Name: Ex vivo דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: למדו מודל ex vivo לחקר פעילות הורמונלית בשד האדם תוך שימור ארכיטקטורת הרקמה והאינטראקציות הבין-תאיות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור תגובתיות הורמונלית ומנגנוני סיגנלים פרקריניים בצורה מדויקת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים M. Fiche של בית החולים של האוניברסיטה של ​​לוזאן למתן תמונת מאמופלסטית, מ &#39;וא&#39; וירט Ayyanan של שוויצרי מכון לחקר הסרטן ניסויי, המרכז הלאומי של יכולת המחקר המולקולרית אונקולוגיה, בית הספר למדעי חיים, אקול פוליטכניק הפדרלי דה לוזאן לקבלת סיוע טכני ור &#39;קלארק מאוניברסיטת מנצ&#39;סטר להערות ביקורתיות. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל תמיכה מSNF3100A0-112090, Oncosuisse 531,817, ותרופות היוזמה המשותפת ההתחייבות החדשנית תחת הסכם מענק לא. 115,188, משאבים אשר מורכבים מתרומה כספית מהתכנית של האיחוד האירופי מסגרת השביעית (FP7 / 2007-2013) ופדרציה האירופית של חברות תעשיות פרמצבטיות ועמותות &#39;בתרומה נדיבה. כתובת האינטרנט של תרופות חדשניות יוזמה היא <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/.</a> &lt;/ P&gt;

שיקולים כלליים: לפני הזמן, להגדיר פרוטוקול אתיקה, להכין שאלונים לחולים, ותראו להכשרת כוח האדם הקליני. לפני השימוש בחומר מניתוח מאמופלסטית הפחתה, להשיג אישורים, ולהבטיח את הסכמת מטופל. רקמה עשויה להיות מדבקת וצריכה להיות מטופל בהתאם. פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה של ISREC - שוויצרי מכון לחקר הסרטן ניסויי. 1. רקמות שחזור, עיבוד וביו-בנקאי על מנת להבטיח איכות מדגם אופטימלית ליו-בנקאי, מספר הצעדים מתבצעים בבית החולים לפני הובלה למעבדה. בבית החולים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמות שד אנושיות בתנאים סטריליים מדגימות ניתוח מאמופלסטית ההפחתה ודם, במידת צורך. רקמה צריכה להיבדק על ידי פתולוג שידגום להוציא נוכחות של נגעים ממאירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את t השדלהוציא מתחת למכסת המנוע על לוח סטרילי ולהכין מספריים, סכין מנתחים כירורגים ומלקחיים שכבר מעוקרים עם מעקר קיטור. הפוך חתך עמוק באתרים של רקמת החלב שונים באמצעות אזמל כדי לפתוח אותו. ברקמת שד אנושית לחפש גדילים לבנים המורכב מצינורות ואוניות, שמוטמעים ברקמת שומן צהובה. הערה: היחס של parenchymal הלבן לרקמת השומן הצהובה שונה בקרב נשים; בדרך כלל יש לי נשים צעירות רקמת האפיתל יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חתיכות של חומר לבן ולהחזיק אותם עם מלקחיים, ולאחר מכן להפריד ביניהם בעדינות מרקמת השומן במספריים. להימנע מנטילת כלי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתיכות שטיפה של רקמות שבנאגרו מלוח פוספט pH (PBS) 7.2 להסיר דם. העברת הרקמה לבקבוקי פלסטיק המכילים 250 מיליליטר בינוני F12 (F12 בינוני של הנשר השתנה Dulbecco) ללא פנול אדום עם 2% פניצילין / סטרפטומיצין (כולל יחידה 5000 / פניצילין מיליליטר ו5,000 g / ml סטרפטומיצין) ו% 1tibiotic / amphotericin B (כולל 10,000 יחידות / מיליליטר פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מיליליטר של סטרפטומיצין, ו -25 מיקרוגרם / מיליליטר של amphotericin B). רקמות חנות במדיום להובלה למעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חתיכות של 3 - קוטר 5 מ&quot;מ להפקת RNA וחלבון ופלאש להקפיא אותם בcryovials עם איזופנטאן הקר (קרח יבש). העבר אותם לתיבת קרח יבשה לתחבורה למעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חתיכות של 3 - 5 מ&quot;מ לתוך תבנית ולכסות אותו בשכבה של טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) ולאחר מכן למקם את התבנית בתחתית שטוחה קופסא מלאה באיזופנטאן הקר של. לאחר הקפאה מוחלטת להעביר את התבנית לתיבת הקרח היבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן 5 חתיכות של 3 - 5 מ&quot;מ קוטר בparaformaldehyde (PFA) 4% ו -5 חתיכות אחרת בפורמלדהיד (FA) 4% ב- ​​PBS בניתוח היסטולוגית RT מאוחר יותר. שני fixatives שונה מומלץ כחלק מהנוגדנים לעבוד טוב יותר עם אחד או האחר של שתיים. </li></ol> במעבדה: <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האםcument את כל המידע על מאמופלסטית ההפחתה, מועד הניתוח והאם הדגימות נגזרים משמאל לעומת שד ימני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות קפואות ב -80 ° C ולהעביר את הרקמות קבועות לקלטות היסטולוגיה לאחר שעה 2 של קיבעון. ואז לשים אותם גם בPBS או אתנול 70%, לO / אחסון N ב 4 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, להעביר את קלטות היסטולוגיה למתקני היסטולוגיה להטבעת פרפין. </li></ol> 2. רקמות עיכול והורמוני גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הבקבוקים המכילים דגימות רקמה לזרימה למינרית בחדר תרבית תאי P2. מניחים חתיכות רקמה על לוח סטרילי הקיצוץ (29 x 19 סנטימטרים). החזק את החומר עם מלקחיים ולגרד את השומן וכלי נותר מparenchyma השד (חלק לבן) עם אזמל. הנח את החומר הלבן בPBS בצלחת תרבות 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת החומר השומני מכל החלקים והשלכתם על פי הכלל הבטיחותים של המעבדה, למקם את החלקים הלבנים המכילים את רקמות אפיתל חזרה על קרש החיתוך. באמצעות אזמלים מנוגדים לחתוך את הרקמה וקוצץ אותו לחתיכות בקוטר של עד 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החומר הטחון לתוך צינורות בגודל מתאים: עד 1, 2.5 ו -10 מיליליטר ל5, 15 או 50 מיליליטר צינורות, בהתאמה. בדרך כלל תשואות צינור 5 מיליליטר מספיק חומר לגירויי embedment פרפין והורמון, ותשואות 15 מיליליטר צינור מספיק חומר לסלולרי קרינה המופעל מיון (FACS). צינורות גדולים יותר משמשים להקפאת aliquots. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת עיכול אדון בהיקף של מדיום (DMEM / F12 ללא פנול אדום) עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין / amphotericin B וCollagenase (Clostridiopeptidase מhistolyticum Clostridium). מנת collagenase לפי זמני עיכול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 12, 24, ו -36 שעות של דגירה, להשתמש בריכוז סופי של collagenase של 1.5 מ&quot;ג / מיליליטר, 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר ומ&quot;ג 0.5 / בהתאמה מ&quot;ל. להוסיף תערובת אמן עיכול עד 4 פעמים בנפח של החומר מתעכל כדי להבטיח אוורור נאות ותסיסה. הערה: בהתאם לתכנון ניסוי ואת משך הזמן של גירוי הורמונלי, להוסיף הורמונים או במהלך או לאחר התאוששות צעד העיכול ומייקרו האנזימטית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף הורמון (ים) בריכוז רצוי כדי לבדוק את הדגימות והרכב לשליטה. לגירוי עם 17-β-אסטרדיול, וpromegestone (R5020) להשתמש ריכוז סופי של 20 ננומטר. הערה: R5020 הוא אגוניסט קולטן פרוגסטרון סינטטי, שהוא יציב יותר מפרוגסטרון הטבעי במדיום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום צינורות על מיקסר רולר בתוך חממה ב 37 מעלות צלזיוס ו -40 O סל&quot;ד / N. לפני הצבת הדגימות במיקסר, resuspend אותם היטב כדי להבטיח שכל החומר מפיץ לאורך צינורות צנטריפוגה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעיכול לוקח לפחות 12 שעות (O / N), לפעמי גירוי הורמון של שעות פחות מ -12, להוסיף את ההורמונים לאחר ההתאוששות של microstructures (deזנב תחת שלב 3). הוסף את ההורמונים כמו שאתה resuspend microstructures ולמקם את ההשעיה על צלחות מצורפים נמוכות במיוחד. יכולה להיות כל הזמן microstructures רקמות על צלחות נמוכות במיוחד מצורפים לתקופה של עד 7 ימים במדיום גידול-ללא גורם שימור כדאיות כ -70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לRNA וניתוח חלבון, לאסוף microstructures רקמה על ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות והקפאת הבזק בצינורות צנטריפוגה. </li></ol> 3. שחזור של Microstructures רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור (ים) ב 400 XG במשך 5 דקות. לשאוב השומן מהחלק העליון של צינור צנטריפוגות ולהעביר את supernatant של supernatant המימי שנותר, שהוא מועשר בfibroblasts, לצינור צנטריפוגות חדש וצנטריפוגות ב 1250 XG במשך 5 דקות. הערה: ככל שmicrostructures רקמת השד היא מאוד דביקה, את כל הצעדים הבאים resuspend גלולה בעדינות על ידי התססה הצינור. Pipetting אינו מומלץ בשל הסיכון של אובדן חומר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורים מועשרים בmicrostructures ובfibroblasts נגזר מsupernatant המימי בPBS, 2% עגל סרום עוברי (FCS). בהמשך לכך ספין שני הצינורות ב1,250 XG במשך 5 דקות ולאחר מכן למחוק את supernatants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורים ב 3 - 5 מיליליטר מאגר תמוגה תאי דם אדום ולהעביר אותם לניקוי צינורות. דגירתם במשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח 2x של PBS, 2% FCS ו צנטריפוגות ב1,250 XG במשך 5 דקות. לשטוף את כדורים עם PBS, 2% FCS ו צנטריפוגות ב 1250 XG במשך 5 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. </li></ol> 4. דוגמאות לcytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1-2 מיליליטר טריפסין 0.25% לגלולה ולערבב אותו על ידי pipetting מעלה ומטה בעדינות במשך 2 דקות עם pipetman 1,000 μl לנתק תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב פעילות טריפסין ידי הוספת 9 מיליליטר PBS, 2% FCS. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 5 דקות ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר PBS, 2% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא על מסננת תא 40 מיקרומטר מונחת על top של צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר להכין תאים בודדים. אם כמה מיקרוליטר של השעיה תא להישאר בחלק העליון של המסנן, לעזור להם לעבור את הסינון על ידי aspirating מהצד השני של מסננת האחר עם pipet ולהוסיף אותם לmicrostructures המסוננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדני תאי חיסון נפרדים, fibroblasts ותאי האנדותל מmicrostructures עם קוקטייל של אנטי-CD45, אנטי-FAP ואנטי-CD31 ולאחר מכן למיין אותם עם FACS, המבוססים על EpCAM פאן-אפיתל סמן CD10 ולהפריד תאי luminal ובסיס בהתאמה 10 . </li></ol> 5. דוגמאות להיסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת החומר מתעכל באופן מכאני ואנזימים כפי שתואר לעיל, לתקן כדורים מחומר ראשוני 1.5 מיליליטר ב 1 מיליליטר של 4% PFA PBS ב RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב1,250 XG במשך 5 דקות ולשטוף עם 1-2 מיליליטר PBS פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 16,000 במשך 10 דקות. במהלך תקופה זו, להכין 1% רב תכליתי agarose בטריס-אצטט-EDTA (טה) חיץ ולחמם את הפתרון במיקרוגל עד הפתרון מגיע לרתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מתנור המיקרוגל ולערבל את הבקבוק בעדינות לתערובת הפתרון וresuspend כל חלקיקי agarose שנותרו. פתרון agarose מגניב עד 50 ° C ויוצקים 1 מיליליטר בעובש בסיס פרפין בגודל 31 × 23 × 13.5 מ&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ומניח את כדורים על גבי השכבה המוצקה (1 - 3 מ&quot;מ) של agarose בעזרת מרית עם קצה שטוח. לכסות את כולם עם שכבה נוספת של agarose (40 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose המבצרת, בדרך כלל תוך 5 דקות, לשים בלוקים agarose לקלטות היסטולוגיה לembedment פרפין. יחד עם דגימות agarose למקם נייר משרדי לבן בקלטת עם כל המידע על מספר מאמופלסטית ההפחתה, תנאי ניסוי, ותאריך כתוב באותיות קטנות בעיפרון; כתיבת שורות אלה עומדים בכל צעדי הטיפול עוקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הקלטות בPBS O / N, או ב -70% אתנול לאחסון בסוף השבוע, בשעה 4 מעלות צלזיוס. לא שם לב כל הבדל בין שני פתרונות האחסון. לאחר מכן להעביר את קלטות היסטולוגיה למתקני היסטולוגיה להטבעת פרפין. </li></ol> 6. Microstructures הקפאה (עתיד Culturing) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microstructures רקמות הגלולה בהקפאה בינונית בהיקף של FCS עם sulfoxide דימתיל 10% (DMSO) ולהקפיא 1 מיליליטר aliquots בcryovials. מספר cryovials השיג תלוי בכמות של חומר ראשוני המתקבל מהפחתת מאמופלסטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את cryovials המכיל microstructures רקמות באמצעות מקפיא קצב מבוקר עם התכנית הבאה: 5 דקות מגורים על 4 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה יורד ל-7 ° C עם שיעור של 6 מעלות צלזיוס / min, ומקטין את הטמפרטורה ל -12 מעלות צלזיוס עם שיעור של 6 מעלות צלזיוס / min, 10 דקות מגורים, ומקטין את הטמפרטורה ל -40 מעלות צלזיוס עם שיעור של 6 מעלות צלזיוס / min, ירידה בטמפרטורה ל -80 מעלות צלזיוס עםשיעור C / min 6 מעלות. לאחר מכן להעביר את cryovials למקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להעביר את cryovials מ-80 ° C למכל חנקן נוזלי לאחסון ארוך. </li></ol>

<ol><li>Beral, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+and+hormone-replacement+therapy+in+the+Million+Women+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study.</a> Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).</li>
<li>MacMahon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+at+first+birth+and+breast+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Age at first birth and breast cancer risk.</a> Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).</li>
<li>Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Hormonal%27+risk+factors%2C+%27breast+tissue+age%27+and+the+age-incidence+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer.</a> Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).</li>
<li>Brisken, C., O'Malley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+action+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormone action in the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178(2011).</li>
<li>Levenson, A. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF-7%3A+the+first+hormone-responsive+breast+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line.</a> Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).</li>
<li>Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+and+PR+signaling+nodes+during+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ER and PR signaling nodes during mammary gland development.</a> Breast Cancer Res. 14 (4), 210(2012).</li>
<li>Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-dependent+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelial+cells+requires+both+physical+and+biochemical+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).</li>
<li>Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+epithelial+cell%3A+influence+of+extracellular+matrix+composition+and+organization+during+development+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).</li>
<li>Graham, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+licensing+and+progenitor+numbers+are+increased+by+progesterone+in+normal+human+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast.</a> Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comment+on+%22Progesterone%2FRANKL+is+a+major+regulatory+axis+in+the+human+breast%22%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast".</a> Sci Transl Med. 5 (215), 215le214(2013).</li>
<li>Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+signalling+in+breast+cancer%3A+a+neglected+hormone+coming+into+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight.</a> Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).</li>
<li>Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture+and+function%3A+dynamic+reciprocity+via+extra-+and+intra-cellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices.</a> Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).</li>
<li>Tanos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone%2FRANKL+is+a+major+regulatory+axis+in+the+human+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast.</a> Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155(2013).</li>
<li>Yalcin-Ozuysal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+roles+of+Notch+and+p63+in+controlling+mammary+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate.</a> Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).</li>
<li>Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+the+FACS%3A+a+devil+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sorting out the FACS: a devil in the details.</a> Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

תרבות vivo לשעבר המתוארת כאן מספקת microstructures רקמת שד המכילה צינורות שלמים ואוניות, יחד עם סוגי תאים אחרים בדרך כלל נמצאים בחזה הנשי האנושי. בעיבוד של רקמת השד האנושית בדרך כלל מתקבלת מmammoplasties ההפחתה, הסרת רקמת שומן, עיכול מכאני והאנזימטית של מטריצת סטרומה, ותמוגה של תאי דם אדומים מעשירה לברי צינור חלב ויחידות lobular ductal מסוף. עיכול עדין האנזימטית בריכוז הנכון, למשך הנכון הוא חיוני כדי להבטיח כי microstructures הרקמות נותרה על כנן, לשמור על סוגים שונים של ת...

A correction was made to <a href="/video/52436">An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast</a>. There was an error with the author, Marie Shamsheddin&#39;s, name. The author&#39;s name has been corrected to:
Marie Shamseddin
instead of:
Marie Shamsheddin

A correction to the author list has been made for the article <a href="/video/52436">An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast</a>.

Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

מידע על נוף מוטאציות בסרטן השד גדל בקצב מהיר. פחות תשומת לב הוקדשה לגורמים מערכתיים המשפיעים על התפתחות סרטן השד. חשיפה להורמוני רבייה יש השפעה משמעותית על התקדמות מחלה 1-3. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם הורמוני רבייה לפגוע בשד האנושי הם הבינו היטב. עבודה עם מודלים של עכברים מהונדסים גנטי גילתה כי הם כרוכים איתות פנימית ואוטוקריני תא באמצעות מספר effectors במורד הזרם 4. הידע המוגבל על פעולת הורמונים בשד האנושי הוא במידה רבה מיוחס לחוסר מודלים נאותים. רוב העבודה על המנגנונים של קולטן אסטרוגן (ER) וקולטני פרוגסטרון איתות (PR) שבוצעה עם קווי קולט הורמון חיוביים סרטן שד תא, כגון MCF-7 וT47D. אלה נגזרים מיפליטו פלאורלי מחולים עם סרטן השד מתקדם שהיה לי already קיבל טיפולים מרובים 5. רלוונטי הביולוגית של ממצאים במבחנת מודלים פשוטים כל כך של השד האנושי הוא גנים מפוקפקים ויעד שזוהו במודלים אלה במבחנה הם שונים מגני היעד שמזוהים במודלים של בעלי חיים 6. כאשר תאי אפיתל שד אנושי ראשוני בתרבית במבחנה הם נוטים לאבד את ביטוי קולט הורמון ולכן תגובת הורמון 7,8. בעיה זו ניתן circumventd על ידי גישות 3D מתוחכמות באמצעות matrigel. בדרך זו, סי קלארק ועמיתים הצליחו להקים תאי האפיתל שד שנשמרו ביטוי קולט הורמון והראה תגובת שגשוג לפרוגסטרון גירוי 9. ובכל זאת, שתי חשובים בגנים המטרה קולטני פרוגסטרון vivo, Wnt-4 וRANKL, לא נגרם על גירוי פרוגסטרון במערכת זו 9. גישה זו צולמה לאחרונה על עוד עם במבחנה </em&gt; טיפול מקדים הורמון ואינדוקצית RANKL הושג 10. אזהרה היא שיש matrigel פעילויות שהן אצווה תלויות, היא יקר, ודורשת תכנון ניסוי כי הוא מתאים למספרים סלולריים קטנים בלבד. בהתבסס על הממצא שבER vivo ואיתות יחסי הציבור מתווכים במידה רבה על ידי אינטראקציות אוטוקריני 11, אנחנו טענו שאינטראקציות בין תאית צריכה להישמר. גורם חשוב נוסף שהולך לאיבוד כרקמות הם ניתקו לתאים בודדים לתרבות במבחנה הן האינטראקציות של תאי האפיתל במטריצה ​​תאית; אך אלה הם קריטיים לבידול אפיתל ושיבושם חשוב ביצירת גידולים 12. עם זה בחשבון, הקמנו שיטה לבודד microstructures רקמת שד מחומר שנזרק כירורגית טרי 13. Parenchyma השד, בהיקף של אפיתל שני שכבות עם luminal הפנימי וחיצוני myoepitheliתאי אל, הוא גזורים מרקמת שומן ונתונים לניתוק מכאני והאנזימטית. לאחר הכביסה וצנטריפוגה, שברי צינורות החלב מתקבלים ששומרים אינטראקציות קרובות עם הרבה תאי סטרומה. microstructures רקמות אלה יישאר הורמון תגובה. המודל היה תוקף בדגימות קליניות 13. ככזה, ההליך הנוכחי יכול לעזור ללמוד פעולת הורמון בשד בהקשר ביולוגי ורלוונטי מבחינה קלינית.

<table><tbody><tr><td>צנטריפוגה מיקרוליטר</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Nalgene&nbsp; &nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא בקצב מבוקר EF600 Grant</td><td>Asymptote&nbsp;</td><td>EF600</td><td></td></tr><tr><td>CO2 אינקובטור</td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>מערבל רולר SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>קלטות היסטולוגיה</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי סטריל&nbsp;</td><td>אסקולאפ</td><td>BB536&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>תבנית בסיס פרפין</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) Cryomatrix</td><td>Thermoscientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td><td>אנטיביוטיות/אנטי-פטריות</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Prewarm (37 & deg; C)</td></tr> <tr><td>קולגנאז</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>Prewarm (37 &deg; C)</td></tr> <tr>ניתן להחליף את <td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td> במאגר ליזיס דם <td>של תאי סרום עגל עוברי</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>רוט</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>איזופנטן</td><td>סיגמא</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקונים קריוגניים (5.0 מ"ל)</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית התקשרות נמוכה במיוחד</td><td>קורנינג, ניו יורק 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

מחקר פעולה של הורמונים בשד האנושי כבר הקשו על ידי היעדר מערכות מודל הולמים. על התרבות במבחנה, תאי אפיתל החלב ראשוניים נוטים לאבד ביטוי קולט הורמון. נרחב שורות תאי סרטן השד חיובי קולט הורמון המשמשות הן רלוונטיות מוגבלות למצב in vivo. כאן אנו מתארים מודל vivo לשעבר ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. דגימות טריות אנושיות רקמת שד מחומר שנזרק כירורגית כגון mammoplasties הפחתה או mammectomies הם מכניים ואנזימים מתעכלים להשיג שברי רקמה המכילים צינוריות ואוניות וסוגים שונים של תאי סטרומה. microstructures הרקמות אלה המשיכו במדיום בסיסי ללא גורמי גדילה לשמר הקשר בין תאיתם, מבנה הרקמה, ולהישאר הורמון מגיב במשך כמה ימים. הם מעובדים בקלות לRNA ומיצוי חלבון, ניתוח היסטולוגית או מאוחסנים בהקפאה בינונית. הקרינהמיון תא פעיל (FACS) ניתן להשתמש כדי להעשיר לאוכלוסיות תאים ספציפיות. פרוטוקול זה מספק גישה פשוטה, סטנדרטית ללימודי translational עם דגימות מורכבות ביותר, מגוונות אנושיות.

כדי ללמוד את התפקיד של אסטרוגנים ופרוגסטרון ולהבין טוב יותר את התפקידים המולקולריים שלהם בשד האנושי, אנו אוספים דגימות רקמת שד אנושיות טריות מחולים שעברו mammoplasties הפחתה (איור 1) לאחר קבלת ההסכמה מהדעת שלהם. אנחנו גם לקבל היסטוריה של החולים רפואי ורבייה, כמו גם דגימת דם כדי לקבוע את רמות הפרוגסטרון בסרום בזמן הניתוח. רקמה מmammoplasties ההפחתה הטרי מנותקת באופן מכאני ואנזימים. יש לי microstructures הרקמות וכתוצאה מצינוריות ואוניות אופייניות לרקמת השד ממוצא <st...

פיתחנו מודל vivo לשעבר רומן ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. היא מבוססת על microstructures הרקמה מבודדת מדגימות רקמת שד ניתוחיות המשמרות מבנה רקמה, אינטראקציות בין תאית, ואיתות אוטוקריני.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לספק מודל ex vivo של שד אנושי השומר על ארכיטקטורת הרקמה, האינטראקציות הבין-תאיות והתגובתיות להורמונים, וזאת על מנת לחקור את פעולתם של הורמונים. המודל מבוסס על מיקרו-מבנים של רקמה אנושית המוכנים תחילה על ידי דיסקציה של פה רנכימה של השד, המורכבת מניביים ואלוולות (lobules) מתוך הסטרומה השומנית של השד. בנוסף לאדיפוציטים, הסטרומה מכילה פיברובלסטים, תאי מערכת החיסון ותאי אנדותל.לאחר שהרקמה הפארנכימלית שוחררה משומן, היא מופרדת באופן מכני לחתיכות בגודל ראש סיכה באמצעות סכיני ניתוח מנוגדים. לאחר מכן, מסת הרקמה עוברת עיכול אנזימטי עם קולגנאז; אם הרצון בכך, ניתן לשלב בשלב זה גרייה הורמונלית. מיקרו-מבני הרקמה מופקים לאחר מכן באמצעות סבוב (צנטריפוגה), ולאחריו הסרה של שאריות רקמת השומן, של הפראקציה העשירה בפיברובלסטים ושל תאי דם אדומים.לאחר הליך התאוששות, תרחיף רקמת השד העיכולה שנותרה מועשר במבנים זעירים של רקמה המכילים תאי לומן ותאי מיואפיתליים יחד עם הלמינה הבזאלית הסובבת אותם, תאי אנדותל פיברובלאסטים ותאי מערכת החיסון. בסופו של דבר, תרבית ex vivo משמשת להערכת המורפולוגיה של המבנים הזעירים. מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) משמש להפרדת תתי-אוכלוסיות של תאי השד, ואנליזות חלבונים וטרנסקריפטומיקה משמשות למחקרי תגובה הורמונלית.הורמונים שולטים בהתפתחות השד והם חשוב

an-ex-vivo-model-to-study-hormone-action-in-the-human-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

קווים הוקמו סרטן התאים וxenografts היו עמוד התווך של מחקר הסרטן בעשורים האחרונים. עם זאת, הראיות האחרונות עולה כי תגובה לטיפול מושפעת במידה רבה על ידי מייקרו-סביבת התאים הסרטניים. לכן, פיתחנו ניתוח vivo לשעבר של דגימות גידול ראשוניות למטרות פיתוח תרופות.

Ex Vivo טיפול תגובה של גידולים ראשוניים ו / או הקשורים גרורות לפרה קלינית וקליני של Therapeutics

פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

פיתחנו מודל מבחנה של תרדמה במח העצם עבור תאי סרטן שד רגישים לאסטרוגן. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש במודל לחקר הביולוגיה המולקולרית והתאית של תרדמה וליצירת השערות לבדיקה עוקבת in vivo.

<em&gt; במבחנה</em&gt; תרדמת דגם של סרטן השד רגיש לאסטרוגן במוח העצם: כלי ללימודי מנגנון מולקולרי והשערת דור

אנו מתארים מודל תרבית תלת מימדי של אפיתל השד האנושי המתאים לחקר פעולת ההורמונים.

מודל התרבות 3D-תגובת הורמון של האפיתל בלוטת חלב האדם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתיל תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב פשוטה, פחות פולשנית, אחיזה נוחה בדרך, והוא מודל סרטן השד זה העכבר orthotopic עם סביבה נאותה כרית שומן החלב יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של סרטן.

הזרקת Orthotopic של תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב עכברים

מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה ומודלים של עכברים מהונדסים גנטית הניתנים להשתלה מחדשים בנאמנות מחלות אנושיות והם מודלים מועדפים לחקר בסיסי ותרגום של סרטן השד. כאן, שיטה מתוארת להשתלה אורתוטופית שברי גידול השד לתוך כרית השומן הממארי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול ולהעריך את תגובת התרופה.

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

פרוטוקול זה מתאר את בנייתה של מערכת מיקרופיזיולוגית במבחנה לחקר סרטן השד באמצעות רקמת שד אנושית ראשונית עם חומרי מדף.

דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית

אנו מציגים פרוטוקול למדידת תגובת תרופות וקרינה בזמן אמת של תאים גרורתיים במוח של סרטן השד במודל פרוסת מוח אורגנוטיפית. השיטות מספקות בדיקה כמותית כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של טיפולים שונים על גרורות במוח מסרטן השד באופן ex vivo בתוך ממשק המיקרו-סביבה של המוח.

מודל פרוסת מוח Ex Vivo כדי לחקור ולמקד את צמיחת הגידול הגרורתי של סרטן השד במוח

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

למדו מודל ex vivo לחקר פעילות הורמונלית בשד האדם תוך שימור ארכיטקטורת הרקמה והאינטראקציות הבין-תאיות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור תגובתיות הורמונלית ומנגנוני סיגנלים פרקריניים בצורה מדויקת.

גלה סרטונים נוספים