Name: רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למד שיטה לגידול נגיפי שפעת A בכמות גדולה ובטיטר גבוה באמצעות ביצי עוף מופרות. השיטה כוללת הדבקה דרך חלל האלנטואיד והקפאה מהירה בחנקן נוזלי לצורך מחקר ופיתוח חיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר הנוכחי נתמך על ידי מענקי ה-NIH HL120947 (PC), HL103868 (PC) ומענק הסיוע של איגוד הלב האמריקאי (PC).

הערה: הערות כלליות: בצע את כל הנהלים הקשורים מניפולציה של הביצה בתנאים סטריליים, ויש להשתמש בי טכניקה סטרילית בהתאם. טרום נקי כל הציוד עם אתנול 70% לפני השימוש. באופן כללי, חיסון נגיף שפעת וקציר צריכים להתנהל במעבדה BSL-2. עם זאת, אם פרוטוקול זה משמש כדי להפיץ הרבה יותר פתוגניים נגיפי שפעת (למשל, זני מגיפה ומראש מגיפה, זנים שמהווים סכנה לעופות ובעלי חיים, זני שפעת עופות אלימים במיוחד, זן H1N1 1918), רמות בטיחות ביולוגיות גבוהות ו בחלק ממקרים, אמצעי זהירות ביטחון ביולוגי ואישורים נדרשים. ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית המקומית צריכה לאשר את כל המחקר מעורב נגיף שפעת. 1. הכנת הביצים להרכבת חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ביצי עופות לפתוגן חופשי (SPF) טרי מופרה סרום מספק מתאים. בדרך כלל, ביצי תרנגולת משמשות. ביצים צריכה להיות לנוed מייד עם הגעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ביצי מקום הגעה בחממה ביצת humidified עם טרנר ביצה אוטומטי כדי לסובב ביצים באופן קבוע. אם טרנר ביצה אוטומטי אינו זמין, לסובב ידני ביצים לפחות 2-3 פעמים ביום (הקפד ללבוש כפפות ולשמור הכל כסטרילי ככל האפשר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצים על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 55-60 ל10-11 ימים. </li></ol> Candling 2. ביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קנדלר ביצה לבחון את הביצה נגד אור בהיר בחדר חשוך כדי לבדוק ביצים לבעיות פוריות בcandling לאחר כ -7 או 8 ימים של דגירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את קנדלר הביצה עם אתנול 70%. לשנות כפפות לעתים קרובות ולחטא עם אתנול 70% כדי לצמצם את הסיכון לזיהום על ידי פתוגנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הביצים מן החממה ולמקם אותם בקרטונים ביצים ריקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות בחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקצה הרחב של כל ביצה אחת בכל פעם נגד קנדלר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לביצה לdeterminדואר אם זה פורה או לא פורה. הערה: כלי דם דקים מובילים לעובר בצורת שעועית צריכה להיות ברור לעין. ביצים מופרה תופיע ככתם דם קטן עם חלמון ביצת עין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך ביצים כי הם מופרה, ולהחזיר את ביצי קיימא לחממה. אל תשאיר ביצים מחוץ לחממה עבור יותר מ -30 דקות. אם המצב של ביצה לא ניתן לאשר, לסמן אותו, ולבחון אותו מאוחר יותר. </li></ol> 3. הכנת הבידוד וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מניות וירוס שפעת לכ 10 מרס - 10 אפריל pfu / מיליליטר PBS סטרילי המכיל 10 מ&quot;מ HEPES (pH 7.4). צעד קריטי: לדלל את מניות הווירוס מייד לפני השימוש ולשמור את הווירוס בדילול מלא על קרח כל הזמן. </li></ol> 4. הרכבת חיסון שפעת וירוס דרך כביש allantoic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של חיסון וירוס (יום 10 או 11), נר הביצים שוב ולחסל את כל עוברים מתים. להבחין עוברים חיים על ידימחפש תנועה בתוך הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שלוש ביצים מן החממה, ולסדר את הביצים בבעל נפרד עם שק האוויר למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את המרחב האווירי של הביצים עם סמן קבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את קליפת הביצה מעל המרחב האווירי עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הביצים עם החלל עד האוויר בקרטון ביצים ולמכסת מנוע בטיחות ביולוגי (BSL-2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט 18G סטרילי אגרוף חור קטן בקליפה מעל שק האוויר של כל ביצה. היזהר שלא להכניס את המחט עמוקה מדי, כדי למנוע דקירת העובר או חלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את נגיף השפעת המדולל לתוך מזרק 1 מיליליטר סטרילי ולצרף מחט 22g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדם בזהירות את המזרק עם מחט בזווית של 45 מעלות לתוך חלל allantoic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 0.2 מיליליטר של נגיף שפעת בדילול מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הזריקה עם שתי ביצים האחרות, ואז להשליך את המזרק ומחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החור עם ירידה של דבק מאקדח דבק (או שעוות פרפין נמס). Bדואר זהיר כי דבק לא ידלוף בתוך הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצים בחזרה לתוך חממת הביצה עם המרחב האווירי הצביע כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.2-4.12 עד שכל הביצים כבר מחוסנת. </li></ol> 5. דגירה זמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הביצים נגועות מבלי להפוך על 37 מעלות צלזיוס ולחות ~ 60%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זמן דגירה אופטימלי בהתאם לסוג וירוס שפעת. דגירה שפעת במשך 48 שעות; דגירה השפעת B ו- C למשך 72 שעות. </li></ol> 6. וירוס שפעת קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה, לצנן את הביצים על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 4 שעות (או O / N) כדי להרוג את העובר ולהצר את כלי הדם כדי להפחית את הסיכון של זיהום נוזל allantoic הנגוע בדם. לעשות את זה כדי למנוע את תאי דם האדומים מפני ספיגת הווירוס, אשר מפחית את התשואה. לחלופין, ביצי צינה למשך 30 דקות ב -20 ° C; אולם זה מגביר את הסיכון לזיהום בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הביצים היו מספיק קרות, להעביר את הביצים למכסת מנוע בטיחות ביולוגית. מניחים את הביצה לתוך בעל משרד עם שק האוויר פונה כלפי מעלה. נקה את משטח הביצה עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי סטרילי כדי לפתוח את קליפת הביצה מעל שק האוויר. הסר את הקליפה סביב שק האוויר והקפד לא להרוס את קרום chorioallantoic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קרום chorioallantoic עם מלקחיים בוטים סטרילי. בעדינות להזיז הצידה את העובר וצק החלמון עם מרית קטנה או כף. יש להיזהר שלא לקרוע את החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה Eppendorf 1 מיליליטר, לאסוף בזהירות את נוזל allantoic. במידת הצורך, להטות את הביצה קצת לצד כדי לאסוף כנוזל עד כמה שניתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את נוזל allantoic מכל הביצים לתוך צינור חרוטי פלסטיק 50 מיליליטר. שמרו צינורות על קרח בכל העת במהלך קציר וירוס. תשואות ביצה אחת 5 - 10 מיליליטר של נוזל צהבהב במקצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין נוזל allantoic המכיל וירוס XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 46; C עד גלולה פסולת. העבר את הנוזל השקוף לתוך צינור 50 מיליליטר חדש כל הזמן על קרח. השלך ביצים לתוך מיכל פסולת BSL-2. </li></ol> 7. חפצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד aliquot הנוזל הבהיר allantoic (למשל, 50, 100 או 500 aliquots ul) וsnap-הקפאה בחנקן נוזלי. העבר את מניות וירוס קפוא ל-80 ° C במקפיא לאחסון לטווח ארוך. </li></ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
<li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li>
<li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus%3A+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li>
<li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+and+the+challenge+for+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immu%22%5BJournal%5D)">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li>
<li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuing+challenges+in+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li>
<li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSzretter%2C+KJ+%22Current+protocols+in+microbiology%22">Current protocols in microbiology</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li>
<li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li>
<li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שפעת גורמת לניטל עולמי גדול של מחלה, ועבודה נמשכת להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות 7. למחקר הקל במחלה קטלנית, שיטות שונות פותחו כדי להפיץ את נגיף שפעת 6. כאן אנו מתארים טכניקה לייצר וירוס שפעת בביצי תרנגולת. היתרון של שיטה זו הוא שזה מאוד לשחזור ותוצאות בכמויות גדולות של מניות וירוס שפעת הגבוהה titer, שלעתים קרובות יש צורך במחקרים במבחנה. רוב המעבדות תהיה מסוגלים לפתח פרוטוקול זה במהיר...

השפעת ממשיך להיות איום גדול לבריאות אדם. זוהי מחלה בדרכי הנשימה שעלול להיות הרסנית עם נטל גלובלי גדול גורם עד 500,000 מקרי המוות בעולם בשנה 1. נגיפי שפעת נמצאים במשפחת Orthomyxoviridae ולבצע RNA חד-גדילי 8 תחושה שלילית בגנום שלהם 1,2. הניוון הגבוה (כלומר &quot;להיסחף&quot;, אנטיגני) של הגנום הנגיפי מונע חסינות לטווח ארוך. יתר על כן, השפעת היא עמידה יותר ויותר לתרופות אנטי-ויראליות 3. מגיפת שפעת שפעת H1N1 2009 הדגישה את כל הנושאים המאתגרים הקשורים למחלת שפעת (זן מגפה, התנגדות אנטי-נגיפית, ייצור חיסון מתעכב). ניסוח החיסון נקבע מדי שנה על ידי ארגון הבריאות העולמית לזני שפעת הסביר ביותר פתוגניים (אחד עבור כל H1N1, H3N2 ושפעת B) 4. מכיוון ששיטה זו מבוססת על זן שפעת חזהים, זנים פתוגניים מעת לעת באופן שגוי שזוהו ויעילות חיסון יורדת באופן דרמטי. יתר על כן, את המראה של זני שפעת רומן יכול לעקוף תוכניות המניעות אלה גורמים למחל מגיפת 2. יצירת חיסון נגד שפעת אוניברסלית כבר חמקמקה 5. לכן, מחקר חייב להמשיך להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות. למחקר במעבדה מתקן, במספר שיטות פותחו עבור בידוד וריבוי 6 ויראלי. יכולים להיות מוגברים נגיפי שפעת אנושיים במגוון רחב של מצעי תאים יונקים. עם זאת, וירוסים גבוה כייל יצירה בכמויות גדולות מושגות הטובות ביותר בביצי embryonated. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקה לשפעת התפשטות וירוס ואחסון ממניות וירוס קיימות.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום ללא פתוגן (SPF) ביצי עוף מופרות &nbsp;</td>חממת ביצים לחות <td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>דגם 2100</td><td></td></tr><tr><td>אוטומטי מסובב ביצים</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>דגם 3200</td><td></td></tr><tr><td>נר ביצים</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>דגם 3300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18 גרם מחט</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20 גרם / 22 גרם מחט</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>אתנול>99.5%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>459844 מדולל ל -70% באמצעות</td></tr><tr><td>אקדח דבק מים "Ad tech Hi Temp פרויקט פרו"</td><td>אד-טק, דבק טכנולוגיות בע"מ</td><td>דגם 1105</td><td></td></tr><tr><td>דבק "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>תאי MDCK</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>תאי דם אדומים של הודו שטופים, מעבדות ביולוגיות 10%</td> <td>Lampire</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

זיהום שפעת קשור על 36,000 מקרי מוות ויותר מ -200,000 אשפוזים מדי שנה בארצות הברית. הופעתה המתמשכת של זני נגיף שפעת חדשים עקב מוטציה ומחדש מבחר מסבכת את השליטה של ​​הנגיף ומחייבת פיתוח הקבוע של תרופות וחיסונים רומן. המחקר מבוסס המעבדה של שפעת דורש שיטה אמינה וחסכונית להתפשטות של הווירוס. כאן, פרוטוקול מקיף מסופק לשפעת התפשטות וירוס בביצי תרנגולת פורה, אשר מניבה באופן עקבי מניות נגיפיות גבוה כייל. בקיצור, ביצי סרום הפתוגן ללא (SPF) מופרה עוף טופחו על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 55-60 במשך 10 - 11 ימים. במהלך תקופה זו, פיתוח עובר יכול להיות במעקב בקלות באמצעות קנדלר ביצה. חיסון וירוס מתבצע על ידי הזרקה של מניות וירוס לתוך חלל allantoic באמצעות מחט. אחרי 2 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, הביציםמצונן לפחות 4 שעות על 4 מעלות צלזיוס. קליפת הביצה מעל שק האוויר וקרום chorioallantoic לאחר מכן פתחה בזהירות, ונוזל allantoic המכיל את הנגיף שנקטפו. הנוזל מנוקה מפסולת על ידי צנטריפוגה, aliquoted והועבר ל-80 ° C לאחסון לטווח ארוך. הכמות הגדולה (5-10 מיליליטר של נוזל לביצה המכיל וירוס) כייל נגיף וגבוה אשר בדרך כלל מושגת עם פרוטוקול זה הפכה את השימוש בביצים להכנת וירוס השיטה נוחה שלנו, בפרט ללימודים במבחנה הדורשים כמויות גדולות של וירוס שבמינונים גבוהים של אותו מניות הווירוס יש צורך.

מספר שיטות פותחו כדי כייל נגיף שפעת. שיקול אחד בעת בחירת שיטה מתאימה הוא שחלק לקבוע חלקיקים כולל, ללא קשר ליכולת קיום (למשל, assay hemagglutinin) ואילו אחרים מבוססים על infectivity, אשר יהיה להעריך virions קיימא (למשל, assay פלאק) 6. כאן, כייל הנגיף של נוזל allantoic נאסף מביצי תרנגולת מחוסנת עם נגיף שפעת מותאם עכבר (/ יחסי ציבור / 8/34) נקבע על ידי assay פלאק (איור 1) וassay hemagglutination (איור 2). <p class="jo...

ביצי תרנגולות פוריות נמצאות בשימוש נרחב לייצור כמויות גדולות של נגיף שפעת אנושי A מכיוון שהן מספקות מערכת נוחה וחסכונית להוכחת תשואות גבוהות של הנגיף.

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיק כמויות גדולות של נגיף שפעת בתיתר גבוה, במערכת חסכונית. הדבר מושג תחילה על ידי השגת ביצי תרנגולת שהופרו לאחרונה והן נקיות מפתוגנים בסרום. בשלב השני, הביצים מודבקות בנגיף השפעת באמצעות נתיב השורש של Alan Toic.במשך 48 שעות, נאסף נוזל ה-Alan Toic המכיל את הנגיף, ולאחר מכן הנגיף מוקפא בהקפאה מהירה (snap frozen) בחנקן נוזלי. לבסוף, ניתן לבצע בדיקות פלאק (plaque assay) ובדיקות המאגלוטינין כדי לקבוע את השפעת titer הנגיף של נוזל ה-Alan Toic שנאסף. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי האיסוף רגישים מאוד ודורשים טיפול זהיר בביצים והכרות טובה עם האנטומיה שלהן.לפני תחילת הפרוצדורה, השג ביצים של עופות המופרות טרי, נקיות מפתוגנים של סרום, מספק מתאים. מיד עם הגעתן, הנח את הביצים בדגירה עם לחות ומערכת סיבוב אוטומטית לסיבוב קבוע של הביצים בטמפרטורה של 37 °C ובלחות של 55% עד 60% למשך 10 עד 11 ימים. לאחר שבעה עד שמונה ימי דגירה, בעודך לובש כפפות שחוטרו ב-70% ethanol.נגבו פנס לבדיקת ביצים (egg candler) באתנול והעבירו את הביצים מהדגירה לתבניות ביצים ריקות. לאחר מכן, כבו את האורות והחזיקו את הקצה הרחב של הביצים, אחת אחת, כנגד הפנס. אם הביצה פורייה, כלי דם דקים המובילים לעובר בצורת שעועית אמורים להיות גלויים בבירור.אם הביצה אינה מופרית, תיראה נקודת דם קטנה עם חלמון גלוי. במקרה זה, יש להשליך את הביצים הבלתי מופריות ולהחזיר את הביצים החיוניות לאינקובטור. אם לא ניתן לאשר את מצבה של ביצה, סמנו אותה לתצפית מאוחרת יותר ביום ה-10 או ה-11 לאחר ההפריה, וממש לפני השימוש, דללו מלאי של נגיף influenza A לריכוז של 10³ עד 10⁴ PFU למלiliter ב-PBS סטרילי בתוספת HEPES והניחו אותו על קרח.לאחר מכן, בצעו שוב בדיקת תאורה (candling) לכל ביצה והסירו עוברים מתים שאינם נעים. בשלב הבא, הוציאו שלוש ביצים מהדגירה והניחו אותן במחזיק נפרד. כאשר שקי האוויר פונים כלפי מעלה, סמנו את מרחב האוויר של הביצים בעזרת טוש קבוע.לאחר מכן, שטפו את האזור שמעל לתאי האוויר ב-70% ethanol והעבירו את הביצים, כאשר תאי האוויר פונים כלפי מעלה, אל תבנית ביצים בתוך מנדף בטיחות ביולוגית ברמת BSL 2. כעת, השתמשו במחט סטרילית בכיול 18 gauge כדי ליצור חור קטן בקליפה מעל שקיק האוויר של כל ביצה. יש להיזהר לא להחדיר את המחט עמוק מדי כדי למנוע דקירה של העובר או החלמון.לאחר מכן, שאבו את נגיף השפעת המדולל לתוך מזרק סטרילי של one milliliter. חברו מחט במידה 22 gauge והחדירו אותה בזהירות בזווית של 45 מעלות אל תוך חלל ה-Alan Toic של הביצה הראשונה. מזריקו 0.2 milliliters של הנגיף המדולל לתוך הביצה, ולאחר ההזרקה לשתי הביצים הנוספות, השליכו את המזרק והמחט ואטמו כל חור באמצעות טיפת דבק מאקדח דבק.יש לוודא שהדבק אינו דולף לתוך הביצה, ולאחר מכן להחזיר את הביצים לדגירה. לאחר שכל הביצים הוחדרו, יש לדגור את הביצים הזיהומות בטמפרטורה של 37 °C ובלחות של 60% ללא סיבוב, למשך זמן הדגירה האופטימלי, בהתאם לסוג נגיף השפעת.בסיום תקופת הדגירה, קרירו את הביצים למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורה של 4 °C כדי להרוג את העובר ולהכווץ את כלי הדם. לאחר שהביצים קוררו מספיק, העבירו אותן למבתור בבטיחות ביולוגית ולמחזיק יציב, ונקו את פני השטח של הביצים באמצעות 70% ethanol.לאחר מכן, השתמש במספריים סטריליים כדי לפתוח את קליפת הביצה מעל שקיק האוויר של הביצה הראשונה. הסר את הקליפה מסביב לשקיק האוויר, תוך הקפדה לא לפגוע בממברנה החוריאלית.לאחר מכן, השתמש בפינצטה קהה סטרילית כדי לפתוח את קרום ה-chorioallantoic והרחק בעדינות את העובר ואת שק החלמון באמצעות שפכטל או כף קטנה, תוך הקפדה לא לקרוע את החלמון. לאחר מכן, באמצעות פיפטה של 1 mL, אסוף בזהירות את נוזל ה-allantoic, והטה את הביצה לצד כדי לאסוף כמה שיותר נוזל לפי הצורך. כל ביצה אמורה להניב בין 5 ל-10 mL של נוזל צהבהב מעט במהלך הקצירה.רכזו את נוזל ה-allantoic במבחנות פלסטיק קוניות של 50 milliliter על קרח. כאשר כל הנוזל נאסף, סובבו במצנטריפוגה להשקעת הווירוס והעבירו את הנוזל הצלול למבחנה חדשה של 50 milliliter על קרח. לבסוף, השליכו את הביצים למכל פסולת BSL 2 והשתמשו מיד בנוזל ה-allantoic המזוקק.לאחר מכן, קפיאו את הנגיף בהקפאה מהירה (snap-freeze) בחנקן נוזלי והניחו את המבחנות הקפואות במקפיא של 80- מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך, זיהום בנגיף השפעת גורם לאפקט ציטופתי המתבטא באזורים מעגליים של תאים שרוסקו או בלוחיות (plaques) הנוצרות על שכבה אחת של תאים (monolayer). בניסוי זה, הלוחיות הודגמו על ידי צביעת התאים ב-crystal violet, ו-65 לוחיות נספרו בבאר עם דילול של 10⁻¹² של הנגיף, מכיוון ש-500 µL של מלאי נגיפי מדולו תורבשו על התאים.בניסוי זה, הטיטר הסופי היה 1.3 × 10¹⁴ PFU למיליליטר. בדיקת המגלוטינין היא שיטה לטיטור של נגיף השפעת המבוססת על יכולתו של הנגיף להיקשר לפני השטח של תאי דם אדומים. כפי שנצפה, תרחיף הנגיף גורם להגלוטינציה של תאי הדם האדומים, ובכך מונע מהם לשקוע מתוך התרחיף.תוצאה שלילית ברורה נצפתה בדילול של 2⁻¹⁰ של הנגיף ב-50 µL. לפיכך, הטר המכניס סופי הוא 2.1 × 10⁴ HAU למילליליטר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הרביית נגיף השפעת על ידי הזרקה לביצי תרנגולת וקצירת הנוזל האלנטואי (allantoic fluid) המכיל את הנגיף.

influenza-virus-propagation-in-embryonated-chicken-eggs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הצלה של שפעת וירוסים מ-DNA פלסמיד היא טכניקה ניסויית בסיסי וחיוני המאפשר לחוקרים שפעת לייצר וירוסים רקומביננטי ללמוד היבטים מרובים הביולוגיה של נגיף השפעת, וכן לשמש וקטורים או חיסונים פוטנציאליים.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

במקביל זיהום בנגיף שפעת היא אחד הגורמים המעורבים אינדוקציה של המחלה pneumococcal פולשנית במהלך...

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת גרסאות מילוט של נוגדנים חד-שבטיים של נגיף השפעת המנטרל. תרחיף וירוס מנוטרל נוגדנים מוזרק לביצי תרנגולת עובריות כדי להפיץ גרסאות בריחה באופן סלקטיבי. התוצאה היא אוכלוסיית וירוסים בעיקר של וריאנטים בריחה, שאושרו באמצעות בדיקת Hemagglutination.

יצירת וריאנטים של הימלטות מנגיף השפעת מפני נוגדנים מנטרלים

הסרטון מציג שיטה ליצירת נגיפי שפעת רקומביננטיים מותאמים לקור. היא כרוכה בהדבקת תאים אנושיים בפלסמידים דו-כיווניים, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה נמוכה יותר כדי להניב נגיפים המתאימים לייצור חיסונים, המאופיינים בשכפול מופחת בתנאים חמים יותר.

יצירת נגיפי שפעת חיים מוחלשים רקומביננטיים לחיסונים

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

מודלים מערכתיים ומקומיים של זיהום דג זברה לנגיף שפעת אנושי A. באמצעות מודל זיהום מערכתי, ניתן להשתמש בדג הזברה לבדיקת תרופות אנטי-ויראליות. באמצעות מודל זיהום מקומי, ניתן להשתמש בדג הזברה כדי לאפיין את תגובות תאי החיסון של המארח.

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

כאן, סיפקנו שיטה כדי להשיג שינוי יציב של העוף Eimeria טפילים על-ידי נוקלאונופיטים sporozoites או הדור השני merozoites. טפילים מהונדסים גנטית שונה ביטוי הטרוולוגי הגנים ניתן להשתמש ככלי משלוח החיסון.

נוקלאופלוט ובהפצת Vivo של העופות האימריריה טפילים

המטרה הכוללת של מאמר זה היא לתאר כיצד לבצע בהזרקה תוך תאית של אובו של חומרים אקסוגניים לעוברי עוף. גישה זו שימושית מאוד כדי לחקור את הביולוגיה ההתפתחותית של עוברי תרנגולות.

באובו הזרקה תוך-וסקולרית בעוברי עוף

כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור, טיהור וכימות של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי &gt; 6 × 109 יחידות יוצרות פלאק/מ"ל, ומספק כמויות נגיפיות המתאימות למחקרים בבעלי חיים in vivo . מתוארים מבחני בקרת איכות נוספים להבטחת בטיחות in vivo .

ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי

שיטה זו מציגה את עובר התרנגולת כמודל פשוט וחסכוני in vivo להחייאת הפתוגן החיידקי L. monocytogenes ממצב בר-קיימא אך לא ניתן לתרבות (VBNC) ועם שימושים נוספים פוטנציאליים בהבנת מנגנוני תרדמת חיידקים.

עובר עוף כמודל in vivo להחייאת פתוגנים ברי קיימא אך לא ניתנים לתרבות

למד שיטה לגידול נגיפי שפעת A בכמות גדולה ובטיטר גבוה באמצעות ביצי עוף מופרות. השיטה כוללת הדבקה דרך חלל האלנטואיד והקפאה מהירה בחנקן נוזלי לצורך מחקר ופיתוח חיסונים.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

גלה סרטונים נוספים