Name: כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: למד כיצד לכמת טאקרולימוס בכתמי דם יבשים באמצעות HPLC-MS/MS לניטור תרופתי. שיטה זו מאפשרת איסוף דגימות מינימלי פולשני ומסייעת לשיפור ההתאמה של מטופלים בטיפולים אימונוסופרסיביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי HHSF223201310224C החוזים של מינהל התרופות הפדרלי של ארצות הברית (FDA) ומענק 1U01FD004573-01 של המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית / ה-FDA.

למחברים אין מה לחשוף.

אמנם, כאמור, את הרעיון של תרופה טיפולית ומעקב דבקות של tacrolimus מבוסס על כתמי דם יבשים הוא אטרקטיבי, יש אתגרים אנליטיים שהולכים מעבר לאלו שבדרך כלל קשורים לניתוח LC-MS / MS של tacrolimus בדגימות דם כל EDTA ורידים. אלה כוללים, אך לא רק, את העובדה שהמטריצה ​​היא כל נימי הדם נספג חומר linters הכותנה של חומר כרטיס המסנן משמש כאן והנמוך נפח הדם (20 μl). עם זאת, ניתוח תפוקה גבוהה במעבדה מרכזית דורש שיטת חילוץ מהירה ואמינה כי תוצאות דגימות שאין הפרעות מטריצה ​​ואפקטי מטריקס בשילוב עם a...

Tacrolimus הוא immonosuppressant חזק 1-7 שיש לו מבנה macrolide 8 (איור 1). בשל חבר העמים - איזומרים טרנס של אגרות חוב CN הוא יוצר שתי rotamers בפתרון 9 שיכולים להיות מופרד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים שלב הפוך (HPLC) Tacrolimus הוא lipophilic ומסיס באלכוהול (מתנול: 653 גר &#39;/ ל&#39;, אתנול: 355 g / L), פחמימנים הלוגנים (כלורופורם: 573 גר &#39;/ ל&#39;) ואתר. זה במשורה מסיס בפחמימנים אליפטי (הקסאן: 0.1 גר &#39;/ L ומים (pH 3:. .0047 G / L) 9 המולקולה אינה מכילה chromophore ומקסימום UV-הקליטה שלו הוא 192 ננומטר מעשי Tacrolimus באמצעות עיכוב של calcineurin. . מנגנון פעולתה נבדק באזכור 10,11. הוא משמש כיום בלמעלה מ -80% ממושתלי איברים מוצקים בארצות הברית 12. המדד הטיפולי של tacrolimus הוא considereד להיות צר 13. בנוסף, הקשר בין מינוני tacrolimus וריכוזי דם הוא עני והפרמקוקינטיקה משתנה 14,15. ניטור תרופה טיפולי להנחות מינון tacrolimus במושתלים הוא פרקטיקה קלינית ולכן כללית 16-20. המטרה היא לשמור על ריכוזי דם tacrolimus בטווח טיפולי מוגדר מראש. ריכוזי דם tacrolimus מתחת לטווח הטיפולי עלולים לגרום לפעילות מוגברת של תגובות allo-חיסוני כרוניות או אקוטיות, בעוד ריכוזים מעל החלון הטיפולי להגביר את הסיכון לסרטן ורעילות, כגון Nephrotoxicity, רעילויות, יתר לחץ דם, סוכרת ועל-דיכוי חיסוני. שונות התוך-אישיות pharmacokinetic גבוהות של tacrolimus עלולות לפגוע בשני איברים להשתלה והישרדות חולה 21,22. בעוד שונות הבין-אישיות של הפרמקוקינטיקה tacrolimus נגרמות בעיקר על ידי פולימורפיזם CYP3A5, סיבות לתוך אישיהשתנות כוללות, אך אינם מוגבלות ליחסי גומלין, תרופתיות, מחלות-סמים ומזון תרופתיים 14,15. גם חוסר הדבקות במשטר התרופה לדיכוי מערכת החיסון הטיפולי הוא גורם תורם וסיבה עיקרית לאובדן 23,24 שתל. שיקולים אלה מצביעים על כך שתרופה טיפולית הבית תכוף וניטור דבקות של ריכוזי דם כל tacrolimus עשויה להיות מועילות כדי להבטיח שיש לי חולים חשיפת tacrolimus בתוך החלון הטיפולי הרצוי בכל העת. עם זאת, הלוגיסטיקה ועלות ניטור תרופה טיפולית תכוף יותר כפי שהוא פרקטיקה קלינית נוכחית 15 היא מונע. אחת הסיבות הוא שהחולה צריך לראות phlebotomist יש דגימת דם ורידים הנדרשת נמשכת. כתמי דם יבשים צמחו לאחרונה כקונספט אטרקטיבי 25-28. אחרי אצבע פשוטה מקל החולה אוסף טיפת דם על כרטיס נייר סינון מיוחד ולאחר נקודת דם דRied, זה יכול להיות בדואר למעבדה מרכזית לניתוח של tacrolimus וכל החיסון אחר שהמטופל יכול כרגע לקחת. זה הפך להיות אפשרי בשל הפיתוח של מבחני LC-MS / MS רגישים והספציפיים ביותר עבור כימות של tacrolimus ומערכת חיסון אחר בכמויות דם קטנות מאוד כגון כתמי דם יבשים (בדרך כלל 20 μl דם) 25,29-43. יתרון נוסף הוא שנפח דגימת אסטרטגיות פולשנית, נמוכות אוסף כגון כתמי דם יבשים להקל ניטור טיפולי סמים ומחקרי פרמקוקינטיקה בילדים קטנים מאוד 28. Tacrolimus נמדד בדרך כלל בכל דם ורידי EDTA 15. סיבות לכך הן שtacrolimus מפיץ בהרחבה לתאי דם וכי מחקרים קליניים דיווחו מתאם טוב יותר בין ריכוזי שוקת tacrolimus בדם מאשר בפלזמה עם אירועים קליניים 15,18. לשם השוואה, הניתוח של ת&quot;אcrolimus בכתמי דם יבש מבוסס על דם נימים כי הוא מעורבב עם מטריצת נייר סינון. זה מציב אתגרים במונחים של solubilization של tacrolimus והפרעות פוטנציאליות עם ניתוח LC-MS / MS. כאן אנו מציגים assay הוקם ומאומתים על בסיס הומוגניזציה של נקודת הדם היבש באמצעות בלנדר כדור בשילוב עם מדגם גבוהה זרימת טור מקוון הליך לנקות וניתוח LC-MS / MS. נכון להיום, assay זה בהצלחה משמש לכימות של יותר מחמישה אלף דגימות דם נקודת tacrolimus מיובשות לניטור דבקות בניסויים קליניים.

<table><tbody><tr><td>Tacrolimus</td><td>U.S. Pharmacopeial Convention</td><td>1642802</td><td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td></td><td></td>F370002</tr><tr><td>תאי דם אדומים</td><td>בית החולים של אוניברסיטת קולורדו</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>פלזמה</td><td>בית החולים של אוניברסיטת קולורדו</td><td>W2017130556300Q</td><td></td></tr><tr><td>אצטון CHROMASOLV, HPLC &ge; 99,9%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>439126-4 ליטר</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל אופטימה LC/MS, UHPLC-UV</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול 99.9%, HPLC</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>מתנול אופטימה LC/MS</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>אופטימה מים LC/MS, UHPLC-UV</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>אבץ גופרתי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 &ndash; 10 &ndash; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל שפופרת Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash; 100 &ndash; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l קצות פיפט עם פילטר, נפטון סטרילי</td><td></td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 &ndash; 1,000 & מיקרו; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l קצות פיפט עם פילטר, נפטון סטרילי</td><td></td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; l קצות פיפט עם פילטר, סטרילי</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash; 20 ומיקרו; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל שפופרת Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash; 200 ומיקרו; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l קצות פיפט עם פילטר, סטרילי</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l קצות פיפט עם פילטר</td><td>Multimax</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l קצות פיפט עם פילטר, סטרילי</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל שפופרת פלקון</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; l מוסיף לבקבוקוני HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>Balance PR2002</td><td>Mettler Toledo</td><td>1117050723</td><td></td></tr><tr><td>Balances AX205 Delta Range</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Homogenizer</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה Biofuge Fresco</td><td>Heraeus</td><td>290395</td><td></td></tr><tr><td>מגבונים</td> <td>חד פעמייםPDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית, 4 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית, 20 מ"ל</td><td>כפפות Thermo Fisher Scientific</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr>, כפפות<td>מותג ניטריל</td><td>טיטאן</td><td>44-100S</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני HPLC, 9 מ"מ, 2 מ"ל, שקוף</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 9921-13</td><td></td></tr><tr><td>מכסים לבקבוקוני HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>מחט, 18 גרם 1.5</td><td>דיוק גלישה</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>מתלה לצינורות אפנדורף</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>מתלה לבקבוקוני HPLC</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פלדה 0.9 &ndash; 2 מ"מ</td><td>הבא מתקדם</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>קופסאות אחסון למקפיאים / מקררים</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת רב-צינורית סטנדרטית</td><td>VWR Scientific Products</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>נייר Whatman, 903 שומר חלבון ארה"ב 100/PK</td><td>GE Whatman&nbsp;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>דגימה אוטומטית</td><td>CTC PAL&nbsp;</td><td>פאל. משאבה בינארית HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>, משאבה בינארית Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>, Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>מסיר ואקום מיקרו, תנור עמודים Agilent 1260</td><td></td><td>G13798</td><td></td></tr>, <tr><td>&nbsp; Agilent 1290 עם 2 מצבים&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>תא עמודים תרמוסט עם שסתום מיתוג משולב עם 6 יציאות</td> מחסנית קדם עמודה <td>HPLC של Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>, Zorbax XDB C8 (5 ומיקרו; גודל חלקיקים מ'), 4.6 &middot; 12.5 מ"מ</td><td>Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td></tr><tr><td>עמודה אנליטית HPLC, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 ומיקרו; גודל חלקיקים מ'), 4.6 &middot; 150 מ"מ</td><td>Phenomenex</td><td>993967-906</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר</td><td></td><td></td><td></td>מסה טנדם</tr><tr><td>API5000 MS/MS עם מקור TurboIonspray</td><td>AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ספקטרומטריית מסה</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות של tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות lc-ms / ms

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Tacrolimus מעכב calcineurin הוא אבן הפינה של רוב פרוטוקולי טיפול מדכא חיסון לאחר השתלת איברים מוצקה בארצות הברית. Tacrolimus הוא תרופת מדד טיפולית צרה וכגון דורש ניטור תרופה טיפולי והתאמת מינון המבוסס על ריכוזי שוקת דם כולה. כדי להקל על תרופה טיפולית בית וניטור דבקות, האוסף של כתמי דם יבשים הוא מושג אטרקטיבי. אחרי אצבע מקל, המטופל אוסף טיפת דם על נייר סינון בבית. אחרי הדם מיובש, הוא ישלח למעבדה אנליטית שבי tacrolimus הוא לכמת באמצעות ספקטרומטר מסת כרומטוגרפיה הנוזלי-טנדם ביצועים גבוהים (HPLC-MS / MS) בשילוב עם צעד פשוט מדריך למשקעי חלבון ומיצוי טור מקוון. לניתוח tacrolimus, דיסק 6 מ&quot;מ אגרוף מהמרכז הרווי של נקודת הדם. נקודת הדם הומוגני באמצעות בלנדר כדורND אז חלבונים הם זירז עם מתנול / 0.2 M 4 ZnSO מכיל הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus. לאחר vortexing וצנטריפוגה, של supernatant 100 μl מוזרק לתוך עמודת חילוץ מקוונת ונשטפה עם 5 מיליליטר / דקה של 0.1 חומצה / אצטוניטריל פורמית (7: 3, v: v) עבור 1 דקות. מכאן והלאה, שסתום המיתוג מופעל וanalytes-סמוק בחזרה על טור אנליטי (ומופרד באמצעות 0.1% שיפוע חומצה / אצטוניטריל פורמית). Tacrolimus הוא לכמת במצב החיובי רב התגובה (MRM) באמצעות ספקטרומטר מסת טנדם. Assay הוא ליניארי 1-50 ng / ml. שונות הבין-assay (3.6% -6.1%) ודיוק (91.7% -101.6%) כפי שהוערכו על 20 ימים עומדים בקריטריוני קבלה. התאוששות החילוץ הממוצעת היא 95.5%. אין לשאת על, הפרעות מטריצה ​​ואפקטי מטריצה ​​רלוונטיות. Tacrolimus הוא יציב בכתמי דם יבשים ב RT ובמעלות צלזיוס +4 לשבוע 1. דגימות שחולצו בautosampler יציבה במעלות צלזיוס +4 לפחות 72 שעות.

chromatograms יון נציג של מדגם ריק, מדגם זינק בגבול התחתון של כימות ומדגם חולה מוצג באיור 3. עקומות כיול הגבול התחתון של זיהוי היה 0.5 ng / ml והגבול התחתון של כימות היה 1.0 ng / ml. חמישים ng / ml נבחר ככיל הגבוה ביותר כריכוזים גבוהים יותר צפויים להגיע במרפאת בנסיבות רגילות. <p class="jove_content" style=";text-align:right;...

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת טקרולימוס בכתמי דם יבשים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני כימות של טקרולימוס בדגימות דם לאחר לקיחת דם IV הוא שמטופלים יכולים לאסוף דגימות בעצמם, אסטרטגיות איסוף דגימות זעיר פולשניות בנפח נמוך כגון כתמי דם מיובשים מקלות גם על ניטור תרופות טיפוליות ומחקרים פרמקוקינטיים בילדים קטנים. לאחר מקל אצבע פשוט, המטופל אוסף טיפת דם על כרטיס נייר פילטר מיוחד, ולאחר ייבוש כתם הדם, ניתן לשלוח אותה בדואר למעבדה מרכזית לניתוח של טקרולימוס וכל תרופה מדכאת חיסון אחרת שהמטופל עשוי ליטול.כימות תרופות על כתמי דם מיובשים התאפשר עקב פיתוח מבחני LCM SM S רגישים וספציפיים ביותר לכימות של טקרולימוס ותרופות מדכאות חיסון אחרות בנפחי דם קטנים מאוד כגון כתמי דם מיובשים. ראשית, הכינו תמיסות מלאי במתנול טהור בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר לטקרולימוס וריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. עבור D שתי תמיסות מלאי של 13 מעלות צלזיוס ואחסן בטמפרטורה שלילית של 70 מעלות צלזיוס ומטה בכל יום מיצוי, הכינו יחס של שבעה עד שלושה של מתנול ו-0.2 אבץ גופרתי מולארי במים כדי לזרז חלבונים ולמצות טקרולימוס.תמיסת המלאי הסטנדרטית הפנימית מוכנסת לתמיסת המשקעים. הגדר את תפוגת התמיסה ל- 12 שעות. לאחר מכן, הכינו תמיסות מלאי של טקרולימוס על ידי ביצוע דילול מתאים של תמיסת המלאי באמצעות מתנול טהור להכנת כיולים ודגימות בקרת איכות.ספייק 20 מיקרוליטר מתמיסת המלאי המדוללת כראוי לתוך EDT. דם מלא דוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת ניעור עדין באמבט מים למשך 20 דקות כדי לאפשר פיזור הומוגני של טקרולימוס לרכיבי הדם התאיים. כדי להכין כמות גדולה יותר של כיולים ודגימות בקרת איכות, יש להעלות 2000 מיקרוליטר מתמיסת המלאי המדוללת כראוי לתוך EDT.דם מלא דוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת ניעור עדין באמבט מים למשך 20 דקות כדי לאפשר פיזור הומוגני של טקרולימוס לרכיבי הדם התאיים. לאחר מכן הכניסו את הדגימות לצינורות פוליפרופילן בנפח 1.5 מיליליטר עם תחתית חרוטית ומכסים נצמדים. אתר 50 מיקרוליטר של הדם המלא באמצע כל עיגול על כרטיסי סינון באמצעות פיפטה לאחר ייבוש כתמי הדם בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות, הכן תקני כיול טקרולימוס בדם מלא EDTA אנושי בריכוזי טקרולימוס של 2.5, 5, 10, 25 ו-50 ננוגרם למיליליטר.הכן דגימה ריקה למיצוי כמו תקני הכיול עם תמיסת משקעי החלבון, שאינה מכילה את התקן הפנימי D שני 13 C tacrolimus. לאחר מכן, הכינו דגימות בקרת איכות בדם מלא של EDTA אנושי בריכוזים של 0, 2, 4, 20 ו-40 ננוגרם למיליליטר. הכן גם דגימה ריקה לאחר איסוף כתמי הדם המיובשים, בדוק ויזואלית כל אחד מהם כדי להבטיח איכות ונפח דגימה מקובלים.לאחר מכן נקב את מרכז כתם הדם בכרטיס המסנן עם אגרוף חור של שישה מילימטרים. הנח את הדיסקים בצינורות פוליפרופילן בנפח 1.5 מיליליטר עם תחתית חרוטית והצמד את המכסים. הוסף 20 עד 30 כדורים לכל צינור.לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר מתמיסת משקעי החלבון לכל צינור. הומוגניזציה של הדיסקים בבלנדר כדורים למשך דקה אחת במהירות מקסימלית. בסיום, יש לנער את הדגימות בטמפרטורת החדר על מערבולת מרובת צינורות במהירות מרבית למשך 10 דקות.לאחר מכן צנטריפוגה של הדגימות ב-16, 000 GS ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את ה- SNAT לבקבוקוני HPLC מזכוכית המצוידים בתוספת של 300 מיקרוליטר. בשלב זה, טען 100 מיקרוליטר של הסופרנט של הדגימה המופקת על שטיפת עמודת מיצוי המחסנית C שמונה עם יחס של שבעה עד שלושה של 0.1% חומצה פורמית במים וניטריל חומצה בזרימה של חמישה מיליליטר לדקה.למשך דקה אחת לאחר מכן הפעל את שסתום המיתוג וכתוצאה מכך שטיפה לאחור של האנליטים מה-pre-cal אל העמודה האנליטית. לאחר מכן הגדר את תרמוסטט העמודה ל 65 מעלות צלזיוס. הסר את האנליטים מהעמודה האנליטית באמצעות קצבי הזרימה והשיפוע המוצגים כאן.חבר את העמודה האנליטית לספקטרומטר מסה טנדם באמצעות מקור היינון של טורבו אלקטרוספריי. התאם את הפרמטרים העיקריים של ספקטרומטר המסה לפי הטבלה הבאה. לאחר מכן, זהה יונים חיוביים במצב התגובה המרובה.כדי לכמת טקרולימוס בכתמי הדם היבשים, השווה אותו לעקומת הכיול באמצעות תוכנת ספקטרומטריית המסה המייצגת כרומטוגרמות יונים של דגימה ריקה. דגימה שהגיעה לגבול התחתון של הכימות ודגימת מטופל מוצגות כאן. עקומת כיול טיפוסית מוצגת כאן.מקדם המתאם הממוצע הוא 0.9994. תוצאות הדיוק והדיוק מוצגות בפירוט כאן. לא נצפו אינדיקציות לדיכוי יונים משמעותי או שיפור יונים ולא נצפו העברה רלוונטית וכתוצאה מכך חריגה מהפסגות.15% מהאות בגבול התחתון של הכימות זוהו. שלמות הדילול נחקרה על ידי ניתוח דגימות שהוכנו בריכוזים מעל הכיול הגבוה ביותר ודוללו בתמיסת משקעים חלבונית לאחר המיצוי כדי להגיע לריכוזי היעד. כל הדילולים שנבדקו עמדו בקריטריוני הקבלה.לא נראו הפסדים לאחר שבוע של אחסון בטמפרטורת החדר, לאחר שבוע אחסון בארבע מעלות צלזיוס ולאחר חודש אחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס. בנוסף, לא נצפו הפסדים לאחר חודש אחד של אחסון בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לאחר שלושה מחזורי הקפאה והפשרה, ולאחר 72 שעות של דגימות שנלקחו בדגימה האוטומטית בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השליטה ניתן לחלץ 20 דגימות בפחות משעה.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהמפתח לכימות אמין הוא איכות כתם הדם המיובש וכי הדיסק מנוקב מאזור רווי לחלוטין של נייר הסינון. הטכניקות והבדיקה המוצגות בסרטון זה מספקות טכנולוגיית פלטפורמה לכימות תרופות מדכאות חיסון אחרות בכתמי דם מיובשים.

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Tregs הם מדכאי עוצמה של מערכת החיסון. קיים מחסור של סמנים משטח ייחודי להגדיר אותם, ולכן, הגדרות של Tregs הם פונקציונליים בעיקר. כאן אנו מתארים...

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

אנו מדווחים על שיטה להערכת תרופה וספיחה באמצעות תרופות משאבה ודגם (diazepam ו tacrolimus). לאחר ניתוח התרופה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים, ריכוזי התרופה ורמות וספיחה בתוך הצינורות של ערכות הממשל מחושבים.

הערכה ותרופות והספיחה כדי PVC- ואי-PVC מבוסס צינורות במנהל סטים באמצעות משאבה

כאן, אנו מתארים assay כרומטוגרפי בשילוב עם ההפרדה ניידות יון של פפטיד מבשרי ואחריו ברזולוציה גבוהה (~ 30,000) MS-הזיהוי של פפטיד קטעים על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדן חד שבטי תקציר.

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

שילוב Ivacaftor ivacaftor-lumacaftor הן שתי תרופות CF חדש. עם זאת, יש עדיין מחסור ההבנה שלהם PK/PD, פרמקולוגיה. אנו מציגים טכניקה HPLC-MS ממוטבים לניתוח בו זמנית של ivacaftor שלה מטבוליטים הגדולות ואת lumacaftor.

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה שימושי לאחסון דם היקפיים, סרום/פלזמה עבור ניתוחים במורד הזרם כמו assay אליסה והערכת פולימורפיזם (הסנ פ) של נוקלאוטיד יחיד.

יבש הדם ולנקודות סרום ככלי שימושי עבור אחסון מדגם להעריך סמנים ביולוגיים לסרטן

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות לייזר לכידת microdissection בשילוב עם ניתוח LC/MS במרחב-לכמת הפצות סמים בתוך גרנולומות שחפת הריאה. הגישה יש ישימות רחבה כדי לכימות ריכוז סמים בתוך רקמות-פירוט מרחבית גבוהה.

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

שיטות נוכחיות של ניתוח הדבקות של המטופלים בטיפול תרופתי מורכב-שחפת (DR-TB) משטרי יכול להיות לא מדויק ואינטנסיבי משאבים. השיטה שלנו מנתחת שיער, מטריצה בקלות שנאסף ומאוחסן, עבור ריכוזי של 11 תרופות DR-TB. באמצעות LC-MS/MS, אנחנו יכולים לקבוע את רמות התרופות תת-ננוגרמה שניתן לנצל כדי להבין טוב יותר את הדבקות בסמים.

מאומת LC-MS/MS הפאנל לכמת 11 תרופות עמידות לפני שחפת בדגימות שיער קטן

באופן אמין לשחזור לייצר פגיעה בחוט השדרה הצווארי חד צדדית באמצעות impactor אופק אינסופי מתואר. השיטה מנצלת את מסגרת שנועדה מותאם אישית לצבוט לייצב את עמוד השדרה. הליך סטנדרטי ופגיעה פרמטרים ביומכנית לגרום פציעות די מתמשכת.

דגם Contusive של פגיעה בחוט השדרה באמצעות צוואר הרחם חד צדדית Impactor אופק אינסופי

כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המוקדם סרטן ערמונית ייזום, רומן ומערכות מודל אדם חדשניים וגישות הם זקוקים נואשים. הפוטנציאל של טרום ערמונית ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) כדי לגרום לאוכלוסיות תאי גזע pluripotent כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי הוא כלי רב עוצמה במחקר ניסיוני ערמונית.

היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים

למד כיצד לכמת טאקרולימוס בכתמי דם יבשים באמצעות HPLC-MS/MS לניטור תרופתי. שיטה זו מאפשרת איסוף דגימות מינימלי פולשני ומסייעת לשיפור ההתאמה של מטופלים בטיפולים אימונוסופרסיביים.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

גלה סרטונים נוספים