רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר כמויות גדולות של נגיף שפעת עם טיטר גבוה, במערכת חסכונית. זה מושג על ידי השגת ביצי תרנגולות טריות ללא פתוגנים בסרום. בשלב השני, הביצים נדבקות בנגיף השפעת דרך שורש אלן טואיק.

במשך 48 שעות, נוזל אלן טואיק, המכיל את הנגיף, נקצר והנגיף מוקפא בחנקן נוזלי. בסופו של דבר, ניתן לבצע בדיקות פלאק והמגלוטינין כדי לקבוע את השפעת טיטר הנגיף של אלן טויק שנאסף. הדגמה ויזואלית נוזלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי הקטיף רגישים מאוד ודורשים טיפול זהיר בביצים וידע טוב של האנטומיה שלהן.

לפני תחילת ההליך השיג ביצי דוויאן טריות ללא פתוגן בסרום מספק מתאים. מיד עם ההגעה, הניחו את הביצים בחממת ביצים לחה עם מסובב ביצים אוטומטי כדי לסובב ביצים באופן קבוע ב-37 מעלות צלזיוס ו-55 עד 60% לחות למשך 10 עד 11 ימים. לאחר שבעה עד שמונה ימים של דגירה, לבישת כפפות מחוטאות אתנול 70%.

נגב נר ביצים עם האתנול והעביר את הביצים מהחממה לקרטוני הביצים הריקים. לאחר מכן כבו את האורות והחזיקו את הקצה הגדול של הביצים, אחת בכל פעם כנגד ה-Candler. אם ביצית פורייה, כלי דם דקים המובילים לעובר בצורת שעועית צריכים להיות גלויים בבירור.

אם הביצה אינה מופרית, ייצפה כתם דם קטן עם חלמון ביצה גלוי. לאחר מכן השליכו את הביציות הלא מופרות והחזירו את הביציות הקיימות לחממה. אם לא ניתן לאשר את מצב הביצית, סמנו אותה להשגחה מאוחרת יותר ביום ה-10 או ה-11 לאחר ההפריה ומיד לפני השימוש, דללו את מלאי נגיף השפעת A לאחת פעמים 10 עד השלישית עד 10 ל-PFU הרביעי למיליליטר ב-PBS סטרילי בתוספת היפים והניחו אותו על קרח.

לאחר מכן הדליקו שוב כל ביצה והשמידו את כל העוברים המתים ללא תנועה. לאחר מכן, הוציאו שלוש ביצים מהחממה וסדרו אותן במחזיק נפרד. כששקי האוויר למעלה, סמנו את המרחב האווירי של הביצים בטוש קבוע.

לאחר מכן שטפו את האזור שמעל המרחב האווירי עם אתנול 70% והעבירו את המרחב האווירי של הביצים לתוך קרטון ביצים בתוך מכסה מנוע של שני בטיחות ביולוגית. כעת השתמש במחט סטרילית בגודל 18 כדי לנקב חור קטן בקליפה מעל שק האוויר של כל ביצה. הקפידו לא להכניס את המחט עמוק מדי כדי להימנע מדקירת העובר או החלמון.

לאחר מכן משוך את נגיף השפעת המדולל למזרק סטרילי של מיליליטר. חבר מחט בגודל 22 וקדם בזהירות את המחט בזווית של 45 מעלות לתוך חלל אלן טויק של הביצה הראשונה. הזריקו 0.2 מיליליטר מהנגיף המדולל לביצה, ולאחר מכן לאחר הזרקת שתי הביצים האחרות, השליכו את המזרק ואטמו כל חור בטיפת דבק מאקדח דבק.

טיפול בדבק לא דולף בתוך הביצה, ואז מכניס את הביצים בחזרה לחממה. לאחר שכל הביצים חוסנו, יש לדגור על הביצים הנגועות ב-37 מעלות צלזיוס ו-60% לחות מבלי להסתובב לזמן הדגירה האופטימלי. תלוי בסוג נגיף השפעת.

בתום תקופת הדגירה, יש לצנן את הביצים למשך ארבע שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס כדי להרוג את העובר ולכווץ את כלי הדם. כאשר הביצים צוננו מספיק. העבירו אותם למכסה מנוע ומחזיק יציב ונקו את משטחי הביצים עם 70% אתנול.

לאחר מכן השתמש במספריים סטריליים כדי לפתוח את קליפת הביצה מעל שק האוויר של הביצה הראשונה. הסר את הקליפה סביב שק האוויר. הקפדה לא לפגוע בקרום הכוריו אלן טואיק.

לאחר מכן השתמש במלקחיים קהים סטריליים כדי לפתוח את קרום הצ'וריו אלן טויק ולהזיז בעדינות הצידה את העובר ואת שק החלמון בעזרת מרית או כף קטנה, תוך הקפדה לא לקרוע את החלמון. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, אספו בזהירות את נוזל אלן טויק, והטו את הביצה הצידה כדי לאסוף כמה שיותר נוזלים ככל האפשר. כל ביצה צריכה להניב בין חמישה ל-10 מיליליטר של נוזל מעט צהבהב כאשר כל ביצה נקצרת.

אסוף את נוזל אלן טויק בצינורות חרוטיים מפלסטיק של 50 מיליליטר על קרח. לאחר שכל הנוזל נאסף, סובב את הנגיף והעביר את הנוזל השקוף לצינור חדש של 50 מיליליטר על קרח. לבסוף, השליכו את הביצים במיכל פסולת BSL שני ומיד Eloqua לנוזל TOIC LAN מובהר.

לאחר מכן הצמד, הקפיאו את הנגיף בחנקן נוזלי והניחו את הגבעולים הקפואים במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך, זיהום בנגיף השפעת גורם לאפקט ציטופתי המביא לאזורים מעגליים של תאים שרוכים או פלאק הנוצרים על שכבה אחת של תאים. בניסוי זה, הפלאקים הודגמו על ידי צביעת התאים בסגול קריסטל ו-65 פלאקים נספרו בבאר עם דילול אחד כפול 10 עד 12 שלילי של הנגיף מכיוון ש-500 מיקרוליטר מדוללים מלאי ויראלי תרבית על התאים.

בניסוי זה, הטיטר הסופי היה 1.3 כפול 10 ל-PFU ה-14 למיליליטר. בדיקת אומת המגלוטינין היא שיטה לטיטרציה של נגיף השפעת המבוססת על יכולתו של הנגיף להיצמד לפני השטח של כדוריות הדם האדומות. כפי שנצפה, התרחיף הנגיפי מצטבר את כדוריות הדם האדומות ומונע מתאי הדם האדומים להתיישב מחוץ לתרחיף.

תוצאה שלילית בבירור נצפתה עם דילול של 2 עד מינוס 10 של הנגיף ב-50 מיקרוליטר. לכן, הטיטר הסופי הוא 2.1 כפול 10 ל-HAU הרביעי למיליליטר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להפיץ את נגיף השפעת על ידי חיסון ביצי תרנגולות, וקצירת הנוזל האטלנטי המכיל את הנגיף.