוצרי: אפקט של היסטידין protonation על pentameric יציבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: חקור שקיעת שיווי משקל לחקר יציבות אוליגומרים של חלבון ממברנה הקטן מנגיף hRSV. השיטה מאפשרת לקבוע גודל הפנטמר ולהעריך את השפעת pH על היציבות במערכת ביולוגית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) ומענק Tier 1 RG 51/13.

<ol><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).</li>
<li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science%3A+A+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li>
<li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530(2009).</li>
<li>Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+heterologous+protein-protein+interactions+using+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods-a+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation.</a> Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+association+and+assembly+the+study+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+for+the+XLI+analytical+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge.</a> Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions+-+Methods+for+Detection+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis.</a> Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).</li>
<li>Alexandrov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+for+high-throughput+co-expression+of+protein+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).</li>
<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).</li>
<li>Ebel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+velocity+to+characterize+surfactants+and+solubilized+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins.</a> Methods. 54, 56-66 (2011).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+reversible+macromolecular+associations+via+sedimentation+equilibrium%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction.</a> Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).</li>
<li>Dowell, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+is+an+important+cause+of+community-acquired+lower+respiratory+infection+among+hospitalized+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults.</a> J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).</li>
<li>Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+virus+from+which+the+entire+SH+gene+has+been+deleted+grows+efficiently+in+cell+culture+and+exhibits+site-specific+attenuation+in+the+respiratory+tract+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse.</a> J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).</li>
<li>Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+respiratory+syncytial+virus+small+hydrophobic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein.</a> J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).</li>
<li>Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+viruses+with+deletions+in+the+NS1%2C+NS2%2C+SH%2C+and+M2-2+genes+are+attenuated+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo.</a> Virology. 273, 210-218 (2000).</li>
<li>Karron, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+SH+and+G+proteins+are+not+essential+for+viral+replication+in+vitro%3A+clinical+evaluation+and+molecular+characterization+of+a+cold-passaged%2C+attenuated+RSV+subgroup+B%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).</li>
<li>Whitehead, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+virus+bearing+a+deletion+of+either+the+NS2+or+SH+gene+is+attenuated+in+chimpanzees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees.</a> J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).</li>
<li>Rixon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+%28SH%29+protein+accumulates+within+lipid-raft+structures+of+the+Golgi+complex+during+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection.</a> J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).</li>
<li>Collins, P. L., Mottet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+orientation+and+oligomerization+of+the+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus.</a> J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).</li>
<li>Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus%3A+comparison+between+antigenic+subgroups+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B.</a> J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).</li>
<li>Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+the+respiratory+syncytial+virus+SH+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene.</a> J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).</li>
<li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+protein+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+forms+pentameric+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li>
<li>Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+%28hRSV%29+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li>
<li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+membrane+protein+molecular+weights+and+association+equilibrium+constants+using+sedimentation+equilibrium+and+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).</li>
<li>Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation%3A+Sedimentation+Velocity+and+Sedimentation+Equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).</li>
<li>Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+membrane+protein+molecular+weight+using+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Prot.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22An-50+Ti+and+An-60+Ti+Analytical+Rotor%2C+Cells%2C+and+Counterbalance%22">An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance</a>. , Beckman Coulter, Inc. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003">https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003</a> (2005).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+membrane+proteins+in+detergent+solution+by+analytical+ultracentrifugation%3A+Different+methods+for+density+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Colloid+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching.</a> Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).</li>
<li>Laue, T. Ch. 20.3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaue%2C+T+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. 20, John Wiley & Sons, Inc. 20.23.21-20.23.13 (2001).</li>
<li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Small+Hydrophobic+Protein+Of+The+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Forms+Pentameric+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li>
<li>Bevington, P. R., Robinson, D. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBevington%2C+PR+%22Data+reduction+and+error+analysis+for+the+physical+sciences%22">Data reduction and error analysis for the physical sciences</a>. 336, McGraw-Hill. New York. (1969).</li>
<li>Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+equilibrium+analysis+of+recombinant+mouse+FcRn+with+murine+IgG1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1.</a> Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).</li>
<li>Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+method+for+simultaneous+homo-oligomeric+size+determination+and+monodispersity+conditions+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins.</a> Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).</li>
<li>Montserret, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+structure+and+ion+channel+activity+of+the+p7+protein+from+hepatitis+C+virus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus).</a> J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).</li>
<li>Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation+Studies+of+the+Influenza+M2+Homotetramerization+Equilibrium+in+Detergent+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Progr+Colloid+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions.</a> Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).</li>
<li>Sorkin, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+endocytosis%3A+Close+encounters+of+many+kinds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).</li>
<li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+%28hRSV%29+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science+%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מספק פרוטוקול ניסוי להכנת מדגם וניתוח של oligomerization של חלבון קרום קטן בחומר ניקוי באמצעות שיקוע שיווי משקל. הפרוטוקול המתואר באותה מידה תקף -ואז simpler- לחלבונים מסיסים, כמו לא נדרש צעד התאמת צפיפות. ואכן, המערכת היוותה ידי תערובת של חומרי ניקוי וחלבון. לערוך מחקרי שקיעה, חומרי הניקוי חייב להיות בלתי נראים לשדה הכבידה, כך שהוא אינו תורם להנפקת החלקיקים. לפיכך, הצפיפות של חומר הניקוי יש להיות מתאימה בקפידה על ידי תוספת של D 2 O למאגר, עם ההגבלה שאם חומר הני...

ultracentrifugation אנליטית 1-5 הוא אחת מהשיטות החשובות ביותר ללמוד אינטראקציות של מקרו-מולקולות בתנאים פיסיולוגיים, להיות נגיש לשני אינטראקציות חלשות וחזקות. השיטה היא ללא תווית ומשתמשת קליטה או הפרעות של אור, והוא יכול לשמש גם מערכות אופטיות הקרינה לגשת טווחי ריכוז על פני כמה סדרי הגודל 6. שיטה זו שימושית במיוחד מכיוון שרוב התהליכים ביוכימיים תלויים באינטראקציות הפיכה. Stoichiometry ועוצמתו של אינטראקציות אלה צריכים להיות מאופיינים כמותית להבין תהליכים ביולוגיים, ומספר השיטות קיים למטרה זו 7, 8. עם זאת, אינטראקציות חולפות קשות ללמוד 9. הבחירה של שיטה לאפיון אינטראקציות macromolecular תלויה באופי סטטי או הדינמי שלה. במקרה הראשון, sedim<html> entation מהירות (SV) משמשת, שבה השיעור של תחבורת רדיאלי נמדד ומתחמים הם מופרדים על בסיס ההבדלים במסה ובצורה קלילה. בניגוד לכך, עמותות דינמיות שהן הפיכים בקנה המידה של הניסוי הזמן לא ניתן להפריד באופן פיזי. במקרה זה, עצמי או הטרו-אינטראקציות מובילות לאינטראקציות שאינן קוולנטיים נמצאות בשיווי משקל זה תלוי בסך הכל ריכוז החלבון. ניתן ללמוד אינטראקציות דינמיות אלה על ידי שני שיווי משקל שקיעה (SE) ומהירות שקיעה (SV) 10. עם זאת, השיטה הראשונה היא פשוטה לביצוע, והוא מתואר כאן. בSE, צנטריפוגה מתבצעת במהירות נמוכה מספיק כדי שהוא הגיע לשיווי משקל בין דיפוזיה ושקיעה. בשלב זה, פרופיל שיווי המשקל של אות אופטי (UV-VIS) כפונקציה של מרחק הרדיאלי, ניתן לנתח באמצעות מודלים תרמודינמיים שנקבע מראש לעמותות 11. ve_content &quot;&gt; במאמר הנוכחי, מחקר שיווי משקל שקיעה מוצג העמותה העצמית של חלבון קרום ויראלי שיוצר יון ערוצים. בגלל הידרופוביות שלה, הניסוי מנוהל בנוכחות של חומר ניקוי, ובמקרה זה את הצפיפות ממס צריך להיות מתאים לזה של חומר הניקוי. עם זאת, הפרוטוקול מתואר היית זהה במקרה של חלבון מסיס במים, פרט לכך שלא תהיה צורך התאמת צפיפות ממס. החלבון משמש מקודד בוירוס syncytial הנשימה האנושי (hRSV), pneumovirus עטוף במשפחת paramyxoviridae שגורמת למחלות בדרכי נשימה תחתונה בתינוקות, קשישים ואוכלוסיות מדוכאי חיסון ברחבי העולם 12. עד 64 מיליון מקרים מדווחים של זיהום hRSV ו160,000 מקרי מוות מתרחשים בכל שנה. הגנום hRSV מעתיק 11 חלבונים, ביניהם שלושה חלבוני קרום F, G, וקטן הידרופובי (SH). חלבון SH מעורבבפתוגנזה של זיהום RSV. RSV חסר את גן SH (RSVΔSH) היה בת-קיימא, שנגרם היווצרות syncytia וגדל, כמו גם את וירוס wild-type (WT) 13-16. עם זאת, וירוס RSVΔSH משוכפל פי 10 פחות יעיל מאשר WT בדרך הנשימה העליונה 15, 16. כמו כן, וירוס RSVΔSH היה ​​מופחת בעכבר vivo ודגמי שימפנזה 13, 17. החלבון הוא SH (תת-קבוצה RSV) 64 או 65 חומצות אמינו (תת-הקבוצה B RSV) סוג II חלבון קרום נפרד שמתרכז בעיקר בקרומים של תא Golgi 18 ארוך. חלבון SH יש אחד שחזה סליל תחום הטרנסממברני (TM) 19 אשר נשמרת 20,21 מאוד. תחומים extramembrane C- וN-terminal מכוונים lumenally / extracellularly וcytoplasmically, בהתאמה. שני תחום TM הסינתטי (שאריות 18-43) וחלבון SH אורך מלא הוכחו בצורת homopentamers במגוון רחב של חומרי ניקוי. טופס homopentameric אחראי על פעילות ערוץ בbilayers שומנים מישוריים 22,23. הכיוון הנכון של מונומרים TM בbilayer השומנים נקבע תחילה באמצעות dichroism האתר הספציפי אינפרא אדום 23, אשר הראה-22 להיות בlumenal, קרובה להבין-סליל, אורינטציה. אותו כיוון תחום TM אושר על ידי מחקרי NMR ששחזרו את pentameric סליל-חבילה של החלבון באורך מלא בdodecylphosphocholine (DPC) מיצלות 22. במודל &#39;micelle&#39; זה, תחום TM סליל a- יחיד היה מוקף N-סופני על ידי סליל, ו- C-סופני על ידי b-סיכת ראש ממושכת. שתי שאריות protonatable חלבון SH של, שלו 22 ו-51, נמצאים בתחום TM (האוריינטציה lumenally), ובקצה של סיכת ראש β C-מסוף extramembrane (רחוק מנקבובי הערוץ), בהתאמה. בenviro bicellarnment, לעומת זאת, α-helix TM משתרע עד-51, ושניהם השאריות שלו נגישות ללומן של הערוץ 24. מבנה ערוץ מאמצת ארכיטקטורה כמו משפך-22, שבו האזור הצר (Ser-29 לCys-45) 22 עטור שרשרות צד הידרופובי (Ile-32, Ile-36, Ile-40 וLeu-44), ו Ile-36 מגדיר את הנקודה הצרה ביותר בלומן הערוץ. שלו-22 ממוקם בפתיחה הגדולה ביותר של משפך זה, ואילו 51-הוא בקצה של הפתיחה הקטנה ביותר. בעבודה הנוכחית, צנטריפוגה אנליטיות במצב שיווי משקל שקיעה נעשתה שימוש כדי לקבוע אם protonation משפיע על היציבות של pentamer חלבון SH. במקרה זה, חלבון SH היה ​​solubilized בחומר ניקוי C14-betaine, אשר שימש בעבר כדי להראות שצורות חלבון SH oligomers pentameric 22.

<table><tbody><tr><td>3-(N,N-dimethylmyristylammonio)פרופנסולפונאט</td><td>סיגמא</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום 99.8%</td> <td>איזוטופ קיימברידג'</td><td>DLM-4-99.8</td><td></td></tr><tr><td>An-50 Ti רוטור, אנליטי, 8 מקומות</td><td>בקמן קולטר</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti רוטור, אנליטי, 4 מקומות</td><td>בקמן קולטר</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>תא דיור</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td>334784</tr><tr><td>12 מ"מ מרכז שישה ערוצים, אפון מלא פחם</td><td>בקמן קולטר</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק חלון</td><td>בקמן קולטר</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>אטם חלון</td><td>בקמן קולטר</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>תוחם חלון</td><td>בקמן קולטר</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>חלון ספיר</td><td>בקמן קולטר</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>חלון קוורץ</td><td>בקמן קולטר</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>מכונת כביסה טבעת בורג</td><td>בקמן קולטר</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>טבעת בורג</td><td>בקמן קולטר</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>ספינקוט</td><td>בקמן קולטר</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>מכלול מעמד מומנט</td><td>בקמן קולטר</td><td>361318</td> איזון בקמן קולטר 360219 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי יישור תאים</td><td>בקמן קולטר</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

שקיעת שיווי משקל של חלבון ממברנה הקטן oligomer יוצרי: אפקט של היסטידין protonation על pentameric יציבות

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

ultracentrifugation אנליטית (AUC) יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות הפיכים בין מקרו-מולקולות על פני טווח רחב של עוצמות אינטראקציה ובתנאים פיסיולוגיים. זה עושה AUC שיטת הבחירה להעריך stoichiometry ותרמודינאמיקה של הומו והטרו-עמותה שחולפות והפיכים בתהליכים ביוכימיים כמותית. באופנות של שיווי משקל שקיעה (SE), איזון בין דיפוזיה והשקיעה מספק פרופיל כפונקציה של מרחק הרדיאלי שתלויה בדגם ספציפי עמותה. במסמך זה, פרוטוקול SE מפורט מתואר כדי לקבוע את אנרגיית קשר הגודל ומונומר-מונומר של oligomer חלבון קרום קטן באמצעות ultracentrifuge אנליטיים. AUC-ES הוא ללא תווית, המבוסס רק על עקרונות פיזיים, וניתן להשתמש בו בשני חלבונים מסיסים וקרום המים. דוגמא מוצגת של האחרון, החלבון הקטן הידרופובי (SH) בוירוס syncytial נשימה האנושי (hRSV), פוליפפטיד חומצת אמינו עם 65-תחום α-סליל יחיד הטרנסממברני (TM) שיוצר תעלות יונים pentameric. נתונים מבניים המבוססים על NMR מראה כי חלבון SH שתי protonatable השאריות שלו בתחום הטרנסממברני שמכוונים מול לומן של הערוץ. ניסויי SE תוכננו כדי לקבוע כיצד pH משפיע קבוע עמותה וגודל oligomeric חלבון SH של. בעוד שצורת pentameric נשמרה בכל המקרים, קבוע הקשר שלה הופחת ב- pH הנמוך. נתונים אלה הם בהסכם עם תלות דומה pH נצפתה לפעילות ערוץ SH, עולה בקנה אחד עם נטייה lumenal של שתי השאריות שלו בחלבון SH. האחרונים עשויים לחוות דחייה אלקטרוסטטית ויציבות oligomer מופחתת ב- pH הנמוך. לסיכום, שיטה זו ישימה בכל פעם שמידע כמותי על עדינים חלבונים שינויי עמותה בתנאים פיסיולוגיים צריכה להימדד.

פרופיל רדיאלי ההפצה של חומרי ניקוי מיצלות C14SB ב 50 מ&quot;מ טריס, 100 מ&quot;מ NaCl pH 7.3 צורות מעריכי מאוד רדודים שיכול להיות מצויד למודל ליניארי (איור 7 א). השיפוע של הפצה זו קשור ביחס הפוך לריכוז D 2 O (איור 7). הנקודה שבה השיפוע הוא אפס, כלומר, D ההתאמה 2 O ריכוז, נמצאה כי 32.3%. ראה איור 7 להלן. <p class="jove_content" s...

שיווי משקל שקיעה (SE) יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בסביבה פיזיולוגית. כתב יד זה מתאר את השימוש בטכניקה זו כדי לקבוע את השפעת ה-pH על היציבות של הומו-פנטמר שנוצר על ידי החלבון ההידרופובי הקטן (SH) המקודד על ידי נגיף הנשימה הסינציאלי האנושי (hRSV).

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את גודלו של האוליגומר הנוצר על ידי פוליפפטיד הידרופובי קטן בדטרגנט C 14 sulfalane ואת יציבותו של אוליגומר זה כאשר ה-pH משתנה. דבר זה מושג ראשית על ידי קביעת ריכוז הדאוטריום אוקסיד התואם את צפיפות תאי הדטרגנט, ובכך מבטל את הציפה שלהם. כשלב שני, תבוצע סדרה של ניסויי שיווי משקל של שקיעה עבור דגימות החלבון ההידרופובי הקטן שהומסו.ב-C 14 sulfalane detergent מריצים את התהליך עם ריכוז ה-deter oxide שנקבע. לאחר מכן, חוזרים על השלבים הראשון והשני ב-pH שונה כדי להשוות את פרופיל השקיעה של החלבון בערכי pH שונים אלה. התוצאות יראו הן את הגודל האוליגומרי של החלבון ההידרופובי הקטן בדטרגנט זה והן את השפעת ה-pH על יציבות האוליגומר ב-C 14 sulf beane detergent.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כיוון שישנם מספר שלבים הכרוכים בה, כגון הרכבה והטענת תאים, התאמת צפיפות והגעה לתנאי שיווי משקל, ודברים אלו עלולים להכביד ולבלבל משתמשים בפעם הראשונה. כל טעות קטנה בשלבים אלו עלולה לבזבז פוטנציאלית מספר ימים של זמן ניסויי. הפרוצדורה תודגם על ידי סוריה, סטודנטית לדוקטורט במעבדה שלי.ראשית, הכין באפר 10x ודטרגנט 50x. סנן כל אחד ממיהולי המלאי של הבאפר 10x והדטרגנט 50x בסטריליזציה באמצעות מסנן מזרק של 0.2 micrometer אל תוך מבחנה של 1.5 milliliter. הכן 200 microliters של שלושה תמיסות דגימה נפרדות המכילות 10%, 30% ו-50% דאוטריום אוקסיד לפי נפח.להרכבת תא סינון אולטרה-אנליטי בעל שישה ערוצים ללא מילוי חיצוני, מקמו את אטם החלון במחזיק החלון, כופפו מעט את תומך החלון והניחו אותו במחזיק החלון כך שייווצר מרווח מול מחזיק החלון. לאחר מכן, מקמו חלון ספיר בתוך תומך החלון, כאשר הסימון מיושר עם מחזיק החלון. הניחו את בית התא עם מספר החלק הפוך, כך שהחריצים יהיו בקו אחד עם מפתח המארז.החליקו פנימה אל תוך בית התא מרכזייה בעלת שישה מגזרים עם דפנות משופעות, ולאחריה מכלול חלון אחד כאשר החלון פונה כלפי מטה. לאחר מכן, מרחו שכבה דקה של חומר סיכה לציפוי סבב (spin coat lubricant) על הברגיה של טבעת ההברגה ועל שייבת טבעת ההברגה. הניחו שייבת טבעת הברגה מעל מכלול החלון. התקינו את טבעת ההברגה בתוך בית החלון כאשר המילה "out" פונה החוצה, והדקו את טבעת ההברגה ידנית באמצעות כלי ליישור התא.לאחר מכן, הדק את טבעת הבורג ל-60 inch pounds בלבד באמצעות מפתח מומנט. לאחר מכן, מקם תא עם מספר החלק הרלוונטי במצב אנכי ובמיקום של השעה 12. טען 120 µL של תמיסת ייחוס לשורות השמאליות ו-110 µL של תמיסת דגימה לשורות הימניות.השתמשו בפיפט של 200 microliter תוך הקפדה על התאמה נכונה של כל דגימה לרפרנס. החליקו יחידת חלון אחת אל תוך בית התא כאשר החלון פונה כלפי מטה, וזרירות שלא להזיז את התא יתר על המידה שמא תישפך תכולתו. חזרו על השלבים הקודמים, והדקו את טבעת הברגה השנייה ל-120 inch pounds.לאחר מכן הפוך את התא והדק שוב את טבעת הבורג הראשונה ל-120 inch pounds. טען את התאים לתוך הרוטור. התקן את הרוטור בצנטריפוגה, והתקן את המונוכרומטור בהתאם להוראות היצרן.לאחר שהושג ואקום מספיק, הפעילו את הצנטריפוגה במהירות של 3000 RPM. בחנו את תבנית ההתאבכות בתוכנת ממשק המשתמש וכווןנו את פרמטרי הלייזר כדי להשיג את הניגודיות הגבוהה ביותר. לאחר מכן, צרו קובץ הגדרה חדש, תוך הגדרה של מדידת שיווי משקל והתאבכות.הגדירו שיטה של שיווי משקל שקיעה להפעלה ב-45,000 סיבובים לדקה או במהירות הגבוהה ביותר הצפויה עבור דגימות חלבון, בטמפרטורת הרצה של 20 °C. לאחר איסוף סריקה אחת, בצעו סריקה בכל 15 דקות למשך 12 שעות לפחות. עקבו אחר התקדמות שיווי המשקל על ידי פתיחת קובצי הנתונים ב-hetero analysis ובחירה ב-match function. בנקודה זו, הרכיבו תא אולטרה-צנטריפוגה אנליטית בעל שישה תעלולים עם חלונות קוורץ באופן דומה לנדון קודם לכן.בעזרת טיפים לטעינת ג'ל, טען את דגימת החלבון ההידרופובי הקטן בריכוז הגבוה ביותר שהוכנה קודם לכן בערוץ הקרוב ביותר למרכז הרוטור, ואת הדגימה בריכוז הנמוך ביותר בערוץ הרחוק ביותר ממרכז הרוטור. להגדרת מדידת הבליעה, צור קובץ הגדרות חדש המגדיר שיווי משקל ומדידת בליעה. הגדר 280 nanometers כאורך הגל של הגלאי.לאחר מכן, בצע כיול רדיאלי במהירות של 3000 RPM על ידי סימון "radial calibration before first scan" תחת אפשרויות הסריקה (scan options). הגדר איסוף נתונים ברזולוציה נמוכה ובצע סריקה בודדת. עם השלמת הסריקה, הסר את הסימון מהאפשרות.הגדירו שיטת שיווי משקל של שיקוע להפעלה במהירות הראשונה שחושבה בעבר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, ואספו סריקה אחת בכל 30 דקות בפירוט של כל תא. הגדירו איסוף נתונים ברזולוציה נמוכה לאחר 18 שעות לפחות. עקבו אחר התקדמות שיווי המשקל על ידי פתיחת קובצי הנתונים בניתוח הטרוגני (hetero analysis) ובחירה בפונקציית התאמה (match function) ברגע שהושג שיווי משקל.בצע סריקה בודדת ברזולוציה גבוהה לאחר השלמת הסריקה. חזור על השלבים הקודמים עבור המהירות הבאה כאשר זמן ההגעה לשיווי המשקל עבור כל מהירות ידוע. הגדר את הסריקה בשיטת שיווי משקל השקיעה כך שתכלול את כל המהירויות שחושבו קודם לכן, ובצע סריקה אחת לאחר זמן השיווי משקל עבור כל מהירות.במקרה זה, הגדירו איסוף נתונים ברזולוציה גבוהה בכל תא. פירוט ההתפלגות הרדיאלית של דטרגנט C 14 sultan בתאים שלי, ובבופר פוספט סודיום 50 mM ב-pH 7.3, יוצר אקספוננציאל רדוד מאוד שניתן להתאימו למודל ליניארי. השיפוע של פרופיל זה תלוי בריכוז הדאוטריום אוקסיד, והריכוז שהניב שיפוע אפס נמצא כ-32.3%. אותו ניסוי חזר עבור pH 5.5 ו-pH 3 כדי לקבל ריכוזי דאוטריום אוקסיד תואמים של 30.3% ו-41% בהתאמה.ב-pH 7.3, נמצא כי החלבון ההידרופובי הקטן והדטרגנט יוצרים פנטמרים עם לוגריתם גלוי של קבוע זיקה של 21.05. קבוע האסוציאציה לא השתנה ב-pH 5.5, אך הוא פחת משמעותית ב-pH 3. ממצא זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים שהראו ירידה במוליכות ב-pH נמוך יותר עם PK של בערך 4.5.ברגע ששולטים בהרכבת תא בשיווי משקל, ניתן לבצע את הטעינה ואת הגדרת הניסוי בתוך שעה אחת, אם הדבר נעשה כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של אופן הכנת ניסוי של שיווי משקל של שקיעה, כך שתוכלו לקבוע את הגודל האוליגומרי של חלבון הממברנה שלכם וכן להשוות את היציבות שלו ותנאי ניסוי שונים.

sedimentation-equilibrium-small-oligomer-forming-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

מאמר זה לפרטים וידאו הליך ניסיוני להשגת אנרגיה חופשית של גיבס קיפול חלבונים על ידי קרום טריפטופן פלואורסצנטי.

תרמודינמיקה של קיפול חלבונים ממברנה נמדד על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה

הליך יעיל להעריך את הנטייה oligomerization יחיד לעבור תחומים הטרנסממברני (TMDS) מתואר. חלבונים כימרי המורכב TMD התמזגו ToxR באים לידי ביטוי למתח כתב החיידק. TMD-Induced oligomerization גורם dimerization של ToxR, הפעלת שעתוק וייצור חלבונים הכתב,-galactosidase.

דומיין הטרנסממברני Oligomerization הנטייה נקבע על ידי Assay ToxR

קונפורמציה בחלבון ודינמיקה הן מפתח להבנת הקשר בין מבנה חלבון ותפקודו. חילופי מימן יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה הוא שיטה תכליתית כדי ללמוד את הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים כמו גם באפיון אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים, כוללים ממשקי מגע ואפקטי allosteric.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

ערוצים להובלה של מולקולות מים באנזימים להשפיע solvation אתר פעיל וקטליזה. במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול להנדסה של מוטיבים אלה נוספים קטליטי המבוססים על מודלים במחשב סיליקון וניסויים. זה ישפר את ההבנה של ההשפעה של דינמיקת ממס על קטליזה אנזימנו.

האצת entropic דרג להתיר מושרה על ידי Dynamics מרכך בממברנה אנזימים

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג דגם ברזולוציה נמוכה ab initio ופרטים מבנית של חלבון הממברנה solubilized-חומרי ניקוי בתמיסה באמצעות פיזור ניוטרון זווית קטנה עם התאמת ניגודיות של הנוזל.

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

פרוטוקול מוצג כדי לבדוק במהירות את יציבות תרמית של חלבונים במגוון תנאי באמצעות shift תרמי מבחני וננו דיפרנציאלית סריקה fluorimetry. הכוללת שלושה ייחודי יציבות מסכי, הם לבדיקה מאגר מערכות, מלחים, תוספים, יחד עם חלבונים כדי לזהות מאגרים מתאימים עבור לימודי המבנית תפקודית.

איך לייצב את חלבון: מסכי יציבות תרמית משמרת מבחני ו ננו דיפרנציאלית סריקה Fluorimetry בפרוייקט וירוס-X

פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד את המעבר dimer-dodecamer של TmPep1050, M42 aminopeptidase, ברמה המבנית. זהו צינור פשוט החל מטיהור חלבונים לעיבוד נתוני רנטגן. Crystallogenesis, אינדקס סט נתונים, והחלפה מולקולרית הודגמו באמצעות מקרה של מחקר, TmPep1050H60A H307A משתנה.

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

חקור שקיעת שיווי משקל לחקר יציבות אוליגומרים של חלבון ממברנה הקטן מנגיף hRSV. השיטה מאפשרת לקבוע גודל הפנטמר ולהעריך את השפעת pH על היציבות במערכת ביולוגית.

שקיעת שיווי משקל של חלבון ממברנה הקטן oligomer יוצרי: אפקט של היסטידין protonation על pentameric יציבות

גלה סרטונים נוספים