הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגשת בניתוח לגרעין השבלול במודל עכבר כדי לאפשר ניסויים מבוססי אופטוגנטיקה. זה מושג על ידי הכנת העכבר תחילה לקרניוטומיה ונסיגת העור, הרקמה הרכה והשריר המכסה את הקרקפת לרוחב. כשלב שני, מתבצעת כריתת גולגולת על העצם הבין-קודקודית השמאלית, כשני מילימטרים מקושרים לקו תפר הלמבדה.

אזור זה מכסה את גרעין השבלול. לאחר מכן, באמצעות חמישה צינורות יניקה צרפתיים שואבים את החלק הצדדי ביותר של המוח הקטן השמאלי המכסה את ה-DCN. התוצאה מציגה מבט ללא הפרעה על ה-DCN.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות סיוע כגון הנחיה סטריאוטקטית, הם הן השגת הדמיה ישירה של גרעין השבלול והן הצבת סימולטור נוירוס כגון מקור אור או מערך אלקטרודות על פני גזע המוח. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח הן בתחומי האופטוגנטיקה והן בתחומי השמיעה. שום תותבת, כגון העברת גנים יכולה לאפשר גירוי של גזע המוח השמיעתי על ידי אור ברזולוציה מספקת של הפנים והזמן.

לאחר הרדמת עכבר עם קטמין וקסילזין באמצעות מתן תוך צפק, בדוק את רפלקס הנסיגה של צביטת הבוהן ועקוב אחר קצב הלב וקצב הנשימה שלו כדי לאשר הרדמה תקינה. לאחר מכן מרחו משחה וטרינרית על שתי העיניים כדי למנוע יובש. לאחר מכן, גלח את השיער המכסה את הקרקפת כדי לספק גישה ללא הפרעה לאתר הניתוח.

לאחר מכן, הנח את העכבר במחזיק סטריאוטקסי של בעלי חיים קטנים. כוונן את מהדק החוטם כך שיהיה רופף מספיק כדי לאפשר נשימה מספקת, אך הדוק מספיק כדי לשתק לחלוטין את ראש העכבר. תחת מיקרוסקופ, בצע חתך אנכי דרך העור, החל מקו האמצע ישירות בין האפרכסת ונמשך עד לחלק הקיפוד של העורף.

ואז לעקור את העור לרוחב. הסר את השרירים המכסים את העצמות הקודקודיות השמאליות, הבין-קודקודיות והעורפיות של הגולגולת בעזרת אזמל או מספריים בקשתית. בינתיים, צמצמו את הדימום על ידי הפעלת לחץ עדין עם אפליקטור עם קצה כותנה למשך 10 עד 15 שניות.

לאחר מכן, זהה את קווי התפרים הסגיטלים והלמבדה. באמצעות זוג תכשיטים של רון. בצע קרניוטומיה על העצם הבין-קודקודית השמאלית כשני מילימטרים לקו התפר של הלמבדה.

אזור זה מכסה את ה-DCN לאחר קרניוטומיה. יש להקפיד על שכבה דקה של דורה המכסה את המוח הקטן, להסיר אותה בזהירות באמצעות להב אזמל. הסר את הדם הקרוש בעזרת קצות כותנה או טפטף בעדינות מי מלח על המוח הקטן כדי לנקות את הדם.

לאחר מכן השתמש בצינור יניקה של חמישה צרפתים כדי לשאוב את החלק הצדדי ביותר של המוח הקטן השמאלי, מעל ה-DCN כדי לסייע. בשאיפה, הגדר את מישור המוקד של המיקרוסקופ בעומק הצפוי של גרעין השבלול כדי לשפר את ההדמיה ולהבטיח תמונה חדה. הסר כרבע עד שליש מהמוח הקטן השמאלי.

נקודת הציון העיקרית הסמוכה ל-DCN היא ה-AM של התעלה החצי-עגולה העליונה. בעקבות השאיפה, יופיעו דימום נוסף, הצטברות נוזל עמוד השדרה המוחי ותזוזה של המוח הקטן ב-DCN להחדיר מי מלח במהירות לתוך הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. השתמש בשילוב של טפיחה עדינה עם נקודת שיניים ויניקה כדי לפנות נתיב להדמיה ישירה של ה-DCN.

לאחר שה-DCN נראה בבירור וללא דם ו-CSF, בצע לתוכו הזרקת מיקרו לחץ של הווקטור עם מזרק המילטון אטום לגז של חמישה מיקרוליטר. השתמש במחט בגודל 34 עם שיפוע רדוד כדי למזער טראומה קהה ולמקם את נפח ההזרקה בתוך ה-DCN. לאחר מכן הכניסו לאט את המחט עם מניפולטור מיקרו עד שהקצה כבר לא נראה מתחת לפני השטח של ה-DCN.

התחל להזריק 1.5 מיקרוליטר של הווקטור. לאחר השלמת זה, משוך לאט את המחט, לאחר מכן הערך מחדש את העור ואפשר לעכבר להתאושש לפי הליך התאוששות סטנדרטי. לאחר שבועיים עד ארבעה שבועות של ריפוי והדגירה של העברת גנים בתיווך וירוסים, יש להרדים מחדש את העכבר שהוזרק, ולאחר מכן להסיר את רקמת הצלקת מעל אתר הגולגולת.

לאחר מכן, זהה שילוב של רקמת המוח הקטן והצלקת שנותרה מעל ה-DCN. השתמש ביניקה של חמש צרפתיות כדי לשאוף את המוח הקטן ורקמת הצלקת. בעקבות שאיפה.

יש למרוח במהירות מי מלח לתוך הגולגולת. כדי למנוע זריקת דם השתמש בשילוב של טפיחה עדינה של נקודת שיניים ויניקה כדי לפנות את הדרך להדמיה ישירה של ה-DCN. ה-DCN נגיש כעת לניסויי פיזיולוגיה מבוססי אופטוגנטיקה המוצגים כאן הוא מיקום של סיב לייזר ישירות על פני ה-DCN, המאפשר גירוי אופטי של סדרת פולסי האור הכחול DCNA הנגועים באופסין על פני ה-DCN הנגוע מביא לתגובת גזע המוח השמיעתית המונעת אופטית.

באמצעות מיקרו-מניפולטור, סיב אופטי המחובר ללייזר אור כחול מונח ישירות על פני גרעין השבלול ומופעל. כאן אנו יכולים לזהות אור כחול פועם על פני השטח של גרעין השבלול. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הדמיה חשמלית של גרעין, המאפשרות לנו להשוות ישירות לא רק את התגובות העצביות המעוררות אקוסטית, אלא גם את התגובות העצביות המעוררות חשמלית עם זו שמעוררת סימולציה אופטית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ולבצע את הגולגולת ושאיבת המוח הקטן במטרה הסופית של הדמיה ישירה וגישה לגרעין השבלול.