הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון
11 בפברואר 2015
נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להשיג הקלטות תגובת אור מנוירונים ברשתית המותאמים כהים. זה מושג על ידי קצירת עין עכבר תחילה. השלב השני הוא לבודד את הרשתית ולחתוך אותה להכנת פרוסות.
לאחר מכן, תכשיר הרשתית מותקן ונצפה במיקרוסקופ כדי למצוא תא מטרה להקלטות מהדק טלאי. לאחר קביעת תצורת מהדק תיקון תא שלם, מופעל גירוי קל בקרבת התא. לבסוף, ניתן לצפות בתגובה אלקטרופיזיולוגית בו זמנית באמצעות תוכנת רכישה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו הדמיית KRC, הוא שרגישות ההקלטה גבוהה, ושניתן לזהות תאי הקלטה מורפולוגית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שעבודה בחושך מוחלט יכולה להיות קשה ומבלבלת עבור אלה שאינם רגילים לעשות זאת. כדי להתחיל טווח, כלי החיתוך והעברת הפיפטות ליד מיקרוסקופ הניתוח.
אזור העבודה יהיה מאורגן היטב כך שניתן יהיה לגשת בקלות לכל כלי בחושך. כשהוא מוכן, שחר צופה אינפרא אדום כדי לבצע את ההליך בחושך. לאחר המתת חסד יש לגרעין את העיניים במהירות ולהניח אותן בצלחת של תמיסת חיתוך קרה, שנשמרה בקופסה חשוכה הפועלת תחת מיקרוסקופ.
מעבירים עין לכלי עם תמיסת חיתוך קרירה. מבעבע ללא הרף בחמצן. כדי להסיר את הקרנית והעדשה, החזיקו את עצב הראייה בקצה השני של גלגל העין כדי למנוע ממנו לזוז ובצעו חתך בחלק העליון של הקרנית בעזרת סכין מיקרו-כירורגית.
האריכו את החתך בעזרת מספריים כירורגיים והסירו את הקרנית, והשאירו מעט סקלרה סביבה. לאחר מכן, תפסו את העדשה בעזרת מלקחיים עדינים ושלפו אותה לאט החוצה. לאחר הכנת גביעונית העיניים, שפכו בעדינות תמיסת חיתוך מחומצנת קרה לתוך העיניים בעזרת פיפטת העברה קטנה.
עבדו במהירות כדי לשמור על צורת הרשתית והשתמשו בלחץ עדין כדי לזהות את הצד הגבי והגחוני של הרשתית. השתמש בצופי אינפרא אדום כדי לזהות את הקו העובר על פני העין של הרשתית, העובר ליד ראש עצב הראייה. קו זה עובר בעיקר על פני הצד הגחוני של עצב הראייה והצד, כולל עצב הראייה, הוא הצד הגבי.
בהתאם לניסוי, בצע חתך בצד הגחון או הגב. זה מסמן את הצד המיותר ומהווה סמן שימושי להתקדמות. לאחר מכן, הסר בעדינות את הזגוגית בעזרת מלקחיים עדינים במיוחד מבלי לגעת ברשתית.
הזגוגית מחוברת בעיקר לתחתית ולקצה החיצוני של העין. מכיוון שהזגוגית עשויה להיות מחוברת היטב לכוס העין, המשיכי בעדינות להסרת היפרדות הרשתית. המשך למשוך עד שלא מורגש מתח.
לאחר בידוד הרשתית, תפסו את הסקלרה וקילפו בעדינות את הרשתית. בעזרת הצד האחורי של המלקחיים, חותכים את הרשתית וזורקים את החצי המיותר באותה צלחת פלסטיק. חותכים את הרשתית הנותרת לשתי חתיכות לכל חתיכה.
חותכים את הקצוות ליצירת לוח רשתית וחותכים את הקצוות המתקפלים. לאחר מכן, השתמש בפיפטה העברה גדולה כדי להעביר לוח רשתית על צלחת זכוכית. מצצו את התמיסה העודפת בעזרת פיפטה קטנה והשתמשו בפיסת נייר סינון כדי לשטח את הלוח.
הניחו בעדינות חתיכה מקרום המסנן על גבי הרקמה באמצעות פיפטת העברה קטנה. הניחו טיפת תמיסת חיתוך על קרום המסנן. המתן כ-15 שניות בזמן שהתמיסה מתפשטת ומדביקה את רקמת הרשתית לקרום המסנן.
לאחר שנדבקו זה לזה, שפכו עוד תמיסת חיתוך קרה מתחת למסנן וסביבו עד שהקרום צף. לאחר מכן, הכניסו את קרום המסנן לתא החיתוך וכסו בתמיסת חיתוך. בעבודה מהירה כדי להבטיח שהקרום לא יתייבש, השתמש במסוק כדי לחתוך את רקמת הרשתית לפרוסות.
הנח החלקה של כיסוי פלסטיק עם מסילות שומן לתוך תא החיתוך. העבירו פרוסת רשתית על גבי מסילות השומן וסובבו את הפרוסה ב-90 מעלות כך שהחלק הרוחבי יהיה גלוי. לחץ את קרום המסנן כלפי מטה על החלקת הכיסוי לפני כיסוי דפנות נייר הסינון בשומן.
לאחר שהפרוסות משותקות על החלקת כיסוי פלסטיק, העבירו אותה לכלי פלסטיק בגודל 33 מילימטר. טבלו את התכשיר בתמיסת חיתוך פחם ואחסנו כל מנה בקופסה חשוכה המחומצנת ברציפות. להקלטות מהדק תיקון.
יש להניח את צינורות השפע עם מטרות בינוניות ולאפשר לכל הבועות לעבור מהצינור. לאחר הכנת פיפטות הקלטה עם קוטב זכוכית, מלאו מחדש את הקצה בתמיסת פיפטה. לאחר מכן, השתמש במילוי מיקרו פיפטה כדי למלא כשליש מהפיפטה לאחר מילויה, אחסן כל פיפטה בקופסת פיפטה לחה.
לאחר מכן, הפעל את הציוד להקלטות של מפעל תיקון, כולל מגבר המחשב, מצלמת CCD ומיקרוסקופ הפועלים בתנאי חושך. הנח תכשיר פרוסת רשתית על במת המיקרוסקופ בעזרת צופה אינפרא אדום. לאחר שהוא משותק, התחל זלוף רציף.
הגדר את טמפרטורת הזלוף ל-33 עד 37 מעלות צלזיוס. הצג את משטח הפרוסה באמצעות מצלמת CCD. התמקד במיקום היעד.
עם סוגי תאי המטרה שוכנים, בחר תא בריא למראה להקלטת טלאי. לאחר זיהוי תא בריא, הנח פיפטה הקלטה במחזיק פיפטה וקדם את הפיפטה להכנת הפרוסה. כשהוא קרוב להכנת הפרוסה, מצא את קצה הפיפטה במיקרוסקופ.
ברגע שקצה הפיפטה נראה מתחת למיקרוסקופ, הזיזו את הקצה כלפי מטה לכיוון תא המטרה. לאחר מכן, הגדר את המגבר והתאם את הפיפטה בפיקה amp. חמישה וולט למגבר ננה.
התחל דופק חשמלי רציף של כחמישה מילי-וולט וכ-10 הרץ ובדוק את התנגדות הפיפטה. התנגדות אידיאלית היא בין חמישה ל -12 מגה אוהם. עבור רוב נוירוני הרשתית.
כשהוא מוכן, השתמש בפיה או במזרק כדי לפוצץ את התמיסה הפנימית עד שקצה הפיפטה נמצא על פני תא המטרה. כאשר הלחץ החיובי יוצר גומה קטנה על פני התא, קדם מעט את הקצה והפסק לנשוף החוצה. אם התנגדות הפיפטה עולה ללא הרף, השאירו אותה ועקבו אחר ההתנגדות עד שהיא מגיעה ליותר מג'יגה אוהם אחד.
אם ההתנגדות אינה עולה באופן ספונטני, הפעל בעדינות לחץ שלילי עד שהיא הופכת לאיטום ג'יגה. לאחר השגת איטום הג'יגה, שנה את פוטנציאל ההחזקה ל-70 מילי-וולט שלילי ואז הפעל לסירוגין לחץ שלילי כדי לקרוע את הממברנה בתוך קצה הפיפטה. כאשר כל תצורת התא נעשית, התנגדות הפיפטה יכולה להיות בין 500 מגה אוהם לג'יגה אוהם אחד, והזרם הקיבולי ניתן לצפייה.
רשום את יחס ה-IV מ-80 עד 40 מילי-וולט שלילי. סוגים שונים של תעלות מגודרות מתח יופעלו בהתאם לסוג התא. לבסוף, הקלט זרמים או מתחים סינפטיים מעוררי אור.
הכנת פרוסה זו הנראית ב-10x מציגה גם קולטני אור וגם תאי גנגליון ללא ניתוק מנייר המסנן. כאשר מסתכלים על הכנה זו עם יעד של פי 60, כל שכבת תא נצפית בבירור. אור מעורר פוטנציאל פוסט-סינפטי מעורר מנוירונים ברשתית התעורר בתגובה לאור צעד.
שיא משרעת וזמן הדעיכה משתנים בהתאם לסוג התא ותת-הסוג. סוג התא ותת-הסוג המורפולוגי שלו התגלו על ידי תיוג גופרית לאחר רישומים פיזיולוגיים לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך למדענים בתחום חקר הרשתית לחקור את הפונקציות של איתות חזותי טבעי, כמו גם את התרומות של מנגנונים סינפטיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את הכנתם של פרוסות רשתית מעי שפן ואת הקלטת תגובות האור בנוירונים של הרשתית. הפרוצדורה מבוצעת בתנאי הסתגלות לחושך כדי להבטיח מדידות מדויקות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה של הרשתית
רקע
- הבנת תגובות אור בנורונים רטינליים היא קריטית למחקר במדעי המוח.
- טכניקות Patch clamp מאפשרות רישומים אלקטרופיזיולוגיים מפורטים.
- הסתגלות לחושך חיונית למדידות מדויקות של תגובות אור.
- הכנות של פרוסות רשתית מספקות סביבה מבוקרת לחקר פעילות נוירונלית.
מטרת המחקר
- להשגת הקלטות של תגובה לאור מנוירונים רשתיים שהותאמו לחושך.
- להדגמת המתודולוגיה להכנת פרוסות רשתית.
- להמחשת השימוש בטכניקות Patch clamp במחקר של הרשתית.
שיטות שנחרו
- קצירת עיני עכבר לצורך בידוד הרשתית.
- הכנת פרוסות רשתית לניתוח אלקטרופיזיולוגי.
- שימוש במיקרוסקופ לאיתור תאי מטרה לצורך הקלטות.
- החלת גירויי אור להערכת תגובות נוירונליות.
תוצאות עיקריות
- בידוד והכנה מוצלחים של פרוסות רשתית.
- ביסוס תצורת whole cell patch clamp.
- תצפית על תגובות אלקטרופיזיולוגיות המושרות על ידי אור.
- הדגמת יעילותה של המתודולוגיה.
מסקנות
- השיטה מאפשרת הקלטות מדויקות של תגובות אור בניורוני רשתית.
- תנאים של הסתגלות לחושך הם קריטיים להשגת תוצאות ניסוי מדויקות.
- ניתן ליישם גישה זו במחקרים נוספים בפיזיולוגיה של הרשתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
הבנת התפקידים הפונקציונליים של תתי-סוגים של נוירונים ברשתית היא קריטית לתיקוף יעדים בתהליך גילוי תרופות רפואיות לעין. שיטה זו מאפשרת אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תגובות סינפטיות המושרה על ידי אור, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית של יעדים במסלול הראייה. גישה זו מספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור, המגבירים את הביטחון החזוי בבחירת יעדים בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור מורפולוגיה נוירונלית לתגובות פוסט-סינפטיות המעוררות על ידי אור.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה ישירה של תפקוד סינפטי בתתי-סוגים מוגדרים של נוירונים ברשתית.
- ערך ניבוי: מייצר תוצרי קריאה אלקטרופיזיולוגיים כמותיים המשמשים להערכת הביטחון במטרה ולאישור מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר דגימות סטנדרטיות של פרוסות רשתית מותאמות לחושך, המתאימות לסריקה אלקטרופיזיולוגית עקבית.
- פלט כמותי: מספק זרמים או מתחים פוסט-סינפטיים מושרי אור מדידים, בעלי אמפליטוד שיא וקינטיקת דעיכה מוגדרות.
- שחזור: מאפשר הערכה מהימנה של תרכובות באמצעות הקלטות patch clamp של תא שלם (whole-cell) יציבות בתאים שזוהו ויזואלית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקל על חקר רשתות עצביות ברשתית המעורבות בקידוד מאפיינים חזותיים כגון תנועה וצבע.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב התיקוף התפקודי של שלב הגילוי לבין הערכה פרה-קלינית של מנגנונים סינפטיים באיתות חזותי.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות של go/no-go על ידי הבהרת התרומה התפקודית של תתי-סוגים עצביים ספציפיים לעיבוד חזותי.
שילוב תהליכי עבודה וסדרות ניתוח (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזה של מטרה ועד לזיהוי מוביל (lead), ומספקת נתונים פונקציונליים התורמים לתיעדוף מוקדם של מטרות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבירור מסלולים על ידי הקלטת תגובות המעוררות באור בנוירונים רטינליים שזוהו מורפולוגית.
- סינון: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות הכנת פרוסות המותאמות לחושך ופרוטוקולי גירוי אור עקביים.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות אלקטרופיזיולוגיות הכוללות אמפליטודת זרם וזמן דעיכה, המאפשרות השוואה בין סוגי תאים ותנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין גילוי מנגנונים סינפטיים למודלים של מחלות רטינה באמצעות פרופיל תפקודי ספציפי לסוג תת-תאי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת שינויים גנטיים, פרמקולוגיים או קשורים למחלה בתפקוד הנוירונים הרטינליים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור מורפולוגיית התא לתפקוד סינפטי ברשת הרשתית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות תנאי הסתגלות לחושך והכנה מונחית אינפרא-אדום, תוך מזעור השונות במדידות תגובה לאור.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בבחירת המטרה על ידי אספקת ראיות אלקטרופיזיולוגיות ישירות למעורבות נוירונלית בעיבוד אותות חזותיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על תפקידים תפקודיים מתוקפים במסלולי רשתית נפרדים.
שיקולים ליישום
- נדרשת מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, בדיסקציה של הרשתית ובמיקרוסקופיה באינפרה-אדום לטיפול ברקמה המותאמת לחושך.
- תלות במגברי patch clamp, מערכות פרפוזיה ומצלמות CCD להשגת הקלטות ויזואליזציה יציבות.
- מחייב פרוטוקולי חדר חשוך סטנדרטיים ותמיסות דיסקציה מחומצנות לשמירה על חיוניות הרקמה.
- התאמה בין מערכות מודלים עשויה לדרוש התאמות של זוויות החיתוך ופרמטרי הפרפוזיה, בהתבסס על עובי הרשתית וצפיפות התאים.
- מגבלות מעשיות כוללות את האתגר הטכני של שמירה על תנאי התאמה לחושך ואת הצורך במפעילים מיומנים להשגת giga-seal אמין.
