Name: הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: למד הקלטת תגובות אור בנוירונים רשתית בעכבר מותאמי-חושך באמצעות טכניקות patch clamp. שיטה זו מאפשרת מדידות אלקטרופיזיולוגיות מדויקות של תאי עצב ברשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 EY020533, קרן הסטארט-אפ של WSU ומענקי RPB.

הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה וויין סטייט. 1. הכנת פתרון ניסויי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לנתח 1 יום 1 בשבוע שלפני הניסוי בפועל. השתמש בפתרון חיץ HEPES לנתיחה רשתית בגלל יכולת החציצה החזקה שלה בטמפרטורות נמוכות יותר 16. מערבבים את כל החומרים הכימיים כדלקמן (מ&quot;מ): 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.0 MgCl 2, 10 HEPES, גלוקוז 28. התאם ל- pH 7.4 עם NaOH. שמור את הפתרון במקרר עד השבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון ההקלטה הוא המדיום &#39;איימס, שהוא נוזל מוחי מלאכותי השדרה (aCSF) המיועד להכנות רשתית 17. מהיום ליום של הניסוי, לשקול את האבקה &quot;איימס (4.4 גר &#39;לפתרון 500 מיליליטר) בצינור. כמו כן, לשקול את NaHCO 3 (0.95 גר &#39;ל -500 מיליליטר פתרון) ומערבבים עםהאבקה &#39;mes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון פיפטה תאית עבור הקלטות מהדק תיקון מהיום ליום של הניסוי. מערבבים את כל החומרים הכימיים כדלקמן (מ&quot;מ): 111 K-גלוקונאט, 1.0 CaCl 2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl 2, 5 ATP-Mg, ו1.0 GTP-Na. התאם ל- pH 7.2 עם KOH. סנן את פתרון פיפטה עם מסנן מזרק קונבנציונלי. הפוך ~ 500 aliquots μl ולאחסן אותם במקפיא או במקפיא עמוק. </li></ol> 2. הכנה ליום של ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלילה שלפני הניסוי, למקם את עכבר בכלוב (C57BL / 6J או רקע דומה, 4-8 שבועות, זכר) בחלל חשוך לO / N הסתגלות כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לנתיחה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא לנתח פתרון (100 - 200 מיליליטר) בכוס זכוכית, מניח אותו על קרח, ואת הבועה עם חמצן במשך לפחות 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל חמצון של התיבה הכהה לאחסון הכנת רשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן coverslips פלסטיק עם פסי שומן מחדשהכנות פרוסה tinal ולמקם כל אחד מהם בצלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף סכין גילוח חדש למסוק (מבצעה רקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך קרום מסנן לשני חצאים. זה מיועד לחיתוך ברשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הכלים לנתח וטפטפות העברה ליד מיקרוסקופ לנתח. אזור העבודה חייב להיות מאורגן היטב, כך שכל כלי ניתן לגשת בקלות בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה להקלטות מהדק תיקון: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר האבקה &#39;איימס וNaHCO 3 במים מזוקקים (איימס 4.4 g וNaHCO 3 0.95g / 500 מיליליטר DDH 2 O). בינוני הבועה &#39;איימס מעורב חמצן (O 95% CO 2 ו- 5% 2) לפחות 30 דקות בזמן חימום לרמת טמפרטורת הקלטה (~ 35 ° C). התאם את ה- pH 7.4 עם NaHCO 3 ועדיין מבעבעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את פתרון פיפטה הפנימי במהלך הניתוח. לאחר שהפשיר, להוסיף 0.01% sulforhodamine B עבור מכתים תאיים. </li></ol></li></ol> 3. הרשתית Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר חשוך, להרדים את העכבר באמצעות פחמן דו חמצני וחזה אוויר דו-צדדי. לאחר 2-3 דקות של שימוש בפחמן דו חמצני, העכבר יאבד את הכרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סמן העכבר כבר לא מגיב לקמצוץ זנב, enucleate במהירות את העיניים ומניחים אותם בפתרון לנתח קר בצלחת פלסטיק. בצע את pneumothorax דו-צדדי, כדי להבטיח את מותו של בעל החיים. מהירות לאחסן את העיניים בצלחת בתיבה הכהה. השתמש בצופת אינפרא אדום לנהל את ההליך בחושך. הערה: לחלופין, isoflurane, עריפת ראש, או נקע בצוואר הרחם יכולה לשמש להמתת חסד. השיטה של ​​המתת חסד צריכה לעקוב אחר ההנחיות של המכון הלאומי לבריאות (NIH) ו / או ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר חשוך, להתאים את מיקרוסקופ לנתח ותאורת אינפרא אדום. מתחת למיקרוסקופ, להעביר עין מהמנה שלה לתוך צלחת פלסטיק 10 סנטימטרים wה- i הפתרון לנתח המקורר. ברציפות חמצן בועה דרך צינורות שהונח על החלק התחתון של צלחת הפלסטיק. התאם את נפח הזרימה כך שזה לא נמוך מדי, אבל לוודא שהוא לא גבוה מספיק כדי להפריע לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרנית ועדשת ההסרה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בחלק העליון של הקרנית עם סכין מיקרו-כירורגית. מחזיק את עצב הראייה בקצה השני של גלגל העין מונע את העין לנוע. להאריך את החתך באמצעות מספריים כירורגית. חותך את הקרנית עם כמה לובן העין סביבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את העדשה עם מלקחיים עדינים ולשלוף את העדשה באיטיות. אם הזגוגית דביקה מדי כדי להסיר את העדשה, לחתוך את הזגוגית עם זוג מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעיני הכוס הוא עשה, בעדינות לשפוך פתרון קר, חומץ לנתח לעיינית עם טפטפת העברה קטן. הערה: גלגל העין מתפחסת במהירות לאחר מבצעים חתך בקרנית. חשוב לשמור על הצורה של עין כעיוות עין במהלך פרו זהcedure יפגע הרשתית ולגרום להיפרדות רשתית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי הצדדים גב וגחון של הרשתית: הערה: בגלל חלוקה לא שווה של ירוק והסגול (UV) קונוסים 18, זיהוי אזור ברשתית ספציפי חשוב להקלטות תגובת אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הקו הולך על פני כוס עין הרשתית עוברת ליד ראש עצב הראייה. קו זה עובר ברובו מעבר לצד הגחוני של עצב הראייה; הצד כולל את עצב הראייה הוא צד הגב, ואילו השני הוא הגחון 19. ראה אתר זה בבירור תחת צופים אינפרא אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לצורך הניסוי, לעשות חתך בצד המיותר. זה יהיה שימושי לאחר שבודד הרשתית מכוס עין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת זגוגית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, דגירה עין-הכוס עם hyaluronidase (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר) במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזגוגית עם מלקחיים נוספים-בסדר. הזגוגית היא בעיקרמצורף בתחתית והקצה החיצוני של העין-הכוס. בעדינות להסיר אותו בלי לגעת או דוקרים את הרשתית. כזגוגית עשויה להיות קשורה באופן הדוק לעיינית, להסיר בעדינות כדי למנוע היפרדות רשתית מהעין-הכוס. תמשיך למשוך עד אין מתח מורגש. הערה: שלב זה הוא חשוב במיוחד עבור לנתח רשתית העכבר; עם זאת, זה לא בעיה עבור הרשתיות של מינים אחרים כגון עכברים או סלמנדרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הרשתית מהעין-הכוס. תפוס את לובן העין ובעדינות לקלף את הרשתית באמצעות הישבן של מלקחיים. הערה: Whole-Mount הכנות רשתית יכולה להיות עשויה מהרשתית המבודדת. הפוך 03:57 קיצוצים בקצוות ולשטח את הרשתית, או לחתוך את הרשתית למספר חלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הרשתית וזורקים את המחצית המיותרת של הרשתית (שלב 3.5). באותה צלחת פלסטיק, לחתוך את הרשתית שנותרה לשני חלקים. לכל פיסה של הרשתית, לחתוך את הקצוות כדי להפוך אתלוח רשתית, וחתוך את הקצוות מתקפלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את לוח רשתית על צלחת זכוכית בעזרת פיפטה גדולה העברה (~ 2 מיליליטר). להתחנף הפתרון העודף עם טפטפת קטן, להשתמש בפיסת נייר סינון כדי לשטח את הלוח, ולאחר מכן למקם במהירות חתיכת קרום המסנן על גבי הרקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברה קטנה, במקום ירידה של ביתור פתרון בקרום המסנן. חכה ~ 15 שניות עד הפתרון משתרע על פני הקרום. במהלך תקופה זו, רקמת הרשתית תדבק קרום המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים פתרון לנתח קר יותר מתחת ומסביב למסנן. רקמת הרשתית עם קרום המסנן תצוף. תפוס את הקרום המסנן עם מלקחיים ומניח אותו בתא החיתוך. יוצקים לנתח פתרון על הרקמה, ולאחסן את ההכנה בתיבה הכהה. הערה: ההליך המתואר כאן הוא קריטי. חשוב לבצע את הפעולות הבאות במהירות על מנת להבטיח כי מקלות רקמת רשתית לmem המסנן<html> brane ולא להתייבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מסוק, לחתוך את רקמת הרשתית לפרוסות. סביב 200 מיקרומטר עובי אפשרי ללימודי מהדק תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip פלסטיק עם פסי שומן בתא החיתוך. העבר את פרוסת רשתית על גבי מסילות השומן על coverslip פלסטיק. סובב את הפרוסה 90 מעלות כך שהסעיף הרוחבי גלוי. לחץ על קרום המסנן כלפי מטה על coverslip, אז, לכסות את הצדדים של נייר הסינון עם גריז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי פרוסה היא משותקת על coverslip פלסטיק, לתפוס את coverslip ולהעביר אותו לצלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ. יוצקים פתרון לנתח קר על הכנת הרשתית ולהטביע את ההכנה. אחסן כל מנה בתיבה הכהה, שאמור להיות מחומצן ברציפות. הערה: כל ההליך צריך להיעשות בזהירות, כדי שקרום הסינון אינו מעוות. אחרת, פרוסת הרשתית בקלות מפרידה מן קרום המסנן. </li></ol></li></ol>ss = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. הצמד תיקון הקלטות מרשתית Slice הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטת הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש צינורות זלוף עם המדיום &#39;איימס. לאפשר לכל הבועות כדי לעבור בעת מילוי צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך טפטפות הקלטת מהדק תיקון עם חולץ. כדי למלא את פיפטה עם פתרון פיפטה, לטבול בישבן של פיפטה דקות 1 עד קצה פיפטה backfilled. בשלב הבא, למלא ~ 1/3 של פיפטה באמצעות מילוי מיקרו-פיפטה. אחסן כל פיפטה בתיבת פיפטה לחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הציוד להקלטות מהדק תיקון; כולל מחשב, מגבר, מצלמת CCD, ומיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבות את האור בחדר. הנח הכנת פרוסה רשתית על תא הבמה מיקרוסקופ באמצעות צופה אינפרא אדום. אחרי זה הוא משותק, להתחיל זלוף הרציף. הגדר את טמפרטורת זלוף ב33-37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את פני השטח הפרוסה עם מצלמת CCD. להתמקד במיקום היעד שבו ce היעדסוגי ll מתגוררים. בחר תא בריא למראה להקלטת מהדק תיקון (כלומר, זה צריך להיות משטח מראה חלק וצורת תא טובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פיפטה הקלטה במחזיק פיפטה. לקדם את פיפטה להכנת פרוסה. כשהיא קרובה להכנת פרוסה (~ 2 מ&quot;מ מעל), למצוא את הקצה של פיפטה עם מיקרוסקופ. ברגע שקצה פיפטה גלוי מתחת למיקרוסקופ, להזיז את הקצה מטה לכיוון תא המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המגבר. התאם את פיפטה ב0 mV / 0 הרשות הפלסטינית (איפוס) ולהתחיל דופק חשמלי רציף של ~ 5 mV ב ~ 10 Hz. בדוק את התנגדות פיפטה; התנגדות אידיאלית היא בין 5 ל 10 MΩ עבור רוב נוירונים ברשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל נשיפה מהקצה. השתמש בשופר, או להשתמש במזרק, להפעיל לחץ חיובי כאשר פיפטה טובלת לתוך פתרון האמבטיה. ברציפות לכבות את הפתרון הפנימי עד הקצה הוא על פני השטח של תא המטרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הלחץ החיובי עושה גומה קטנה על הפני תא דואר, לקדם את הקצה מעט ולהפסיק נשיפה. בדוק את התנגדות פיפטה, אשר אמור להגדיל. אם הוא עולה בהתמדה, להשאיר אותו ולפקח על ההתנגדות עד שהוא מגיע&gt; GΩ 1 (gigaseal). אם ההתנגדות אינה מעלה באופן ספונטני, בעדינות להפעיל לחץ שלילי עד שהוא הופך gigaseal. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר gigaseal מושגת, לשנות את פוטנציאל החזקה ל-70 mV. לאחר מכן, לסירוגין להפעיל לחץ שלילי להתפקע הקרום בתוך קצה פיפטה. כאשר התצורה כל התא מורכב, התנגדות פיפטה יכולה להיות בין 500 MΩ וGΩ 1, ונוכחי קיבולי נראה. לפעמים ניתן לראות זרמי postsynaptic ספונטניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מערכת היחסים IV מ-80 ל+40 mV. סוגים שונים של ערוצי מתח מגודרת מופעלים בהתאם לסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא אור עורר זרמים או מתחים הסינפטי. </li></ol>

<ol><li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy%2C+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li>
<li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li>
<li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li>
<li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li>
<li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells%2C+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+558+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li>
<li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li>
<li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+524+Pt%22%5BJournal%5D)">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li>
<li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+for+a+binary+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li>
<li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li>
<li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li>
<li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29%2C+GABA%28C%29+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li>
<li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li>
<li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li>
<li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature%3A+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primordial%2C+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ניתן להשיג הקלטות טובות רק עם הכנות טובות של הרשתית והגדרות מהדק תיקון מתוכננות היטב. למרות שכל השלבים שתוארו לעיל חשובים, הדיון מדגיש כמה צעדים קריטיים הן לנתיחה והן להקלטות. 
עבור דיסקציה, שני דברים חשובים במיוחד: קירור וחמצון. לאחר הוצאת העין, הסר במהירות את החלק הקדמי של העין בתא חיתוך עם תמיסת חיתוך מקוררת ומבעבעת חמצן, ושפך תמיסה קרה לתוך העין. כאשר רקמת הרשתית נמצאת בתא הניתוח, יש לשפוך תמיסה קרה על הרקמה כל 10 דקות. יש לחתוך את הרקמה במהירות מבלי למשוך או לתקוע את רקמת הרשתית במהלך הדי...

הרשתית היא אחד החלקים הייחודיים של מערכת העצבים. כחלק נגיש של המוח, הארכיטקטורה הסינפטית שלו אופיינה היטב. בנוסף, ניתן לבחון את תפקודיה של רשת עצבית זו באמצעות גירוי פיזיולוגי: אור. אם רקמת הרשתית מבודדת בחדר חשוך עם הליכים מתאימים, נוירונים ברקמה יגיבו לאור. תכשיר זה שימש לחקר עיבוד אותות חזותיים ולהבהרת מנגנונים סינפטיים שונים ותפקודי רשת עצבית, כמו גם מנגנוני מחלה. 
תגובות אור בתאי עצב ברשתית תועדו במשך עשרות שנים. מחקרים מוקדמים השתמשו באלקטרודות חדות כדי לבצע הקלטות תוך-תאיות מנוירונים ברשתית של גורי בוץ1. בשנות ה-80 הומצאה טכניקת מהדק התיקון2, ועד מהרה הפכה לשיטה פופולרית בקרב חוקרי ראייה3,4. הקלטות של תאים בודדים מחולייתנים נמוכים יותר, כולל נוירונים ברשתית של גורי בוץ ודגים, היו שיטות פופולריות שתרמו להבהרת מנגנוני עיבוד אותות חזותיים5,6. 
לאחר שפותחו טכניקות מוטציה גנטית, רשתית העכבר הפכה למודל פופולרי יותר עבור חוקרי ראייה7-9. רשתית היונקים אטרקטיבית יותר מזו של בעלי חוליות נמוכים יותר מכיוון שהיא קרובה יותר מבחינה אבולוציונית לרשתית האנושית, ויש הזדמנות להשתמש במודלים של מחלות. עם זאת, תאי הרשתית של העכבר הם קטנים ושבריריים10, וביצוע הכנות רשתית וביצוע הקלטות מהדק טלאי בחדר חשוך הוא מאתגר. ככל שהטכנולוגיה השתפרה, גישות מגוונות הפכו זמינות לחקר מנגנוני איתות חזותי כגון מחקרי הדמיה11 ואלקטרורטינוגרמה (ERG)12. עם זאת, רישום תא בודד בשיטת מהדק התיקון עדיין חשוב מכיוון שהוא רגיש מאוד מבחינה זמנית ומרחבית בהשוואה לשיטות אחרות. לכן, ביצענו ברציפות הקלטות מהדק תיקון ושיפרנו את השיטות שלנו לחקור עיבוד אותות חזותיים בתכשירי פרוסות רשתית של עכבר13-15.
בסרטון הדרכה זה, הפרוטוקולים מוצגים עם טיפים חשובים. ניתן להשיג הקלטות טובות רק עם הכנה טובה. תרגול נתיחת בעלי חיים ובניית מתקן מהדק טלאי יציב יאפשרו לרוב החוקרים להשיג הקלטות מוצלחות.

<table><tbody><tr><td>עכברים (בני 28-60 יום, זכר)</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>C57BL/6J זן</td><td></td></tr><tr><td>איימס אבקה בינונית</td><td>סיגמא</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td> מעולה <td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>כלי ניתוח מעולה</td></tr><tr><td>: מלקחיים</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td> כלי ניתוח <td>מעולה</td></tr><tr><td>: מספריים</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>מעולה</td></tr><tr><td>כלי ניתוח: סכין ניתוח</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח מעולה (למסוק)</td> <td>EMS</td><td>71970</td><td>מסוק מעולה</td></tr><tr><td></td><td>בעבודת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יד צופה אינפרא אדום</td><td>אופטיקה ינשוף לילה</td><td>NOBG1</td><td>זה מראה תצוגה בהירה. מיקוד עצמים קטנים הוא בעיה.</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>מעולה; מייצר פיפטות בגודל עקבי.</td></tr><tr><td>קופסה כהה</td><td>שקנאי</td><td>קופסה כהה</td><td>מעולה</td></tr><tr><td>תיקון מהדק מערכת</td><td>Scientifica</td><td>פרוסת היקף 2000</td><td>התקנה מעולה. רוב רכיבי המפתח כלולים בחבילה אחת. מיקרומניפולטורים מצוינים.</td></tr><tr><td>מגבר</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>multiclamp 700B</td><td>שליטה מצוינת וקלה.</td></tr><tr><td>רכישת תוכנה</td><td>Molecular Devices</td><td>תוכנת pClamp</td><td>שליטה מעולה וקלה.</td></tr><tr><td>מקור אור (LED)</td> <td>מגניב LED</td><td>pE-2 מערכת 4 ערוצים</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td> מעולה <td>Q-imaging</td><td>Retiga 2000</td><td></td></tr><tr><td>כלוב פאראדיי</td> מעולה <td>בעבודת יד</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הקלטת אור עורר תגובות postsynaptic בנוירונים מותאמים-dark, תכשירי עכבר רשתית slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

הרשתית היא השער למערכת הראייה. כדי להבין את מנגנוני עיבוד אותות חזותיים, אנו חוקרים פונקציות רשת עצביות ברשתית. נוירונים ברשתית ברשת מהווים של תת סוגים רבים. יותר מ -10 תת-סוגים של תאים דו קוטביים, תאי הגנגליון ותאי amacrine זוהו על ידי מחקרים מורפולוגיים. תת מרובה של תאי עצב ברשתית הם חשבו לקודד תכונות מובהקות של איתות חזותית, כגון תנועה וצבע, ויוצרים מספר רב של מסלולים עצביים. עם זאת, התפקידים הפונקציונליים של כל נוירון בעיבוד אותות חזותי אינם מובנים במלואם. שיטת מהדק התיקון היא שימושית כדי לטפל בשאלה יסודית זו. כאן, פרוטוקול להקליט תגובות הסינפטי אור עורר בנוירונים ברשתית עכבר באמצעות הקלטות מהדק תיקון בתנאים כהים מותאם מסופק. עיני העכבר הן כהות מותאם O / N, והכנות פרוסת רשתית הם גזורים בחדר חשוך באמצעות תאורה וצופים אינפרא אדום. אור אינפרא אדום לאלהפעיל קולטני אור בעכבר ובכך שומר על היענות האור שלהם. מהדק תיקון משמש להקלטת תגובות אור עורר בנוירונים ברשתית. צבע ניאון מוזרק במהלך הקלטות לאפיין תת מורפולוגיות עצביות. הליך זה מאפשר לנו לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של כל נוירון ברשתית העכבר.

הכנת פרוסה נציג מוצגת באיור 1. הכנת פרוסה נמצאת בעמדה ישרה, מראה קולטניים אור לתאי הגנגליון במשטח שטוח, ולא ניתוק מנייר הסינון. אם הפרוסה מוטה, רק חלק מההכנה הוא בפוקוס, מה שהופך את זה קשה לזהות תא מתאים להידוק תיקון. להקלטות, חשוב לבחור סומה טובה, אשר בדרך כלל יש משטח מבריק, צורה אפילו עגולה, ולא לוחות כהים גלויים. אחרי כל תצורת התא נעשתה, הפרוסה נחשפה לאור רקע ולאחר מכן לצעד-אור (איור 2). פוטנציאלי postsynaptic מעוררים אור עורר (L-EPSPs) היו עור...

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להשיג רישומי תגובה לאור מנוירונים רטינליים שהותאמו לחושך. זאת מושג תחילה על ידי קציר עין של עכבר. השלב השני הוא בידוד הרשתית וחיתוכה להכנת פרוסות.בשלב הבא, דגימת הרשתית מותקנת ונבחנת תחת מיקרוסקופ כדי למצוא תא מטרה להקלטות patch clamp. לאחר ביסוס תצורת whole cell patch clamp, מופעל גירוי אור בקרבת התא. לבסוף, ניתן להבחין בתגובה אלקטרופיזיולוגית בו-זמנית באמצעות תוכנת הרכישה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוג KRC, הוא רגישות ההקלטה הגבוהה והיכולת לזהות תאים מורפולוגית. בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקלו בקשיים, כיוון שעבודה בחשכה מוחלטת עלולה להיות קשה ומבלבלת עבור מי שאינו רגיל לכך. כדי להתחיל, יש להניח את כלי הניתוח ופיפטות ההעברה ליד מיקרוסקופ הניתוח.סביבת העבודה תהיה מאורגנת היטב כך שניתן יהיה לגשת לכל כלי בקלות בחשיכה. כאשר תהיו מוכנים, השתמשו בצופה אינפרא-אדום כדי לבצע את הפרוצדורה בחשיכה. לאחר ההדברה (euthanasia), בצעו במהירות גרעינה (enucleation) של העיניים והניחו אותן בצלחת עם תמיסת דיסקציה קרה, שנשמרה בתוך קופסה חשוכה, תוך עבודה תחת מיקרוסקופ.העבירו עין לכלי עם תמיסת דיסקציה קרירה, המאווררת ברציפות עם חמצן. כדי להסיר את הקרנית ואת העדשה, החזיקו את העצב האופטי בקצה השני של גלגל העין כדי למנוע ממנה לזוז, ובצעו חתך

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מציג את התהליך של כל תא מהדק הקלטות מתח הפרוסה הרשתית של נמר מימיים סלמנדרה. אנו מדגימים את הכנת הפרוסה וכן כיצד לבצע הקלטות מהדק תיקון במהלך גירוי ויזואלי של הרשתית.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

סרטון זה מדגים טכניקת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה. פיפטת זכוכית דקה עם אלקטרודה משמשת להתקרבות לתאים אמקריניים מתפוצצים בכוכבים (SACs) בתוך הרשתית. לאחר יצירת חותם, היניקה מוחלת כדי לקרוע את הממברנה וליצור את תצורת מהדק טלאי התא כולו. לבסוף, זרימת היונים דרך קולטני SAC סינפטיים נמדדת באמצעות התצורה.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה

הסרטון מדגים פרוטוקול לחקר אינטראקציות סינפטיות ותגובות עצביות בפרוסת מוח של עכבר נגוע בהיפוקמפוס. היא כוללת הארת נוירונים חושיים ארוכי טווח כדי להפעיל פוטנציאלי פעולה ורישום הפוטנציאלים הפוסט-סינפטיים המעוררים המתקבלים בתא העצב המוקלט באמצעות טכניקת מהדק טלאי של התא כולו.

פוטו-טימולציה והקלטות מהדק טלאי של תא שלם של תאי עצב בפרוסות היפוקמפוס עכבר

סרטון זה מדגים הקלטה של תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בהכנת פרוסת רקמת רשתית עכבר מותאמת כהה. פרוסת הרשתית ממוקמת בתא הקלטה, ופיפטת הקלטה משמשת ליצירת רצף חשמלי עם תא גנגליון רשתית. פולסי אור מוחלים כדי ליצור פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים בתאי הגנגליון, אשר נרשמים על ידי פיפטה.

תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב של פרוסות רשתית עכבר

סרטון זה מדגים את ההליך לחקר יעילות סינפטית בקליפת המוח האנטורינלית הצידית (LEC) על-ידי גירוי אופטוגנטי של אקסונים של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) ורישום התגובות של נוירונים פירמידליים ב-LEC. שיטה זו משלבת הקלטות מהדק טלאי עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית.

גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי של אירועים סינפטיים בפרוסות מוח של חולדות

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

למד הקלטת תגובות אור בנוירונים רשתית בעכבר מותאמי-חושך באמצעות טכניקות patch clamp. שיטה זו מאפשרת מדידות אלקטרופיזיולוגיות מדויקות של תאי עצב ברשתית.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

גלה סרטונים נוספים