Name: גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: למדו שיטת אופטוגנטיקה להערכת יצירת קשרים סינפטיים בין נוירונים שמקורם בתאי גזע iPSCs לנוירונים קורטיקליים ראשוניים. שיטה זו מאפשרת חקר חיבורים פונקציונליים ברשתות עצביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ק דייזרות &#39;וס&#39; Je למבני lentiviral ChR2 וSynapsin1-tdTomato בהתאמה, ג חי לשיתוף מומחיות ופרוטוקול על דור iPSC, WY Leong לקבלת תמיכה טכנית, אנשי המעבדה Goh לחומרים כימיים שיתוף ומומחיות. עבודה זו נתמכה על ידי אבוט תזונה והמרכז האקדמי של אקסלנס (ACE) הפרס מחקר מGlaxoSmithKline (GSK) לElg, על ידי קרן המחקר הלאומית סינגפור במסגרת תכנית המחקר התחרותית שלה (NRF 2,008 NRF-CRP 002-082) לElg ו GJA, ועל ידי World Class המכון (WCI) התכנית של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) ממומנת על ידי משרד חינוך, מדע והטכנולוגיה של קוריאה (MEST) (NRF גרנט מספר: WCI 2,009-003) לGJA

<ol><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Stroh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+stem+cell+differentiation+in+the+setting+of+automated+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation.</a> Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).</li>
<li>Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+adopt+and+regulate+the+activity+of+an+established+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).</li>
<li>Viviani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+coculture+of+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and coculture of neurons and glial cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).</li>
<li>Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+of+human+iPS-cells+in+a+rat+cortical+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiologiae+Experimentalis%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).</li>
<li>Shivaraj, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taurine+induces+proliferation+of+neural+stem+cells+and+synapse+development+in+the+developing+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain.</a> PLoS ONE. 7, e42935(2012).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li>
<li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Optogenetics מספק דיוק של זמן ומרחב להפעלה של אוכלוסיות מוגדרות של נוירונים 13. בניסויים שלנו, את כל השדה של המטרה מיקרוסקופ היה מואר למשך 30 שניות לנוירונים בקליפת המוח רק צילום לעורר להביע ChR2. זה אפשר לנו לקבוע אם קשרים סינפטיים נוצרו בין אוכלוסיות השונות של תאי עצב בשיתוף התרבות. התוצאות שלנו גילו כי photostimulation מגביר תדירות PSC בנוירונים נגזרים iPSC, שמוכיח כי תאי העצב האלה לקבל קלט סינפטי מנוירונים בקליפת המוח presynaptic להביע ChR2. זה, בתורו, קבע כי נוירונים נגזרים iPSC שולבו בהצלחה במעגלים עם נוירונים בקליפת המוח. ישנם מספר צעדים קריטיים עבור הדור של מערכת שיתוף תרבות זו. חשוב לוודא שתרבויות astrocyte נגזרים NPC העכבר בריאים, עם מותם של תאים מינימאליים, לפני שתמשיך עם ציפוישל סוגי תאים אחרים. נוירונים בקליפת המוח וNPCs האנושי לצרף גם על האסטרוציטים בריאים וקלטות אלקטרו תלויות במידה רבה בתנאי תרבות. הצעדים המרכזיים האחרים בפרוטוקול זה הם electroporation וציפוי של תאי עצב בקליפת המוח על תרבויות astrocyte. כמספר גדול של תאים מתים לאחר electroporation, חשוב להבטיח כי לפחות 6 מיליון תאי עצב בקליפת המוח הם electroporated לציפוי על תרבויות astrocyte בצלחות 24 גם. ראינו כי כאשר פחות מ -6 מיליון תאים electroporated, מספר הנוירונים ששרדו לא יוצר רשת עצבית צפופה, שהשפיעה על קלטות אלקטרו. מספר תאי העצב בקליפת המוח electroporated צריך גם להיות עקבי עבור כל ניסוי שיתוף תרבות כדי לאפשר השוואה בין מחקרים שונים. לכל השלבים כרוכים בעיכול אנזימטי, זה חיוני שלא לעזוב את התאים בתמיסת עיכול במשך זמן רב מדי מכיוון שהוא עלול להוביל למוות של תאים. זהגישה יכולה לשמש מסך היכולת של תאי עצב שמקורם fibroblasts מטופל ספציפי ליצירת קשרים סינפטיים עם תאי עצב אחרים. נוירונים נגזרים מfibroblasts מחולים הסובלים מהפרעת נוירו-התפתחות תסמונת רט (RTT) תערוכת פגמי שידור סינפטי: תאי עצב RTT להציג ירידה משמעותית בתדירות ומשרעת PSC בהשוואה לנוירונים בריאים, ככל הנראה בשל פחות קישוריות הסינפטי 14. מערכת שיתוף התרבות שלנו מאפשרת בדיקה של שפעות תרופה על תאי עצב בו מוצגות פגמים התפתחותיים. זה יכול להתבצע באמצעות תוספת של תרכובות של ריבית במהלך הזריעה של NPCs אדם החולה, כמו גם במהלך חשיפה ממושכת לתרכובות בכל עת ההבחנה עצבית. בעוד מערכת שיתוף תרבות זו יכולה לשמש גם כמודל לבדיקות סמים, הגבלה בגישה זו היא שהתהליך של לחקור את ההשפעות של כל מתחם מועמד יכול להיות ארוך ומייגע כזה לא שיטת הקרנת תפוקה גבוהה. בעקבות טיפול עם תרכובות מועמד, הנוירונים נגזרים iPSC צריכים להיות תוקנו בנפרד כדי לקבוע את ההשפעות של כל מתחם על PSCs. יתר על כן, יש כיום לא רב fibroblasts זמין וiPSCs מחולים. לכן, זה יהיה העניין בעתיד הקרוב לתאים חולים יותר וגם כדי להתאים פרוטוקול זה להקרנת תפוקה גבוהה. לדוגמא, על ידי תיוג נוירונים נגזרים iPSC עם מחוון פעילות, כגון חיישנים גנטי מקודדים של יונים או פוטנציאל הממברנה, אפשר יהיה להגביר את קצב התפוקה באופן משמעותי על ידי הליך אלקטרו זמן רב דריכה בצד. ככל התהליך של יצירת מערכת שיתוף תרבות זו, מתכנות מחדש fibroblasts לביצוע הקלטות אלקטרו, דורש יותר מ -90 ימים, מומלץ שיורחב גם iPSCs או NPCs האדם, לאחר תכנות מחדש וצעדי אינדוקציה עצביים בהתאמה,וcryopreserved כדי לצמצם את הזמן דרוש לניסויים עתידיים. בניסויים שלנו, אנו הביעו ChR2 בנוירונים בקליפת המוח תחת אמרגן synapsin1. בגלל אמרגן זה פאן-עצבי, אנחנו כנראה היו photostimulating שני תאי עצב בקליפת המוח מעכבים ומעוררים. אם המטרה של ניסויים עתידיים היא לחקור את אופן ספציפי מעגלים או מעכבים או מעוררים, יכולים לשמש יזמים ספציפיים יותר. לחלופין, ניתן היו להשיג נוירונים בקליפת המוח ממהונדס (או מוזרק וירוס עכברים) שבו ביטוי ChR2 הוא ממוקד במיוחד לאוכלוסיות גנטית מוגדרות של תאי עצב. לדוגמא, רקמות קליפת המוח קציר מעכבר שיש recombinase Cre באו לידי ביטוי בinterneurons המכיל parvalbumin (interneurons PV) שהוא חצה עם עכבר עם ChR2 floxed יניב מצב שבו נוירונים בקליפת המוח רק להביע ChR2 יהיו interneurons PV 15. השימוש בChR2 להביע interneurons בנו שיתוף מ&quot;ק כזהמערכת lture תאפשר הקביעה אם נוירון נגזר iPSC שתוקנה הוא מסוגל לשלב במעגל עם interneurons PV. בהתבסס על מחקר קודם 9, נוירונים בקליפת המוח הם בוגרים עם חופף דנדריטים לאחר 14 ימים במבחנה. לכן, אם photostimulation לא לעורר תגובה מתא עצב נגזר iPSC טלאים, זה צריך להצביע על כך שתא העצב אין לו את היכולת ליצור קשרים סינפטיים עם תאי עצב בקליפת המוח. נוירון נגזר iPSC יכול לקבל קלט סינפטי או מתא עצב או נוירונים בקליפת המוח נגזר iPSC אחרים. אם הקלטות מהדק תיקון מסורתי שמשו, זה יהיה לא ניתן להבחין בו קלט סינפטי הוא בא. היתרון של המערכת שלנו הוא שתגובות postsynaptic מקלט סינפטי קליפת המוח יכולות להיות עורר באופן סלקטיבי וזיהו. הנהלים המתוארים כאן מספקים גישה פשוטה כדי להעריך את היכולת של הנוירונים נגזרים iPSC לשלבלרשת עצבית מוגדרת.

בשנים האחרונות, ההבנה של נוירון ותפקוד מעגל העצבי שלנו כבר מהפכה ידי מספר כלים optogenetic השולטים רגישות עצבית. כלי אחד כזה הוא ערוץ קטיון מופעל אור, channelrhodopsin-2 (ChR2): תאי עצב המבטאים פוטנציאל פעולת אש ChR2 בתגובה לגירוי אור 1-3. מכיוון שתאי עצב אינם בדרך כלל רגישים לאור, יכולת המופלאה זה פותחת אפיקים חדשים לשליטה של זמן ומרחב המדויק של הפעילות של אוכלוסיות גנטית מוגדרות של נוירונים 4 והואצה מחקרים של תפקוד המוח מאוד. ChR2 הוחל על תא גזע מחקר למטרות שונות, ממעקב אחר ההתפתחות עצבית 5 להסדרת פעילות של רשתות עצביות 6. כאן השתמשנו ChR2 להגדיל את התועלת של מערכת שיתוף תרבות עצבית. מערכות שיתוף התרבות לאפשר ההערכה של יחסי גומלין בין תאים מסוגים שונים.שיתוף תרבויות של תאי עצב וגליה, סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים, משמשים בדרך כלל כדי לחקור איתות בין סוגי התאים השונים הללו, כמו גם כדי להעריך את המשמעות של זה איתות לתגובות פיסיולוגיות, התפשטות של נזק ולבחון את מנגנונים מולקולריים הפוטנציאליים מעורבים בזה איתות 7. מחקר קודם גילה כי iPSCs האנושי להבחין מהר מאוד לתאי עצב בנוכחות של תאי עצב בקליפת המוח חולדה עיקרי תרבות המכילה, האסטרוציטים, oligodendrocytes, ומיקרוגליה 8. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים שיטה שמנצלת ChR2 במערכת שיתוף תרבות לחקור את קשרים סינפטיים בין תאי עצב בקליפת המוח חולדה ותאי עצב שמקורם בתאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (iPSCs). אנו מתארים את שלבים לנתח ורקמות מוח קציר 9, כמו גם לשמור ולבדל את תאים עצביים עכבר (NPCs) להאסטרוציטים וNPCs אדם intנוירונים o ליצור מערכת שיתוף התרבות. להקים מערכת שיתוף תרבות זו, השתמשנו בשיטת תכנות מחדש ללא אינטגרציה שתוארה על ידי אל Okita et. 10 כדי ליצור iPSCs האנושי. iPSCs אלה אז נבדל ביעילות לתוך NPCs בתנאים כימי מוגדרים באמצעות מעכבי מולקולה קטנה כפי שתוארה על ידי et al לי. 11 בשיתוף התרבויות, אוכלוסיות השונות של תאי עצב יכולות להיות מזוהות באמצעות זיהוי של ביטוי ChR2 בנוירונים בקליפת המוח ותיוג של נוירונים נגזרים iPSC באמצעות חלבון הניאון, בד בבד דימר העגבניות (tdTomato). שילוב קלטות אלקטרו מהנוירונים נגזרים iPSC עם photostimulation optogenetic של נוירונים בקליפת המוח מאפשר הערכה של היכולת של שני סוגים של תאי עצב כדי ליצור מעגלים אחד עם השני. באופן ספציפי, photostimulation של ChR2 להביע תאי עצב בקליפת המוח לעורר תגובות הסינפטי בנוירונים נגזרים iPSC שיצרו מעגלים הסינפטיעם רשת נוירון בקליפת המוח photostimulated. אנו מראים כי זרמי postsynaptic מוגברים אכן זוהו בתאי עצב שמקורם בiPSC בתנאים כאלה. פרוטוקול זה מאפשר ההערכה של מעגלים הסינפטי תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי, כוללים סיכום של דגמי מחלה נוירולוגית שונים באמצעות iPSCs נגזר מfibroblasts מחולי מחלה.

<table><tbody><tr><td>ערכת התפשטות Neurocult (עכבר)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>מכילה מדיום בסיסי NSC ותוסף התפשטות NSC</td></tr><tr><td>Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירו-בזאלי</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>MEM ללא גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Human LIF Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>מו"פ D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>דרגת מחקר FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>למדיום התמיינות אסטרוציטים</td></tr><tr><td>מוגדר FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>למדיום נוירון ראשוני</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270</td><td>למדיום נוירון ראשוני</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>EMD Millipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>פפאין</td><td>וורת'ינגטון</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>עבור קצירת מוחות</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; מסננת תאים</td><td>m BD Biosciences&nbsp; &nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 ומיקרו; m יחידת מסנן</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>למחקרים אלקטרופיזיולוגיים</td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>למחקרים אלקטרופיזיולוגיים</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>World precision instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352096 צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות צלחות</td><td>קורנינג</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות</td> צלוחיות <td>קורנינג</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25</td> משקפי כיסוי <td>קורנינג</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 מ"מ</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA ערכת נוקלאופקטור נוירון חולדה נ.ב.פ;</td><td>לונזה</td><td>VPG1003</td><td>לאלקטרופורציה של נוירונים ראשוניים בקליפת המוח</td></tr><tr><td>מערכת טרנספקציה ניאון&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>לאלקטרופורציה של פיברובלסטים אנושיים</td></tr><tr><td>מיני אנליזה&nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>למדידת PSCs</td></tr><tr><td>פיברובלסטים אנושיים עוריים רגילים</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>מנורת קשת קצרה</td><td>כספית OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת co-תרבות

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת קו-תרבית המורכבת מ-2 אוכלוסיות עצביות שונות. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מתוכנתים מחדש מפיברובלסטים אנושיים באמצעות וקטורים אפיזומליים. ניתן לצפות במושבות של iPSCs 30 יום לאחר התחלת תכנות מחדש של פיברובלסטים. מושבות פלוריפוטנטיות נקטפות באופן ידני ומגודלות במדיום אינדוקציה עצבית כדי לאפשר התמיינות לתאי אב עצביים (NPCs). iPSCs הופכים במהירות לתאים נוירו-אפיתל תוך שבוע אחד ושומרים על היכולת להתחדש בעצמם כאשר הם נשמרים בצפיפות תרבית גבוהה. NPCs ראשוניים של עכברים מובחנים לאסטרוציטים על ידי חשיפה למדיום המכיל סרום למשך 7 ימים ויוצרים שכבה חד-שכבתית שעליה מתווספים נוירונים עובריים בקליפת המוח של חולדה ביום 18 (E18) (שהועברו עם channelrhodopsin-2 (ChR2)). NPCs אנושיים המתויגים עם החלבון הפלואורסצנטי, עגבנייה טנדם דימר (tdTomato), נזרעים לאחר מכן לתרבית הנוירונים האסטרוציטים/קליפת המוח למחרת ומאפשרים להם להתמיין במשך 28 עד 35 ימים. אנו מדגימים כי מערכת זו יוצרת קשרים סינפטיים בין נוירונים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים בקליפת המוח, הניכר בעלייה בתדירות הזרמים הסינפטיים בעת גירוי פוטו של הנוירונים בקליפת המוח. מערכת קו-תרבית זו מספקת פלטפורמה חדשה להערכת היכולת של נוירונים שמקורם ב-iPSC ליצור קשרים סינפטיים עם אוכלוסיות עצביות אחרות.

כאן, פרוטוקול המתאר את השלבים המרובים מעורבים ביצירת התרבות משותפת מורכבות האסטרוציטים, נוירונים בקליפת המוח ותאי עצב אנושיים באו לידי ביטוי. iPSCs אדם התקבלו על ידי תכנות מחדש fibroblasts באמצעות episomal וקטורי 10 וצוין לשושלת עצבית עם קוקטייל של מעכבי מולקולה קטנה, מה שהופך את NPCs 11 שנשמרו בצפיפות גבוהה (איור 1 א). כמה צעדים נדרשים כדי ליצור התרבות המשותפת: בידול של NPCs עכבר להאסטרוציטים, ציפוי של תאי עצב בקליפת המוח חולדה להביע ChR2, וזריעה של NPCs אדם מתויג עם tdTomato (איור 1). ביום 2 של בידול, חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) + האסטרוציטים יכול בקלות להיות שנצפו בתרבויות שלנו (איור 1 ג). עכבר NPCs הורשו להבחין במשך שבוע לפחות לפני ציפוי נוירונים בקליפת המוח להביע ChR2 על monolayer astrocyte (1D איור). לאחר 3עד 4 שבועות של בידול NPC האנושי, תאי עצב tdTomato + התגלו בתרבויות (איור 1E). מערכת שיתוף התרבות זו מאפשרת זיהוי עקבי של זרמי postsynaptic מהנוירונים נגזרים iPSC בודדים בתגובה לגירוי אור (איור 2 א). כאשר מגורה על ידי אור, פוטנציאל פעולה נוצרו בתאי עצב בקליפת המוח להביע ChR2 (איור 2). הנגזר iPSC נוירונים גם להתרגש (איור 2 ג), מראה ירי פוטנציאל פעולה מוגבר כהמשרעת של depolarizing פולסים נוכחי הוגדל (איור 2 ד). כך, תאים אלה תערוכת תכונות עצביות בוגרות. בהעדר האור, תאי עצב נגזר iPSC קיבלו תשומות ספונטניות הסינפטי (איור 2E). זרמים פנימה postsynaptic אלה בתיווך בעיקר על ידי קולטני AMPA, כי זרמים דרך קולטני GABA יהיו כלפי חוץ וקולטני NMDA לא לשאת נוכחיt פוטנציאל החזקת -70 mV. לפחות חלק מהתשומות אלה היו מנוירונים בקליפת המוח presynaptic להביע ChR2, כי גירוי אור הגביר את התדירות של זרמי postsynaptic (איור 2E) באופן משמעותי. כמובן של גידול זה בקלט סינפטי הזמן מוצג באיור 2F: photostimulation של נוירונים בקליפת המוח שספג לאורך כל הבזק אור ארוך 30 שניות. בעוד התדירות של PSCs הייתה גבוהה כאשר תאי עצב בקליפת המוח להביע ChR2 היה photostimulated (איור 2G), משרעת שלהם לא נפגע (איור 2H). לסיכום, תוצאות אלו מצביעות על כך שתאי העצב נגזר iPSC הציגו תכונות עצביות בוגרות ויכולים ליצור קשרים סינפטיים עם תאי עצב בקליפת המוח presynaptic. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> איור 1: תרשים סכמטי עבור הדור של תרבות המשותפתציר זמן מערכת. (א) לתכנות מחדש fibroblasts האנושי לiPSCs ואינדוקציה עצבית לNPCs. ציר זמן (B) לבידול מסוף של NPCs האנושי לתאים בוגרים בתרבויות נוירון וastrocyte קליפת המוח. (C) העכבר NPCs להבחין במהירות לתוך GFAP + האסטרוציטים אחרי 2 ימים במבחנה. (ד &#39;) לאחר שבוע אחד, נוירונים בקליפת המוח להביע ChR2 היו מצופים על האסטרוציטים GFAP +. (E) בשעת 4 עד 5 שבועות לאחר ההתמיינות של NPCs האנושי, קלטות אלקטרו בוצעו על tdTomato + נוירונים. ברים סולם מייצגים 100 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> איור 2: ניתוח optogenetic של קישוריות הסינפטי פונקציונלית. נגזר iPSC () תאים מתויגים עם tdTomato (אדום) היו שיתוף תרבותיים עם נוירונים בקליפת המוח המבטאים את האור מופעל-ערוץ, ChR2 (ירוק). הקלטות מתא העצב נגזר iPSC חשפו תגובות postsynaptic הנוכחיות (PSC), שיכול לבוא משני נוירונים בקליפת המוח או נוירונים נגזרים iPSC אחרים. (ב) תאורה (פס כחול) עוררה שורה של פוטנציאל פעולה בתאי עצב בקליפת המוח להביע ChR2. ( נגזרים תאי iPSC C) הם עוררו על ידי הזרקה נוכחית. (ירי D) לעומת עקומה הנוכחית של נגזרים תאי iPSC. (E) photostimulation של נוירונים בקליפת המוח ChR2 להביע (פס כחול) הגבירו את התדירות של PSCs בנוירונים נגזרים iPSC . כמובן (F) זמן של העלייה בתדירות PSC המיוצרת על ידי photostimulation. בר כחול מציין זמן של photostimulation. (G, H) בעוד תדירות PSC הוגדלה על ידי photostimulation (G), משרעת PSC לא נפגע (H). * מציין p &lt;0.05 לעומת שליטה במבחן t.

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבסס מערכת של תרבית משותפת להערכת היכולת של נוירונים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם ליצור קשרים תפקודיים, תוך שימוש בגישה גנית המבוססת על גירוי פוטוני של נוירונים בתרבית באמצעות channel RUSIN two או CR two. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד של תאי אב עצביים ראשוניים של עכבר (NPCs), ומעבר לשלב של התמיינותם לאסטרוציטים. לאחר מכן, נוירונים קורטיקליים ראשוניים של חולדה עוברים טרנספקציה עם CH R two ונזרעים על שכבת האסטרוציטים, המשמשת כאוכלוסייה הנוירונלית הקיימת.לאחר מכן, תאי NPC אנושיים שהופקו מתרביות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSC) עוברים טרנסדוקציה עם נגיף synapsin one 2D tomato, затем מושתלים על תרבית של אסטרוציטים ונוירונים ומושרוים להבדיל, ובכך יוצרים קשרים סינפטיים. התוצאות מראים כי הנוירונים שהופקו מ-iPSC יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירונים קורטיקליים של חולדה, בהתבסס על רישומים אלקטרופיזיולוגיים של זרמים פוסט-סינפטיים בנוירונים שהופקו מ-iPSC בעקבות גרייה פוטונית גנית של הנוירונים הקורטיקליים המבטאים CHR2. היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלו המשלבות תרבית של אסטרוציטים בלבד עם נוירונים אנושיים שהופקו מ-iPSC, הוא שזמן הבשלות של נוירונים אנושיים אלה קצר יותר.זאת מכיוון שנוכחותם של נוירונים ראשוניים יכולה להאיץ את הבשלת הנוירונים האנושיים הללו. את הפרוצדורה ידגימו Uni Chin, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי, ו-suing Y מהמעבדה של George Augustine. לאחר קצירת מוחות של חולדות עובריות ובידוד הרקמה הקורטיקלית בהתאם לפרוטוקול הטקסט, העבירו את הרקמות הקורטיקליות לצלחית המכילה תמיסה לעיכול רקמה קורטיקלית שחוממה מראש. קצצו את הרקמות הקורטיקליות לדגימות קטנות ככל האפשר לפני הדגרה ב-37 °C למשך 30 דקות. לאחר ההדגרה, העבירו את הרקמות הקורטיקליות לשפופרת צנטריפוגה של 50 milliliter, ובצעו דיסוציאציה לרקמות באמצעות פיפטה סרולוגית עד לקבלת תמיסה הומוגנית ללא חתיכות רקמה.העבירו את תמיסת הרקמה דרך מסננת תאים של 70 micron כדי לסנן גושי רקמה שנותרו. העבירו מנות של 3 mL מהתמיסה למבחנות צנטריפוגה של 15 mL.הוסף 800 µL של 7.5% BSA ב-XPBS לתחתית כל מבחנה, כך שייווצר שכבה מתחת לשכבת הרקמה, וסבב בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון (supernatant) על ידי שאיבה מממשק השכבות. הימנע מהפרעה למשקע התאי בתחתית המבחנה.לאחר שימוש ב-1 ml של מצע עבור נוירונים ראשוניים כדי להמיס מחדש כל משקע תאים, שלבו את כולם בשפופרת צנטריפוגה של 15 ml. לאחר מכן, השתמשו ב-hemocytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים. צנטריפוגו 6 מיליון נוירונים קורטיקליים של חולדה ב-200 Gs למשך חמש דקות, והסירו את הנוזל העליון (supernatant).דרושים לפחות 6 מיליון נוירונים קורטיקליים לצורך אלקטרופורציה. כדי להבטיח את היווצרותו של רשת נוירונלית על ידי הנוירונים השורדים, יש להוסיף 100 µL של תמיסת אלקטרופורציה למשקע התאים ולערבב בעדינות עד להשעיה מחדש. לאחר מכן, יש לערבב 100 µL מתשלול התאים עם 6 µg של פלסמיד CR two ולהעביר את התערובת לכלי מותאם.בחר והחל את התוכנית המתאימה לאלקטרופורציה בהתאם להוראות היצרן. לאחר האלקטרופורציה, הוסף 500 microliters של MEM לכלי. העבר את התאים ל-11.5 milliliters של מצע נוירונים ראשוני, ובצע רספנסיה עדינה.לאחר מכן, הוסיפו 500 µL לכל באער של פלטה בעלת 24 באערים המכילה אסטרוציטים של עכבר. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. לאחר יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs), השרו ותחזקו את התאים כתרבית של תאי אב עצביים אנושיים (NPCs) בהתאם לפרוטוקול הכתוב.בדוגמה זו, ה-NPCs מסומנים באמצעות הווקטור הלנטיבירי synapse in one TD tomato ביום שלאחר הוספת נוירונים ראשוניים לתרבית אסטרוציטים. השתמש ב-XPBS לשטיפה חד-פעמית של ה-NPCs האנושיים, לאחר מכן הוסף תמיסה לניתוק תאים והדגר למשך חמש דקות ב-30 °C. ודא שכל התאים ניתקו.לאחר מכן, העבירו אותם למבחנה של 15 milliliters המכילה כמות כפולה של D-M-E-M-F 12 וסבבו בצנטריפוגה ב-200 G למשך חמש דקות. הסירו את העלייה (supernatant) והשתמשו במדיום לדיפרנציאציה עצבית כדי לתוחב בעדינות את המשקע לתאים בודדים. השתמשו בהמוציטומטר לספירת התאים.בשלב הבא, שאבו בזהירות את המצע מתוך פלטת תרביות הנוירונים הקורטיקליים והאסטרוציטים. העבירו את ה-NPCs האנושיים בריכוז של 5,000 תאים לסנטימטר רבוע לבאר אל תוך מצע דיפרנציאציה נוירונלית. דגרו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2, והחליפו את המצע מדי יומיים או שלושה למשך 28 ימים לפחות.כדי לאשר אם IPCs אנושיים מתנהגים כנוירונים בוגרים, השתמש במיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בעדשת טבילה במים 60x כדי לאתר תאים שהבדילו מ-IPCs אנושיים. בצע ויזואליזציה של TD tomato. משוך פיפטת הקלטה להתנגדות של ארבעה עד שישה ohm perfuse.את התאים השאירו בטמפרטורת החדר בתוך תמיסה חיצונית המאווררת באופן קבוע עם 95% oxygen ו-5% carbon dioxide. השתמשו בתמיסה פנימית למילוי מיקרו-פיפט ההקלטה, בצעו patch לתא עגבנייה TD חיובי במצב whole cell והקליטו פריקה של פוטנציאל פעולה בתגובה להזרקת זרם ב-current clamp. זאת כדי לאשש כי פוטנציאל הפעולה של תאי קורטקס המבטאים CHR two מעורר באופן מהימן על ידי גרייה של אור.ראשית, אתר תאי קליפה המבטאים CR שני באמצעות ויזואליזציה של GFP תחת הארה באור של מנורת קשת כספית, תוך שימוש במסנן עירור באורך גל של 480/40 ננומטר. ודא כי פוטנציאל פעולה מעורר באופן מהימן באמצעות רישום current clamp במצב whole cell. כדי לבצע גירוי גני, בצע patch לתא חיובי ל-TD tomato במצב whole cell והגדר את ה-voltage clamp ל-70- מיליוולט תחת מנורת כספית המאירה את כל השדה ובעזרת מסנן עירור של 480/40.גרה את השדה כולו למשך 30 שניות. רשום זרמים פוסט-סינפטיים או PSCs של תא שעבר patched, אשר הושרו על ידי גירוי פוטוני של נוירונים קורטיקליים פרה-סינפטיים המבטאים CHR2. הגדר את הסף לאמפליטודה ולשטח הזרמים ל-5 pA ו-5 pA·s בהתאמה; בצע בדיקה ידנית של אירועים אלו כדי לפסול עקומות שאינן PSCs.כפי שהודגם בסרטון זה, נדרשים מספר שלבים כדי להפיק תרבית משותפת (co-culture) של נוירונים המופקים מ-IPCs, נוירונים קורטיקליים ראשוניים ואסטרוציטים. תמונה זו מראה כי ביום השני של התמיינות NPCs של עכבר לאסטרוציטים, ניתן להבחין בקלות באסטרוציטים חיוביים לחלבון חומצה גליאלית פיברילית או GFAP. ל-NPCs של עכבר הותר להתמיין במשך שבוע אחד לפחות לפני זריעת נוירונים קורטיקליים, המבטאים CR two, על השכבה החד-שכבתית של האסטרוציטים, ושניהם מזוהים בתרבית משותפת זו באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית של GFAP ו-CHR two.לאחר שלושה עד ארבעה שבועות של בידול תאי NPC אנושיים, זוהו בתרביות נוירונים חיוביים ל-TD tomato כפי שמוצג כאן. כאשר עוררו באמצעות אור, נוצרו פוטנציאלי פעולה בנוירונים קורטיקליים המבטאים CHR two IPSC. נוירונים נגזרים הם גם הם בעלי יכולת עירור, ומראים פעילות מוגברת.פוטנציאל פעולה ככל שהגבירה את האמפליטודה של פולסי זרם דפולריזציה. בהיעדר אור, נוירונים שנגזרו מ-IPSC קיבלו קלטים סינפטיים ספונטניים. זרמים פוסט-סינפטיים פנימיים אלו תווכו בעיקר על ידי רספטורי AMPA.סטימולציה פוטו-אופטית של הנוירונים הקורטיקליים נשמרה לאורך הבזק האור הארוך ה-32, בעוד שתדירות ה-PSCs עלתה. כאשר נוירונים קורטיקליים המבטאים CHR two עברו סטימולציה פוטו-אופטית, האמפליטודה שלהם לא הושפעה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש במערכות קו-קלטורה אחרות עם סוגי תאים שונים הספציפיים למטופל, וזאת במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון השפעת תרכובות של תרופות מועמדות על מחלות ספציפיות הרלוונטיות למחקר.

an-optogenetic-approach-for-assessing-formation-neuronal-connections

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פיתחנו רומן רב תא שיתוף תרבות נוירון פלטפורמה עבור microsystem ב CNS מחקר במבחנה אינטראקציה האקסון, גליה. פלטפורמה המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל היה מפוברק באמצעות פיתח מאקרו / מיקרו שיטת ייצור כלאיים.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

סרטון זה מדגים שיטה להתמיין תאי אב עצביים אנושיים (NPCs) לנוירונים. ה-NPCs מוכנסים לתרבית משותפת של נוירונים קורטיקליים אסטרוציטים-חולדות בעכברים, ומקדמים התמיינות NPC לנוירונים. ההתמיינות מאושרת על ידי הדמיה של התאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

טכניקת תרבית משותפת להבחנה של תאי אב עצביים אנושיים לתאי עצב

סרטון זה מדגים את הקמתה של תרבית משותפת של תאי עצב המושרים על ידי בני אדם (iNs) ותאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים מושרים (iOPCs). iNs מעורבבים עם iOPCs בתרבית משותפת ולאחר מכן מודגרים כדי לתמוך בהבשלה של iNs לנוירונים ו- iOPCs לאוליגודנדרוציטים. תאי עצב יוצרים קשרים סינפטיים עם תאי עצב ואוליגודנדרוציטים אחרים, בעוד שאוליגודנדרוציטים מפתחים מעטה מיאלין סביב אקסוני הנוירונים.

שיטת תרבית משותפת למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

הסרטון מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית להערכת קשרים עצביים בין נוירונים קליפת המוח שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים בקליפת המוח של חולדות, ומאשר מגעים סינפטיים בתרבית המשותפת על ידי הפעלת תעלות יונים רגישות לאור וזיהוי זרמים פוסט-סינפטיים.

הערכת היווצרות קשרים עצביים בתרבות משותפת באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים

פרוטוקולים לעריכה אחת נוירון microfluidic ומיסוך מים לדפוסי פלזמה בשבב של ציפויים ביולוגי מתוארים. ניתן להכין שיתוף תרבויות מקושרות ביותר באמצעות תשומות תא מינימליות.

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד

המנגנונים המולקולריים הלתאם את ההיווצרות של סינפסות GABAergic המעכבת במהלך ontogeny אינם ידועים. ללמוד את התהליכים האלה, שפיתחנו מערכת מודל שיתוף תרבות אשר משלבת נוירונים GABAergic הקוצנית בינונית עובריים בתרבית יחד עם תאי הכליה עוברית אנושית 293 (HEK293) transfected ביציבות להביע קולטני GABA פונקציונלי.

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA רצפטורים

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה סימולטני של thalamocortical האקסון מסעף סינפסה היווצרות של organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח. Thalamocortical בודדים אקסונים ומסופי presynaptic שלהם הם דמיינו ידי טכניקה אלקטרופורציה תא בודד עם DsRed ו מתויג GFP synaptophysin.

ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

למדו שיטת אופטוגנטיקה להערכת יצירת קשרים סינפטיים בין נוירונים שמקורם בתאי גזע iPSCs לנוירונים קורטיקליים ראשוניים. שיטה זו מאפשרת חקר חיבורים פונקציונליים ברשתות עצביות.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

גלה סרטונים נוספים