שקיעת שיווי משקל של חלבון ממברנה הקטן oligomer יוצרי: אפקט של היסטידין protonation על pentameric יציבות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע את גודל האוליגו שנוצר על ידי פוליפפטיד הידרופובי קטן בחומר ניקוי C 14 סולפאלן ואת היציבות של אולייר זה כאשר ה-pH משתנה. זה מושג תחילה על ידי קביעה איזה ריכוז תחמוצת דאוטריום תואם את צפיפות תאי הדטרגנט שלי, ובכך מנטרל את הציפה שלהם. כשלב שני, קבוצה של ניסויי שיווי משקל משקעים עבור דגימות החלבון ההידרופוביות הקטנות המומסות.

ב-C 14 חומר ניקוי סולפאלן מופעל עם ריכוז תחמוצת ההרתעה. לאחר מכן, השלב הראשון והשני חוזרים על עצמם ב-pH שונה על מנת להשוות את פרופיל השיקוע של החלבון בערכי ה-pH השונים הללו. התוצאות יראו הן את הגודל האוליגומרי של החלבון ההידרופובי הקטן בחומר ניקוי זה והן את השפעת ה-pH על יציבות האוליגו הזה בחומר ניקוי שעועית C 14 סולף.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שישנם מספר שלבים מעורבים כמו הרכבה וטעינה של התאמת צפיפות התאים והגעה לתנאי שיווי משקל, וזה יכול בקלות להציף ולבלבל משתמשים בפעם הראשונה. כל טעות קטנה בשלבים אלה עלולה לבזבז מספר ימים של זמן ניסוי. ההליך יודגם על ידי סוריה, דוקטורנטית במעבדה שלי.

ראשית, הכינו 10 x buffer ו-50 x חומר ניקוי. תמיסות מלאי ומסנן מעקרים כל אחד דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר לתוך עינור של 1.5 מיליליטר מתמיסות מלאי חומרי הניקוי של 10 x ו-50 x חומרי ניקוי. הכן 200 מיקרוליטר של שלוש תמיסות דגימה נפרדות המכילות 10%30% ו-50% תחמוצת דאוטריום בנפח.

כדי להרכיב תא אולטרה פיקציה אנליטי של שישה ערוצים ללא מילוי חיצוני, הנח את אטם החלון לתוך מחזיק החלון, כופף מעט את תוחם החלון והנח אותו במחזיק החלון כך שייווצר הפער מול מחזיק החלון. לאחר מכן Keyway הנח חלון ספיר בתוך תוחם החלון, ויישר את הסימן עם מחזיק החלון. מקום מפתח למכירת דיור עם מספר חלק הפוך עם מפתחות המפתחות בקו אחד עם מפתח הדיור.

החלק חלק מרכזי של שישה סקטורים עם הצד המשופע כלפי מטה לתוך בית התא ואחריו מכלול חלון אחד עם חלון הפונה כלפי מטה לאחר מכן מצפים קלות את חוטי טבעת הבורג ואת מכונת הכביסה של טבעת הברגים בחומר סיכה של מעיל ספין. הנח מכונת כביסה טבעת בורג על גבי מכלול החלון. התקן את טבעת הבורג לתוך בית החלון כשהמילה פונה החוצה ביד הדק את טבעת הבורג באמצעות כלי יישור התאים.

לאחר מכן הדק את טבעת הבורג ל-60 אינץ' פאונד בלבד באמצעות מפתח המומנט. לאחר מכן מקם תא עם מספר החלק זקוף וממוקם בשעה 12 בצהריים. טען 120 מיקרוליטר של תמיסת ייחוס לשורות השמאליות ו -110 מיקרוליטר של תמיסת דגימה לשורות הימניות.

שימוש בפיפטה של 200 מיקרוליטר המבטיחה שכל דגימה והפניה מותאמים כהלכה בזהירות. החלק מכלול חלון אחד כשהחלון פונה כלפי מטה לתוך בית התא, הקפד לא להפריע לתא יתר על המידה מכיוון שהדבר עלול לשפוך את תכולתו. חזור על השלבים הקודמים, הדק את טבעת הבורג השנייה ל-120 אינץ' פאונד.

לאחר מכן הפוך את התא והדק מחדש את טבעת הבורג הראשונה ל-120 אינץ' פאונד. טען את התאים לתוך הרוטור. התקן את הרוטור בצנטריפוגה, והתקן את המונוכרומטי בהתאם להוראות היצרן.

לאחר שהושג ואקום מספיק, הפעל את הצנטריפוגה ב-3000 סל"ד. תצוגה מקדימה של דפוס ההפרעות בתוכנת ממשק המשתמש והתאם את פרמטרי הלייזר כדי להשיג את הניגודיות הגבוהה ביותר. לאחר מכן, צור קובץ התקנה חדש, המציין מדידת שיווי משקל והפרעות.

הגדר שיטת שיווי משקל שקיעה שתפעל במהירות של 45,000 סיבובים לדקה או המהירות הגבוהה ביותר הצפויה עבור דגימות חלבון עם טמפרטורת ריצה של 20 מעלות צלזיוס לאחר איסוף אחת, סרוק כל 15 דקות למשך 12 שעות לפחות. עקוב אחר התקדמות שיווי המשקל על ידי פתיחת קבצי הנתונים בניתוח הטרו ובחירת פונקציית התאמה. בשלב זה, הרכיבו תא אולטרה-צנטריפוגה אנליטי בעל שישה ערוצים עם חלונות קוורץ באותו אופן כמו קודם.

בעזרת טיפים לטעינת ג'ל, טען את דגימת החלבון ההידרופובי הקטנה בריכוז הגבוה ביותר שהוכנה בעבר בתעלה הקרובה ביותר למרכז הרוטור, ואת הדגימה בריכוז הנמוך ביותר הרחוק ביותר ממרכז הרוטור. לקביעת מדידת הספיגה, צרו קובץ קביעות חדש המציין מדידת שיווי משקל וספיגה. ציין 280 ננומטר כאורך הגל של הגלאי.

לאחר מכן, בצע כיול רדיאלי ב-3000 סל"ד על ידי בדיקת כיול רדיאלי לפני אפשרויות הסריקה והסריקה הראשונות. ציון איסוף נתונים ברזולוציה נמוכה וביצוע סריקה בודדת. לאחר השלמת הסריקה, בטל את הסימון באפשרות.

הגדר שיטת שיווי משקל שקיעה שתפעל במהירות הראשונה שחושבה בעבר ב-20 מעלות צלזיוס ואסוף סריקה אחת כל 30 דקות בפרטי כל תא. ציין איסוף נתונים ברזולוציה נמוכה לאחר 18 שעות לפחות. עקוב אחר התקדמות שיווי המשקל על ידי פתיחת קבצי הנתונים בניתוח הטרו ובחירת פונקציית התאמה לאחר הגעה לשיווי משקל.

אסוף סריקה בודדת ברזולוציה גבוהה לאחר השלמת הסריקה. חזור על השלבים הקודמים למהירות הבאה כאשר הזמן הנדרש כדי להגיע לשיווי משקל עבור כל מהירות ידוע. הגדר את שיטת שיווי המשקל של המשקעים סריקה כך שתכלול את כל המהירויות שחושבו בעבר ולאסוף סריקה אחת לאחר זמן שיווי המשקל עבור כל מהירות.

במקרה זה, ציין איסוף נתונים ברזולוציה גבוהה בפירוט של כל תא את ההתפלגות הרדיאלית של C 14 סולטן דטרגנט את התאים שלי, ומאגר נתרן פוספט 50 מולארי. pH 7.3 יוצר אקספוננציאלי רדוד מאוד שניתן להתאים למודל ליניארי. השיפוע של פרופיל זה תלוי בריכוז תחמוצת הדאוטריום והריכוז שייצר שיפוע אפס נמצא כ-32.3%אותו ניסוי חזר על עצמו עבור pH 5.5 ו-pH 3 כדי להשיג ריכוזי תחמוצת דאוטריום תואמים של 30.3% ו-41% בהתאמה.

ב-pH 7.3, נמצא כי החלבון ההידרופובי הקטן וחומר הניקוי יוצרים פנטמרים עם לוגריתם לכאורה של קבוע הזיקה של 21.05. קבוע האסוציאציה לא השתנה ב-pH 5.5, אך הוא הופחת משמעותית ב-pH 3. זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים שהראו ירידה במוליכות ב-pH נמוך יותר עם PK של כ-4.5.

לאחר שליטה בהרכבת תאי שיווי משקל, ניתן לבצע טעינה והגדרת ניסוי תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל להבין היטב כיצד להכין ניסוי שיווי משקל משקע כך שתוכל לקבוע את הגודל האולימטי של חלבון הממברנה שלך וגם להשוות את היציבות ותנאי הניסוי השונים שלהם.