Name: הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: למדו פרוטוקול ניתוחי לגישה ישירה לגרעין השבלול הגבי בעכברים לצורך ניסויים אופטוגנטיים. השיטה מאפשרת הדמיה מדויקת והזרקת וקטורים ויראליים למערכת השמיע המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן Bertarelli (Djl), מענק MED-EL (Djl), ומכון לאומי לבריאות מענקי DC01089 (MCB).

הערה: כל הליכי הניסוי מבוצעים בהתאם לועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בעיני מסצ&#39;וסטס ומרפאת אוזן ובית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, שפועל לפי הנחיות טיפול בבעלי החיים לאומיות, ובכלל זה לבריאות ציבור שירות מדיניות על הומניות טיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, ILAR מדריך, ובעלי חי חוק צער. הפרוצדורות מפורטות להלן פירוט חשיפה של DCN השמאל. השתמש בכלים סטריליים בעת ביצוע ניתוח הישרדות. 1. היסודי Craniotomy וחשיפה הגבי שבלול Nucleus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר, בגילי 8-12 שבועות, במשקל 18-24 גרם, עם 20 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine וקטמין 100 מ&quot;ג / קילוגרם באמצעות ממשל intraperitoneal. אשר הרדמה תקינה על ידי קצב ניטור לב, קצב נשימה, כמו גם רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן. משחה וטרינר מקום על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. ברגע כראוי בהרדמה, לא מעל שיער גילוחהוא הקרקפת כדי לספק גישה ללא הפרעה לאתר כירורגית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר באופן מאובטח בבעל החיים קטן stereotaxic, שנערך במקום על ידי מהדק חוטם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שמהדקים החוטם הוא רופף מספיק כדי לאפשר לנשימה נאותה אבל חזק מספיק כדי לשתק את הראש של העכבר לחלוטין. אם ראש העכבר הוא רופף, בעל החיים עלולים ליפול מבעל הראש במהלך חלק craniotomy של הליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אלקטרודות שתל גזע המוח שמיעתיות באופנה סטנדרטית, המאפשרת לניטור קצב לב. קצב נשימה צריך להיות במעקב על ידי הדמיה. שים לב שקצב לב נורמלי וקצב נשימה משתנים בהתאם לגילו של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדחום ממוקם וeuthermia מובטח באמצעות מיקום על שמיכת חימום homeothermic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך בעור וחשיפה של עצמות interparietal והעורפיות של הגולגולת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת microscאופ, לעשות חתך אנכי דרך העור מתחיל בקו האמצע, ישירות בין האפרכסת, והארכת לחלק הזנב של העורף. בעקבות חתך בעור קו האמצע, לעקור את העור רוחבי. דמיינו את השרירים המכסים את עזב את החלק האחורי של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שריר שמעל השמאל הקודקודית, interparietal, ועצמות עורפיות של הגולגולת על ידי disarticulation של קבצים מצורפים שרירים לעצמות שלהם עם מספריים או אזמל איריס. שים לב במידה קטנה של דימום לאורך קצות שרירים לחתוך. למזער את זה על ידי לחץ עדין עם המוליך כותנה שקצה במשך 10-15 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמעליה craniotomy השבלול Nucleus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות קווי תפר רלוונטיים, כולל קווי תפרים sagittal ולמבדה (איור 1, שמאל לוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש rongeurs, להפוך את פתיחת גולגולת על עצם interparietal, השמאלית של קו האמצע, ~ הזנב 2 מ&quot;מ לקו התפר למבדה. אזור זה overlies DCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Followincraniotomy g, להתבונן בשכבה דקה של דורה שoverlies המוח הקטן. באמצעות סכין אזמל, להסיר את הדורה. (איור 1, פנל באמצע). הערה: הסרת הדורה עלולה לגרום למידה קטנה של דימום. תהליך זה של שימוש בלהב סכין המנתחים כדי להסיר את הדורה נועד להפחית את כמות איבוד דם במהלך שאיפת המוח הקטן, שברכה על פני השטח של גזע המוח וזיהוי אלמוני של DCN. סה&quot;כ נפח דם של עכבר הוא ~ 1.5 מיליליטר לא יעלה&gt; מ -15%. אם הדימום עולה על סכום זה, העכבר צריך להיות מסופק עם עם תוספת נוזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דם קרוש כיסה את המוח הקטן עם המוליך קצה כותנה. לחלופין, בעדינות לטפטף מי מלח באמצעות נקודת שיניים על המוח הקטן כדי לנקות דם משם דם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הקטן שאיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 5 יניקה צרפתית, לשאוב את החלק לרוחב-ביותר של המוח הקטן השמאלי מעל DCN עד DCN הוא מולרע&quot;מ (איור 1, ימין לוח). הסר כ 1/4 עד 1/3 של המוח הקטן משמאל. ציון דרך העיקרי בסמוך לDCN הוא ampulla של התעלה חצי עגולה מעולה. הערה: שאיפה של המוח הקטן היא צעד מפתח לפרוטוקול. שאיפת בימוי של המוח הקטן מתבצעת ביותר בהצלחה אם היא מתרחשת בניסיון בודד ולא עם מעברים מרובים של היניקה כמו זה יגרום לדימום. כדי לסייע בשאיפה, להגדיר את מישור המוקד של המיקרוסקופ בעומק הצפוי של CN, שיהיה מעט דיסטלי אל פני השטח של המוח הקטן. הגדרת מישור המוקד לCN תשפר הדמיה ולהבטיח תמונה חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאיפה הבאה, דימום נוסף, נוזל השדרתי (CSF) הצטברות, ועקירת המוח הקטן על DCN צפויים. להחדיר 0.5 סמ&quot;ק של תמיסת מלח סטרילית במהירות לפתיחת הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. שילוב של ספיגה עדינה עם נקודה ויניקת שיניים יכול להיות אזנהג לסלק דרך להדמיה ישירה של DCN. ישירות לא לפנות אל פני השטח של DCN. </li></ol></li></ol> Microinjection לחץ 2. להעברת גנים בתיווך וירוס ושחזור כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר DCN הוא חופשי של דם וCSF שמעליה ונראים בבירור, להפוך microinjections לחץ לDCN באמצעות מזרק המילטון 10 μl על פני תקופה 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את המחט עם micromanipulator עד הקצה הוא כבר לא נראה לעין מתחת לפני השטח של DCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת ביצועים מיטביים, השתמש במחט 33 או 34 מד (להשתמש במזרק gastight עם מחט 34 מד) עם שיפוע רדוד, כגון 45 מעלות, כדי למזער את הטראומה קהה ולמקם את עוצמת הזריקה בתוך DCN, שהוא דק ו מבנה גזע המוח רדוד (&lt;300 מיקרומטר עבה). הערה: מכשירי microinjection אחרים עשויים להיות מבוססים מנוצלים. באופן אידיאלי, מכשיר ההזרקה צריך להיות גמיש כדי לאפשר לכמה בן קלד, נחוץ אם לפנות ישירות לקהל DCN. יתר על כן, כפי שהעכבר זז מעט לאורך כל ההליך בשל נשימה, המכשיר צריך להיות חזק מספיק כדי לעמוד בכמויות קטנות של תנועה. </li></ol> שחזור כירורגי 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד ההזרקה הבאה, מחדש משוערת העור ולאפשר העכבר כדי להתאושש להליך התאוששות סטנדרטי. רקמת המוח הקטן וצלקת שנותרה למלא את החלל שנגרם על ידי שאיפה של המוח הקטן. כל הזמן לפקח על בעלי חיים עד תודעה מספיק הוא חזר כדי לשמור על כיבה sternal. לעקוב אחר קצב לב, קצב נשימה, כמו גם יכולת להאכיל. הערה: אין חיה שעברה ניתוח חזר לכלוב עם בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עכבר מתחיל ללכת במעגלים לאחר ניתוח (&lt;5% מהמקרים), בדרך כלל 2-4 שעות לאחר סגירת החתך בעור, להקריב מייד העכבר, כפי שהוא עלול להביא להאכלת תקופה קשה. Tתופעת הלוואי שלו היא כנראה עקב שאיפה של המוח הקטן. בעלי החיים צריכים להיות במעקב לכאב לאחר הניתוח, ויש לתת סמים מתאימים כדי להבטיח נוחות בעלי חיים המבוססים על תקנים מוסדיים. אנטיביוטיקה עשויה להיות נחוצה, אם עדות לזיהום. </li></ol> 4. חשיפה Craniotomy והשבלול Nucleus משנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2-4 שבועות של ריפוי ודגירת העברת גני וירוס בתיווך, מחדש להרדים זמן דגירה אופטימלית הזריק בעבר צעד עכבר וחזור על 1.1-1.5 משתנה בהתאם לסוג של גן הועבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמת צלקת על אתר craniotomy על ידי שילוב של פינצטה, אזמל, וrongeurs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לדמיין את פתיחת הגולגולת, לזהות שילוב של רקמת המוח הקטן ונותר צלקת מעל DCN. השתמש 5 יניקה צרפתית כדי לשאוב המוח הקטן שמעליה / רקמת צלקת (בדומה לשאיפת המוח הקטן הקודמת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות שאיפה, מצפה דימום נוסף, ב CSFuild-אפ, וחתיכות הנותרות של המוח הקטן. במהירות להציג מלוח לפתיחת הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. השתמש בשילוב של ספיגה עדינה שיניים נקודה ויניקה כדי לנקות את הנתיב להדמיה ישירה של DCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב פני השטח של DCN. לבצע ניסויי פיזיולוגיה מבוסס optogenetics כDCN נגיש כעת. להציג את גירוי אור, למשל עם סיב אופטי (איור 2), לנהוג ניסוי מבוסס optogenetics. </li></ol> 5. היסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מסקנה של ניסויים, להרדים את העכבר עם מנת יתר של קטמין. Perfuse העכבר עם מלח רגיל ואחריו paraformaldehyde 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את גזע המוח מהגולגולת ופוסט-התיקון לשעה 2. Cryoprotect גזע המוח בסוכרוז 30% במשך 24-48 שעות. סעיף גזע המוח באמצעות cryostat סטנדרטי באמצעות 60 מיקרומטר חלקים. </li></ol>

<ol><li>Lalwani, A., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy.</a> Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).</li>
<li>Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+issues+in+cochlear+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Current issues in cochlear gene transfer.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).</li>
<li>Jero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+delivery+through+an+intact+round+window+membrane+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).</li>
<li>Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+microinjection+and+its+effects+upon+auditory+function+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).</li>
<li>Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vivo+gene+therapy+for+hearing+disorders%3A+introduction+of+adeno-associated+virus+into+the+cochlea+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig.</a> Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).</li>
<li>Wareing, M., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy%3A+current+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy: current perspectives.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+expression+in+the+guinea+pig+cochlea+mediated+by+a+lentivirus-derived+gene+transfer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector.</a> Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+dopaminergic+modulation+of+the+multiple+phases+of+reward-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior.</a> J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+mimicry+of+the+transient+activation+of+dopamine+neurons+by+natural+reward+is+sufficient+for+operant+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement.</a> PloS One. 7 (4), e33612(2012).</li>
<li>Britt, J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogations+of+the+neural+circuits+underlying+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).</li>
<li>Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+c1+and+retrotrapezoid+nucleus+neurons+causes+sleep+state-dependent+cardiorespiratory+stimulation+and+arousal+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats.</a> Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).</li>
<li>Carter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).</li>
<li>Darrow, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+central+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of central auditory neurons.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).</li>
<li>Shimano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+AAV-mediated+expression+of+channelrhodopsin-2+and+halorhodopsin+in+brainstem+neurons+mediating+auditory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling.</a> Brain Res. 1511, 138-152 (2013).</li>
<li>Doucet, J., Ryugo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+ventral+cochlear+nucleus+to+the+dorsal+cochlear+nucleus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats.</a> J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).</li>
<li>Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commissural+axons+of+the+mouse+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Commissural axons of the mouse cochlear nucleus.</a> J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).</li>
<li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+responses+to+electric+and+infrared+neural+stimulation+of+the+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus.</a> Hear Res. 310, 69-75 (2014).</li>
<li>Taberner, A. M., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+properties+of+single+auditory+nerve+fibers+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse.</a> J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).</li>
<li>Rolls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+disruption+of+sleep+continuity+impairs+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).</li>
<li>Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttraining+optogenetic+manipulations+of+basolateral+amygdala+activity+modulate+consolidation+of+inhibitory+avoidance+memory+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).</li>
<li>Stortkuhl, K., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smell+of+Blue+Light%3A+A+New+Approach+toward+Understanding+an+Olfactory+Neuronal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network.</a> Front Neurosci. 5 (72), (2011).</li>
<li>Hira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+optogenetic+stimulation+for+functional+mapping+of+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex.</a> J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).</li>
<li>Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+light-based+mapping+of+motor+cortex+by+photoactivation+of+channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).</li>
<li>Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

מאמר זה מתאר את הטכניקה של הדמיה הישירה של DCN במודל העכברי למניפולציה של מערכת השמיעה המרכזית. הגישה המתוארת של הדמיה ישירה מספקת יתרונות משמעותיים על פני החלופה המרכזית, שהם גישות stereotaxic. בעיקר, להדמיה ישירה של DCN מאפשרת לאישור מיידי של האתר של גזע המוח, ואילו גישות stereotaxic לא להרשות לעצמו להדמיה ישירה. בניסויים שמחייבים ממושכים תקופות דגירה, כמו במקרה של העברת גנים בוירוס בתיווך, יש פוטנציאל ליעילות זיהום נמוך אם ההזרקה &quot;מתגעגעת&quot; מיקום היעד. יתר על כן, גישה ...

העברת גנים בתיווך וירוס לאובדן שמיעה הפוך התמקדה בעיקר במערכת השמיעה ההיקפית. 1 בהתמקדות בשבלול, החוקרים בחנו שורה של דרכי אספקה, כולל עירוי מיני משאבהאוסמוטית 2, Gelfoam®2 ספוג קומפלקס וקטור-טרנסגן או ספוג ג'לטין3, מיקרו-הזרקה ישירה4; וקטורים רבים להעברת גנים, כולל וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו5,6, וקטורים לנטי-ויראליים7 וליפוזומים קטיוניים2; והפצת וקטורי העברת גנים מעבר לרקמת המטרה2. לאחרונה, נגיף הקשור לאדנו-(AAV)-1 הוכנס לשבלול על מנת לטפל בחירשות בעכברים עקב אובדן טרנספורטר גלוטמט שלפוחית-3. 8 יתר על כן, לאחרונה תואר היישום של אופטוגנטיקה במערכת השמיעה ההיקפית. 9
עם זאת, מחקרים מעטים בחנו העברת גנים למערכת השמיעה המרכזית. גרעין השבלול הגבי (DCN) של גזע המוח מכיל נוירונים מסדר שני של מסלול השמיעה. בעוד שטכניקות העברת גנים בגרעין השבלול (CN) עשויות לשמש לשורה של חקירות, ניתן להשתמש גם בהעברת גנים של אופסינים, חלבונים רגישים לאור, ל-DCN כדי לאפשר טכניקות ניסוי מבוססות אופטוגנטיקה. בעקבות העברת גנים בתיווך וירוס של אופסין, כגון channelrhodopsin-2 (ChR2), הנוירונים של ה-DCN הופכים רגישים לגירוי אור. העברת גנים אופטוגנטית נוסתה בעבר במספר אזורים בגזע המוח, כולל גרעין הרטרוטרפז של החולדה, לוקוס קורולאוס של העכבר, קוליקולוס עליון של קוף ואזור הגחון של העכבר. 10-14
לאחרונה, חוקרים בחנו את השימוש באופטוגנטיקה ב-DCN. 15,16 ה-DCN הוא המיקום של מיקום שתלי גזע המוח השמיעתי בבני אדם, מה שהופך אותו לחלק אטרקטיבי של מערכת השמיעה למחקר למחקרים תרגומיים על תותבות עצביות שמיעתיות. עם זאת, בהתחשב במיקום ה-DCN, חשיפה כירורגית מאתגרת. הטכניקה המתוארת כאן מספקת פרוטוקול לחשיפה מקסימלית של ה-DCN באמצעות גישת פוסה אחורית כדי לאפשר העברת גנים וקטורית ויראלית וניסויים מבוססי אופטוגנטיקה במודל עכברים. מחקרים קודמים השתמשו במיקרו-הזרקה סטריאוטקטית לתוך ה-DCN עם channelrhodopsin-2. 16 הזרקות סטריאוטקסיות, לעומת זאת, עלולות להיות פחות מדויקות מהזרקות הנעשות על ידי הדמיה ישירה, במיוחד בגרעין קטן ועמוק לאורך גזע המוח כמו ה-DCN. עכברים טרנסגניים המבטאים חלבונים ספציפיים לרקמה ב-CN הם גם אופציה אטרקטיבית וימנעו את הצורך בהעברת גנים. הפרוטוקול שלנו לחשיפה של ה-DCN יעבוד גם בעכברים טרנסגניים מכיוון שה-DCN יצטרך להיחשף ישירות לגירוי אופטי. טכניקה זו לחשיפה כירורגית של ה-DCN מותאמת מפרוטוקולים קודמים הכוללים הקלטות מעצב השמיעה וגרעין השבלול במודלים של עכברים וחולדות. 15,17-20
המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא לספק חשיפה ישירה ל-CN כדי לאפשר טכניקות העברת גנים. ליתר דיוק, הגישה תואמת הן לניתוח אקוטי והן לניתוח הישרדותי וניתן לחזור על ההכנה באותה חיה לבדיקות נוירופיזיולוגיות עוקבות. לחשיפה הישירה של פרוטוקול DCN יש השלכות על ניסויים מבוססי העברת גנים בתיווך אופטוגנטיקה ווירוסים בגרעינים אחרים של גזע המוח.

<table><tbody><tr><td>מחזיק סטריאוטקסי</td><td>Stoelting</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>שמיכה הומותרמית</td> להב אזמל <td>507214</td><td></td><td>הרווארד</td></tr><tr><td>#11</td><td>כלים כירורגיים עדינים</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קשתית</td><td>כלים כירורגיים עדינים</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>5 יניקה צרפתית</td><td>סימטריה כירורגית</td><td>2777914</td><td></td></tr><tr><td>נקודות שיניים</td><td>הנרי Schein</td><td>100-8170</td><td></td></tr><tr><td>Bone rongeur</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; l מזרק המילטון</td><td>המילטון&nbsp;</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>מד 34, מחט</td><td>המילטון&nbsp;</td><td></td><td></td>207434</tr><tr><td>כלים כירורגיים משובחים</td><td>Rongeurs</td><td>16021-14</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה ישירה של murine הגבי שבלול nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

חקירת השימוש בהעברת גני וירוס בתיווך לעצור או להפוך אובדן השמיעה במידה רבה נדחקה למערכת השמיעה ההיקפית. מחקרים מעטים בחנו העברת גנים למערכת השמיעה המרכזית. גרעין גב השבלול (DCN) של גזע המוח, המכיל נוירונים מסדר שני של המסלול השמיעתי, הוא אתר פוטנציאל להעברת גנים. בפרוטוקול זה, טכניקה לחשיפה ישירה ומקסימלי של DCN העכברי באמצעות גישה הפוסות אחורי מודגמת. גישה זו מאפשרת לאף אחד מניתוח אקוטי או הישרדות. בעקבות הדמיה ישירה של DCN, מארח של ניסויים אפשריים, כולל הזרקה של opsins לתוך גרעין השבלול ולאחר מכן על ידי הגירוי של סיבים אופטיים מצמידים את אור לייזר כחול. ניסויי נוירופיזיולוגיה אחרים, כגון גירוי חשמלי והעתקי מזרק עצביים הם גם אפשריים. רמת visualization ואת משך הזמן של גירוי השגה להפוך גישה זו ישימה למגוון רחב של ניסויים.

חלקית המוח הקטן שאיפה מדגימה גישה לגרעין השבלול לאחר העור והשרירים שמעל הגולגולת יוסרו, ציוני דרך פני גולגולת, כגון קווי תפר העטרה ומדא, מדגים את הלוקליזציה המשוערת של פתיחת הגולגולת. בעקבות פתיחת גולגולת עם rongeurs, המוח הקטן הוא מדמיין. שאיפה זהירה של החלק הקטן של המוח הקטן מדגימה הדמיה של CN, אז מה שיכול להיות מוזרק (איור 1). <p class="jove_content" style=";text-align:right;direc...

מטרת פרוטוקול זה היא להתוות גישה כירורגית כדי לספק גישה ישירה לגרעין השבלול הגבי במודל עכברי.

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להגיע בגישה כירורגית לגרעין השבלול (cochlear nucleus) במודל של עכבר, על מנת לאפשר ניסויים מבוססי אופטוגנטיקה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת העכבר לקרניוטומיה (craniotomy) והסרה לצדדים של רקמות העור הרכות והשרירים המכסים את הקרקפת. בשלב השני, מבוצעת קרניוטומיה בעצם הפריאטלית השמאלית, כשני מילימטרים מדיסאלי לקו תפר הלמדא (lambda suture line).אזור זה נמצא מעל הגרעין הקוכליארי. לאחר מכן, באמצעות שפוא שפתוחו 5 French, שאבו את החלק הלטרלי ביותר של המוח הקטן השמאלי המכסה את ה-DCN. התוצאה היא שדה ראייה לא חסום של ה-DCN.היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות סיוע כגון הנחיה סטריאוטקטית, הם השגת ויזואליזציה ישירה של הגרעין הקוכלארי והנחה של סימולטור עצבי, כגון מקור אור או מערך אלקטרודות, על פני השטח של גזע המוח. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי האופטוגנטיקה והשמיעה. ללא פרוטזה, כגון העברה גנטית, ניתן לגרום לגזע המוח השמיעתי להיות מעורר על ידי אור ברזולוציה פסיאלית וזמנית מספקת.לאחר הרדמת עכבר באמצעות מתן תוך-peritoneal של ketamine ו-xylazine, יש לבדוק את רפלקס נסיגת כף הרגל למעיכה (toe pinch withdrawal reflex), ולנטר את קצב הלב וקצב הנשימה כדי לוודא הרדמה תקינה. לאחר מכן, יש למרוח משחה וטרינרית בשתי העיניים כדי למנוע התייבשות. בשלב הבא, יש לגלח את הפרווה מעל הקרקפת כדי לאפשר גישה ללא הפרעות לאתר הניתוח.לאחר מכן, הנח את העכבר במחזיק סטריאוטקסי לבעלי חיים קטנים. כוונן את תפס האף כך שיהיה רפוי מספיק כדי לאפשר נשימה תקינה, אך הדוק מספיק כדי לקבע לחלוטין את ראשו של העכבר. תחת מיקרוסקופ, בצע חתך אנכי דרך העור, החל מקו האמצע ישירות בין הפינה (pinna) והממשיך עד לחלק העליון של העורף (occiput).לאחר מכן, הסיטו את העור לצדדים. הסירו בעזרת סכין ניתוח או מספרי איריס את השרירים המכסים את העצם הפריטלית השמאלית, את האזור הבין-פריטלי ואת העצם האוקסיפיטלית של הגולגולת. במקביל, צמצמו את הדימום על ידי הפעלת לחץ עדין באמצעות מקלוני צמר עבור 10 עד 15 שניות.בשלב הבא, זהו את קווי התפרים הסגיטליים והלמדבדיים. באמצעות זוג Ron jewels, בצעו קרניוטומיה בעצם הפריאטלית השמאלית, כ-2 mm מהקו של התפר הלמדבדי.אזור זה נמצא מעל ה-DCN לאחר קרניאוטומיה. יש להבחין בשכבה דקה של קרומי המוח (dura) המכסה את המוח הקטן (cerebellum) ולהסירה בזהירות באמצעות להב סכין מנתחים. הסר את הדם הקרוש בעזרת מקלוני צמר או טפטף בעדינות סליין על המוח הקטן כדי לנקות את הדם.לאחר מכן, השתמשו בצינור שאיבה במידה five French כדי לשאוב את החלק הלטרלי ביותר של ה-cerebellum השמאלי, מעל ה-DCN, כדי לסייע בגישה. במהלך השאיבה, כוון את מישור המיקוד של המיקרוסקופ לעומק הצפוי של ה-cochlear nucleus כדי לשפר את הוויזואליזציה ולהבטיח תמונה חדה. הסירו כרבע עד שליש מה-cerebellum השמאלי.נקודת האסדה המרכזית הסמוכה ל-DCN היא ה-AM של התעלת חצי השבלית העליונה. לאחר השאיבה, עלולות להופיע דימומים נוספים, הצטברות של נוזל מוחי-שדרתי והזזה של המוחון על ה-DCN; במקרה זה, יש להזריק מלח (saline) במהירות לתוך הקרניוטומיה כדי למנוע קרישת דם. השתמש בשילוב של טפיחות עדינות בעזרת מכשיר דנטלי ושאיבה כדי לפנות נתיב למבט ישיר על ה-DCN.לאחר שה-DCN נראה בבירור ונקי מדם ונוזל CSF המכסים אותו, בצע הזרקה מיקרוסקופית תחת לחץ של הווקטור לתוכו באמצעות מזרק המילטון (Hamilton) אטום לגז בנפח של 5 µL. השתמש במחט בכיליבר 34 עם שיוף שטוח כדי למזער טראומה קהה ולמקד את נפח ההזרקה בתוך ה-DCN. לאחר מכן, הכנס את המחט לאט באמצעות מיקרו-מניפולטור עד שקצה המחט אינו נראה יותר מתחת לפני השטח של ה-DCN.התחילו בהזרקת 1.5 µL מהווקטור. לאחר השלמת הפעולה, שלפו את המחט באיטיות, קרבו שוב את קצוות העור ואפשרו לעכבר להתאושש בהתאם לנוהל ההתאוששות הסטנדרטי. לאחר שבועיים עד ארבעה שבועות של ריפוי ודגירה להעברה גנית באמצעות וירוס, הרדימו שוב את העכבר שהוזרק לו הווקטור, ולאחר מכן הסירו את רקמת הצלקת מעל נקודת הקרניוטומיה.לאחר מכן, זהו שילוב של שאריות דגיליום (cerebellum) ורקמת צלקת המכסה את ה-DCN. השתמשו בשואב במידה five French כדי לשאוב את הדגיליום ורקמת הצלקת שמעל. לאחר השאיבה.יש להחדיר במהירות תמיסת סלין אל תוך הקרניוטומיה. כדי למנוע הצטברות דם, השתמשו בשילוב של טפיחות עדינות בעזרת מכשיר דנטלי ושאיבה כדי לפנות את הנתיב לצפייה ישירה ב-DCN. ה-DCN נגיש כעת עבור ניסויי פיזיולוגיה מבוססי אופטוגנטיקה; המוצג כאן הוא מיקום של סיב לייזר ישירות על פני השטח של ה-DCN, המאפשר גרייה אופטית של ה-DCNA שהוחדר באופסין. סדרת פולסים של אור כחול על פני השטח של ה-DCN המוחדר גורמת לתגובת גזע המוח השמיעתית המונעת באופן אופטי.באמצעות מיקרו-מניפולטור, סיב אופטי המחובר ללייזר של אור כחול ממוקם ישירות על פני השטח של הגרעין הקוכלארי (cochlear nucleus) ומופעל. כאן ניתן לזהות פולסים של אור כחול על פני השטח של הגרעין הקוכלארי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון סטימולציה חשמלית של הגרעין, מה שמאפשר לנו להשוות באופן ישיר לא רק את התגובות העצביות שהושרות אקוסטית, אלא גם את אלו שהושרות חשמלית לעומת אלו שהושרות על ידי סטימולציה אופטית.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ההכנה והביצוע של קרניאוטומיה ושאיבת דגימה מהמוח הקטן, במטרה סופית של ויזואליזציה ישירה וגישה לגרעין השבלולית (cochlear nucleus).

direct-visualization-murine-dorsal-cochlear-nucleus-for-optogenetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

מקור: Kozin, E. D., et.al. הדמיה ישירה של גרעין השבלול הגבי של העכברים לגירוי אופטוגנטי של מסלול השמיעה. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר (DCN) כדי לאפשר גירוי שמיעתי המושרה על ידי אור. וקטור ויראלי המקודד אופסין, תעלת יונים רגישה לאור, מוזרק לתוך ה-DCN לאחר קרניוטומיה ושאיפת מוח לגישה ישירה. האופסינים המבוטאים מאפשרים להפעיל נוירונים על ידי אור, ומספקים מודל לחקר תגובות מסלול השמיעה באמצעות אופטוגנטיקה.

העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר לגירוי שמיעתי המושרה על ידי אור

סרטון זה מדגים את התהליך של הכנת פרוסות מוח בצורת טריז בסביבת מעבדה. באמצעות ויברטום, פרוסה בצורת טריז ממוחו של עכבר מעוצבת בעובי משתנה. פרוסה זו מכילה את שורש עצב השמיעה הממוקם בקצה העבה יותר, בעוד שהנוירונים הקשורים לשמיעה ממוקמים בקצה הדק יותר.

הכנת פרוסות טריז במוח כדי להמחיש נוירונים שמיעתיים

סרטון זה מדגים פרוטוקול לגירוי שורש עצב השמיעה ולרישום זרמים פוסט-סינפטיים בנוירונים אוליבוקוכלריים מדיאליים בפרוסות טריז במוח עכבר.

גירוי שורש עצב שמיעתי והקלטות זרם פוסט-סינפטי בפרוסת טריז במוח עכבר

אנו מתארים שיטה לאפיון הטופוגרפיה התפקודית והתכונות הסינפטיות של מעגלי המוח הקדמי באמצעות גישה אופטוגנטית לגירוי אוכלוסיות עצביות במבחנה.

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

אופטוגנטיקה הפכה לכלי רב עוצמה לשימוש בניסויים במדעי המוח ההתנהגותיים. פרוטוקול זה מציע מדריך שלב אחר שלב לתכנון והקמה של מערכות לייזר, ומספק פרוטוקול מלא לביצוע גירויים אופטוגנטיים מרובים ובו זמנית התואמים לרוב פרדיגמות הבדיקות ההתנהגותיות של מכרסמים.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

כאן אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יציבות ומבודדות היטב של יחידה אחת מאינטרנוירונים מעכבים שזוהו בקליפת המוח של העכבר המורדם. תאי עצב המבטאים ChR2 מזוהים על ידי תגובתם לאור כחול. השיטה משתמשת בציוד הקלטה חוץ-תאי סטנדרטי, ומשמשת כחלופה זולה להדמיית סידן או תיקון מונחה חזותית.

מדריך ל בשנת vivo הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

שתלי שבלול (CIS) לאפשר שמיעה על ידי גירוי חשמלי ישיר של עצב השמיעה. עם זאת, תדירות עניה ורזולוציה עוצמה מגבילה את איכות שמיעה עם מדינות חבר העמים. כאן אנו מתארים גירוי optogenetic של עצב השמיעה בעכברים כאסטרטגיה חלופית למחקר שמיעתי ופיתוח CIS עתיד.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

שילוב של תשומות סינפטיות מגוונות לנוירונים נמדד בצורה הטובה ביותר בהכנה שמשמרת את כל הגרעין הטרום-סינפטי לתזמון טבעי ול פלסטיות מעגל, אבל פרוסות מוח בדרך כלל מנתקות חיבורים רבים. פיתחנו פרוסת מוח שונה כדי לחקות פעילות מעגל vivo תוך שמירה על יכולת ניסויים במבחנה.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש באופטוגנטיקה אלחוטית בשילוב עם צילום וידאו במהירות גבוהה במשימת הושטת יד לתפיסה של כדור יחיד כדי לאפיין את המעגלים העצביים המעורבים בביצוע ההתנהגות המוטורית המיומנת בעכברים הנעים בחופשיות.

In Vivo שליטה אופטוגנטית אלחוטית בהתנהגות מוטורית מיומנת

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים לרישום מיקרו-אלקטרוקורטיקוגרפיה בצפיפות גבוהה (μEcoG) בחולדות ועכברים, כולל שיטות כירורגיות, השתלה והקלטה. הקלטות μECoG מבוצעות בשילוב עם הקלטת פוליטרודה למינרית בקליפת המוח השמיעתית של החולדה או עם מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית בקליפת המוח הסומטוסנסורית של העכבר.

חקירות רב-ממדיות של עיבוד קליפת המוח על ידי שילוב פוליטרודים למינאריים ואופטוגנטיקה עם מיקרו אלקטרוקורטיקוגרפיה במכרסמים

למדו פרוטוקול ניתוחי לגישה ישירה לגרעין השבלול הגבי בעכברים לצורך ניסויים אופטוגנטיים. השיטה מאפשרת הדמיה מדויקת והזרקת וקטורים ויראליים למערכת השמיע המרכזית.

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

גלה סרטונים נוספים