גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבסס מערכת של תרבית משותפת להערכת היכולת של נוירונים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם ליצור קשרים תפקודיים, תוך שימוש בגישה גנית המבוססת על גירוי פוטוני של נוירונים בתרבית באמצעות channel RUSIN two או CR two. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד של תאי אב עצביים ראשוניים של עכבר (NPCs), ומעבר לשלב של התמיינותם לאסטרוציטים. לאחר מכן, נוירונים קורטיקליים ראשוניים של חולדה עוברים טרנספקציה עם CH R two ונזרעים על שכבת האסטרוציטים, המשמשת כאוכלוסייה הנוירונלית הקיימת.

לאחר מכן, תאי NPC אנושיים שהופקו מתרביות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSC) עוברים טרנסדוקציה עם נגיף synapsin one 2D tomato, затем מושתלים על תרבית של אסטרוציטים ונוירונים ומושרוים להבדיל, ובכך יוצרים קשרים סינפטיים. התוצאות מראים כי הנוירונים שהופקו מ-iPSC יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירונים קורטיקליים של חולדה, בהתבסס על רישומים אלקטרופיזיולוגיים של זרמים פוסט-סינפטיים בנוירונים שהופקו מ-iPSC בעקבות גרייה פוטונית גנית של הנוירונים הקורטיקליים המבטאים CHR2. היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלו המשלבות תרבית של אסטרוציטים בלבד עם נוירונים אנושיים שהופקו מ-iPSC, הוא שזמן הבשלות של נוירונים אנושיים אלה קצר יותר.

זאת מכיוון שנוכחותם של נוירונים ראשוניים יכולה להאיץ את הבשלת הנוירונים האנושיים הללו. את הפרוצדורה ידגימו Uni Chin, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי, ו-suing Y מהמעבדה של George Augustine. לאחר קצירת מוחות של חולדות עובריות ובידוד הרקמה הקורטיקלית בהתאם לפרוטוקול הטקסט, העבירו את הרקמות הקורטיקליות לצלחית המכילה תמיסה לעיכול רקמה קורטיקלית שחוממה מראש. קצצו את הרקמות הקורטיקליות לדגימות קטנות ככל האפשר לפני הדגרה ב-37 °C למשך 30 דקות. לאחר ההדגרה, העבירו את הרקמות הקורטיקליות לשפופרת צנטריפוגה של 50 milliliter, ובצעו דיסוציאציה לרקמות באמצעות פיפטה סרולוגית עד לקבלת תמיסה הומוגנית ללא חתיכות רקמה.

העבירו את תמיסת הרקמה דרך מסננת תאים של 70 micron כדי לסנן גושי רקמה שנותרו. העבירו מנות של 3 mL מהתמיסה למבחנות צנטריפוגה של 15 mL.

הוסף 800 µL של 7.5% BSA ב-XPBS לתחתית כל מבחנה, כך שייווצר שכבה מתחת לשכבת הרקמה, וסבב בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון (supernatant) על ידי שאיבה מממשק השכבות. הימנע מהפרעה למשקע התאי בתחתית המבחנה.

לאחר שימוש ב-1 ml של מצע עבור נוירונים ראשוניים כדי להמיס מחדש כל משקע תאים, שלבו את כולם בשפופרת צנטריפוגה של 15 ml. לאחר מכן, השתמשו ב-hemocytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים. צנטריפוגו 6 מיליון נוירונים קורטיקליים של חולדה ב-200 Gs למשך חמש דקות, והסירו את הנוזל העליון (supernatant).

דרושים לפחות 6 מיליון נוירונים קורטיקליים לצורך אלקטרופורציה. כדי להבטיח את היווצרותו של רשת נוירונלית על ידי הנוירונים השורדים, יש להוסיף 100 µL של תמיסת אלקטרופורציה למשקע התאים ולערבב בעדינות עד להשעיה מחדש. לאחר מכן, יש לערבב 100 µL מתשלול התאים עם 6 µg של פלסמיד CR two ולהעביר את התערובת לכלי מותאם.

בחר והחל את התוכנית המתאימה לאלקטרופורציה בהתאם להוראות היצרן. לאחר האלקטרופורציה, הוסף 500 microliters של MEM לכלי. העבר את התאים ל-11.5 milliliters של מצע נוירונים ראשוני, ובצע רספנסיה עדינה.

לאחר מכן, הוסיפו 500 µL לכל באער של פלטה בעלת 24 באערים המכילה אסטרוציטים של עכבר. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. לאחר יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs), השרו ותחזקו את התאים כתרבית של תאי אב עצביים אנושיים (NPCs) בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

בדוגמה זו, ה-NPCs מסומנים באמצעות הווקטור הלנטיבירי synapse in one TD tomato ביום שלאחר הוספת נוירונים ראשוניים לתרבית אסטרוציטים. השתמש ב-XPBS לשטיפה חד-פעמית של ה-NPCs האנושיים, לאחר מכן הוסף תמיסה לניתוק תאים והדגר למשך חמש דקות ב-30 °C. ודא שכל התאים ניתקו.

לאחר מכן, העבירו אותם למבחנה של 15 milliliters המכילה כמות כפולה של D-M-E-M-F 12 וסבבו בצנטריפוגה ב-200 G למשך חמש דקות. הסירו את העלייה (supernatant) והשתמשו במדיום לדיפרנציאציה עצבית כדי לתוחב בעדינות את המשקע לתאים בודדים. השתמשו בהמוציטומטר לספירת התאים.

בשלב הבא, שאבו בזהירות את המצע מתוך פלטת תרביות הנוירונים הקורטיקליים והאסטרוציטים. העבירו את ה-NPCs האנושיים בריכוז של 5,000 תאים לסנטימטר רבוע לבאר אל תוך מצע דיפרנציאציה נוירונלית. דגרו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2, והחליפו את המצע מדי יומיים או שלושה למשך 28 ימים לפחות.

כדי לאשר אם IPCs אנושיים מתנהגים כנוירונים בוגרים, השתמש במיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בעדשת טבילה במים 60x כדי לאתר תאים שהבדילו מ-IPCs אנושיים. בצע ויזואליזציה של TD tomato. משוך פיפטת הקלטה להתנגדות של ארבעה עד שישה ohm perfuse.

את התאים השאירו בטמפרטורת החדר בתוך תמיסה חיצונית המאווררת באופן קבוע עם 95% oxygen ו-5% carbon dioxide. השתמשו בתמיסה פנימית למילוי מיקרו-פיפט ההקלטה, בצעו patch לתא עגבנייה TD חיובי במצב whole cell והקליטו פריקה של פוטנציאל פעולה בתגובה להזרקת זרם ב-current clamp. זאת כדי לאשש כי פוטנציאל הפעולה של תאי קורטקס המבטאים CHR two מעורר באופן מהימן על ידי גרייה של אור.

ראשית, אתר תאי קליפה המבטאים CR שני באמצעות ויזואליזציה של GFP תחת הארה באור של מנורת קשת כספית, תוך שימוש במסנן עירור באורך גל של 480/40 ננומטר. ודא כי פוטנציאל פעולה מעורר באופן מהימן באמצעות רישום current clamp במצב whole cell. כדי לבצע גירוי גני, בצע patch לתא חיובי ל-TD tomato במצב whole cell והגדר את ה-voltage clamp ל-70- מיליוולט תחת מנורת כספית המאירה את כל השדה ובעזרת מסנן עירור של 480/40.

גרה את השדה כולו למשך 30 שניות. רשום זרמים פוסט-סינפטיים או PSCs של תא שעבר patched, אשר הושרו על ידי גירוי פוטוני של נוירונים קורטיקליים פרה-סינפטיים המבטאים CHR2. הגדר את הסף לאמפליטודה ולשטח הזרמים ל-5 pA ו-5 pA·s בהתאמה; בצע בדיקה ידנית של אירועים אלו כדי לפסול עקומות שאינן PSCs.

כפי שהודגם בסרטון זה, נדרשים מספר שלבים כדי להפיק תרבית משותפת (co-culture) של נוירונים המופקים מ-IPCs, נוירונים קורטיקליים ראשוניים ואסטרוציטים. תמונה זו מראה כי ביום השני של התמיינות NPCs של עכבר לאסטרוציטים, ניתן להבחין בקלות באסטרוציטים חיוביים לחלבון חומצה גליאלית פיברילית או GFAP. ל-NPCs של עכבר הותר להתמיין במשך שבוע אחד לפחות לפני זריעת נוירונים קורטיקליים, המבטאים CR two, על השכבה החד-שכבתית של האסטרוציטים, ושניהם מזוהים בתרבית משותפת זו באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית של GFAP ו-CHR two.

לאחר שלושה עד ארבעה שבועות של בידול תאי NPC אנושיים, זוהו בתרביות נוירונים חיוביים ל-TD tomato כפי שמוצג כאן. כאשר עוררו באמצעות אור, נוצרו פוטנציאלי פעולה בנוירונים קורטיקליים המבטאים CHR two IPSC. נוירונים נגזרים הם גם הם בעלי יכולת עירור, ומראים פעילות מוגברת.

פוטנציאל פעולה ככל שהגבירה את האמפליטודה של פולסי זרם דפולריזציה. בהיעדר אור, נוירונים שנגזרו מ-IPSC קיבלו קלטים סינפטיים ספונטניים. זרמים פוסט-סינפטיים פנימיים אלו תווכו בעיקר על ידי רספטורי AMPA.

סטימולציה פוטו-אופטית של הנוירונים הקורטיקליים נשמרה לאורך הבזק האור הארוך ה-32, בעוד שתדירות ה-PSCs עלתה. כאשר נוירונים קורטיקליים המבטאים CHR two עברו סטימולציה פוטו-אופטית, האמפליטודה שלהם לא הושפעה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש במערכות קו-קלטורה אחרות עם סוגי תאים שונים הספציפיים למטופל, וזאת במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון השפעת תרכובות של תרופות מועמדות על מחלות ספציפיות הרלוונטיות למחקר.