Name: מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סהכ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: למדו שיטה סטנדרטית לזיהוי נגיפים זיהומיים במי שתייה ומי סביבה באמצעות תרביות תאי כליה של Buffalo Green Monkey. השיטה מבוססת על פרוטוקול EPA 1615 ומסייעת בהערכת סיכוני בריאות ציבורית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר מארק בורצ'רדט, משרד החקלאות האמריקני, מרשפילד, ויסקונסין, על אספקת נגיף הפוליו סבין סרוטיפ 3 ששימש במחקר זה; מרי ג'ין סי, ננסי שייבל וג'ניפר ג'ונס מתאגיד Dynamac להכנת תרביות BGM; ניקול א. ברינקמן, שאנון מ. גריפין, בריאן ר. מקמין, אריק ר. רודס, יוניס א. ורוגס, אן ס. גרים, סנדיה א. פרשיוניקר ולארי ווימר על תרומתם להערכה הכוללת של שיטת USEPA 1615; גרטשן סאליבן לסיוע טכני; ובעלי בארות ושירותים פרטיים מקומיים שאפשרו לנו לאסוף דגימות מים. למרות שעבודה זו נבדקה על ידי USEPA ואושרה לפרסום, ייתכן שהיא לא בהכרח משקפת את המדיניות הרשמית של הסוכנות. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה אישור או המלצה לשימוש.

הערה: אזור עיין חומרים משלימים S1 עבור רשימה של הגדרות. נהלי QA קשורים שיטת USEPA 1615 מתוארי S2 הסעיף והחומרים משלימים. 1. מסנן Elution נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elution ראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 500 מ&quot;ל של תמצית בשר בקר 1.5% שנאגרו, pH 9.0, חימם לטמפרטורת החדר בתוך גליל סיימה. פתח את דיור המחסנית המסננת ולהוסיף כמות מספקת של תמצית בשר בקר כדי לכסות את מסנן electropositive לחלוטין. החזר את מכסה בית המסנן ויוצקים את תמצית בשר הנותרים לתוך מבחנה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות של זמן מגע, להעביר את פתרון תמצית בשר הדיור יחד עם זה שנותר בכוס סטרילית לאט דרך המסנן באמצעות מיכל לחץ או משאבת peristaltic. אסוף את eluate לתוך כוס זכוכית 2 ליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> elution שנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1 באמצעות 500 מיליליטר נוסף של תמצית בשר בקר 1.5% שנאגרו, אך להגדיל את זמן הקשר אצל שלב 1.1.2 עד 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תמצית בשר מן elution השני אל מבחנה 2 L המכילים כי מן elution הראשון. הוספת בר ומערבבים סטרילי אל מבחנה. </li></ol></li></ol> נוהל ריכוז 2. אורגני הפתתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר אלקטרודת שילוב מסוג עם תת-כלורי נתרן 0.525% עבור 5 דקות לפחות. יש לשטוף את האלקטרודה עם O סטרילי DH 2 ולאחר מכן טהר עם נתרן תיוסולפט 0.05 מ &#39;. כייל את מד pH באמצעות pH 4 ו -7 סטנדרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכוס המכילה את eluate בצלחת ומערבבים. הפעל את הצלחת להגדיל את מהירות ערבוב עד נוצרת מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של eluate ל -3.5 ± 0.1 לאט על ידי תוספת חכמה ירידה של 1.2 M HCl אל eluate. מוסיפים את HCl טיפה חכם כי בנוסף מהירה יהיה להשבית וירוס. במהלך תקופה זו eluate תהפוך מעוננת בתור משקע מתחיל להיוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את SPE ערבובed כדי לרגש איטי ולאחר מכן להמשיך לפקח ולשמור את ה- pH של eluate 3.5 ± 0.1 בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את ההשעיה תמצית בשר זירז לתוך בקבוקים צנטריפוגות אחד או יותר ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 2500 XG ב 4 ° C.. הסר את בקבוקי מתוך צנטריפוגה ואו לשאוב או לאט למזוג supernatant כדי למנוע אובדן של המשקע pelleted. בטל supernatant. הערה: לא יכול להיות הבדלים ניכרים בין המון תמצית בשר בכמות והאיכות של המשקע. המשקע המופק המון כמה יתמוסס במהירות תוך כי מתוך המון אחרים מתמוסס בקושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 מ&quot;ל של 0.15 M פוספט נתרן אל בקבוק צנטריפוגות המכיל את המשקע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 0.15 M פוספט נתרן, pH 9.0 עבור משקעים מתוך המון תמצית בשר הנמסים תוך 5 דקות. מערבבים במשך 10 דקות לאחר המשקע נמס לגמרי, ואז ללכת מיד לשלב 2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 0.15 M פוספט נתרן, pH 7.0-7.5 לכל משקעים אחרים. מערבבים במשך 10-15 דקות עד להמסה, או משקעים קשים יותר, לשבור אותם עם מרית סטרילי, על ידי ציור הפתרון שוב ושוב מעלה ומטה במהלך ערבוב עם טפטפת, ידי רועדת המשקע ב 160 סל&quot;ד על שייקר מסלולית, או על ידי שילוב של נהלים אלה. הערה: בעת שימוש ביותר מהתקן בקבוק צנטריפוגות אחד, לשלב את משקעים באמצעות פחות מ -30 מ&quot;ל של פוספט נתרן ולאחר מכן להשתמש בחלק הנותר של 30 מ&quot;ל לשטוף את הבקבוקים לאחר שילוב של משקעים לתוך בקבוק אחד או כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המשקע המשולב בתוך בקבוק צנטריפוגות תחתית שטוחה, מוסיפים בר ומערבבים אל הבקבוק. עבור לשלב 2.6.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המשקע המשולב בתוך בקבוק צנטריפוגות עם תחתית חרוטים, ולהעביר אותו לתוך כוס זכוכית קטנה ולהוסיף בר ומערבב עד המבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הבקבוק או כוס על גבי בוחש מגנטי, ומערבבים עד precipitate נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לעקר אלקטרודת סוג בשילוב עם תת-כלורי נתרן 0.525% ו טהר עם 0.05 מ &#39;נתרן thiosulfate כמתואר שלב 2.1. כייל את מד pH באמצעות pH 7 ו -10 תקנים. לאט ולהתאים את ה- pH של המשקע נמס לגמרי ל -9.0 עם 1 M NaOH ואז ומערבבים במשך 10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בר ומערבבים צנטריפוגות המשקע מומס במשך 10 דקות ב 4,000-10,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים בזהירות את supernatant לתוך כוס זכוכית מבלי להפריע גלולה. הוספת בר ומערבבים עד כוס וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכוס על גבי בוחש מגנטי, ומערבבים הפתרון. להוסיף 1.2 M HCl טיפה חכם להתאים את ה- pH ל 7.0-7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר את supernatant על ידי מעבר דרך מסנן לסטריליזציה המכיל prefilter כי כבר pretreated עם 15 מ&quot;ל של תמצית בשר בקר 1.5%, 0.05 מ &#39;גליצין, pH 7.0-7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Volum לדוגמא Assayחישובי דואר (S): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משוואת 1 לחשב S עבור כל דגימות הבדיקה, אלא המבוצר המעבדה בלנק מגיב המעבדה בלנק, <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> משוואה 1 כאשר D (היקף מדגם מים המקורי assayed) הוא 500 L עבור מי תהום, TSV (נפח דגימה סה&quot;כ) הוא הנפח של מדגם השדה עבר דרך מסנן מחסנית 5 האינץ electropositive שקבל במעבדה, FCSV (סופי מרוכז לדוגמא Volume) נפח לאחר סינון בשלב 2.10. דוגמה מוצגת S4.1 סעיף וחומרים משלימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב S עבור המעבדת המבוצרת בלנק (LFB; כלומר, בקרת איכות חיובית באמצעות מי כיתה מגיב זרע) ואת מגיב המעבדה בלנק (LRB; כלומר, בקרת איכות שלילית באמצעות מים מגיבים בכיתה) על ידי הכפלת FCSV ב -0.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את FCSV לתוך thresubsamples דואר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן subsamples 1 ו -2 עם נפח שווה 1.04 פעמים את נפח דגימת Assay. להקפיא subsamples אלה בבית או מתחת -70 ° C אם הם לא ניתן לנתח באמצעות assay הווירוס culturable הכולל (subsample 1, השלב 4) או מעובדי המבחנים המולקולריים (מוצג לא) בתוך 24 שעות; אחרת, להחזיק ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את נפח הנותרים (subsample 3) או מתחת -70 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח הבידוד על ידי חלוקת S ב -10. </li></ol> 3. וירוס סה&quot;כ culturable Assay quantal הערה: כל השלבים תמיד להוסיף פתרונות בזהירות כדי להימנע משיבוש monolayer התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג או מדיה לשאוב מכלי בדיקה המכילים בשכבה של תאי BGM בבית הפיצול 3-6 ימים לאחר ולאחר מכן להוסיף נפח של תמיסת מלח מאוזנת שווה תקשורת סיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג או לשאוב את פתרון המלח המאוזן מן te תרבית תאיםכלי רח בשימוש ואז לחסן את כלי בדיקת תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 כלי בדיקה עבור כל מדגם בדיקה עם נפח של subsample 1 שווה לנפח הבידוד יחד עם בקרות assay quantal הכוללות culturable הווירוס (S2.4 בסעיף חומרים משלימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור LFB ואת מטריקס מדגם מחוזק מעבדה (LFSM; כלומר, מדגם מטריקס מים זורע), להכין 5, 25, ו 125 דילולים באמצעות subsample 3 ו 0.15 M פוספט נתרן, pH 7.0-7.5 כמו diluent. דוגמה של הליך להכנת דילולים ניתנת S3 סעיף וחומרים משלימים. לחסן 10 כלי בדיקת תרבית תאי שטף לכל סדרת דילול באמצעות נפח בידוד על כל כלי בדיקה בנוסף הכלי מחוסן עם subsample חי 1 בשלב 3.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל מדגם בדיקה משלב 3.2.1 (חוץ מאלה מחוסנים בשלב 3.2.2) כי יש CPE בכל 10 המשכפל לאחר 14 ימי הדגירה (ראה שלב 3.3) קדםלקלף 5, 25, ו 125, ו 625-לקפל דילולים של subsample 3. לחסן 10 שטף כלי בדיקת תרבית תאים לכל סדרת דילול באמצעות נפח בידוד על כל כלי בדיקה יחד עם קבוצה חדשה של quantal הווירוס culturable הכולל שולט assay (S2.4 בסעיף חומרים משלימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ את הבידוד מעל פני השטח של monolayers התא על ידי הטיית הכלי הלוך ושוב. דגירת כלי הבדיקה בטמפרטורת חדר למשך דקות 80-120 על פלטפורמת נדנדה מכאנית ב 1-5 תנודות / min או עם הנדנדה של הכלי כל 15-20 דקות, כדי לאפשר לכל וירוס נוכחי כדי לספוג לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני תחזוקת prewarmed, ולאחר מכן דגירת כלי הבדיקה ב- C ° 36.5 ± 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש את המראה של CPE בכל כלי בדיקה באמצעות מיקרוסקופ כל יום במשך 3 ד הראשון ולאחר מכן לבחון אותם כל 2-3 ימים עד העברת יום 14. כל כלי בדיקה המראים ≥75% CPE במקפיא נקבע אומתחת -70 ° C. להקפיא את כל התרבויות הנותרים ואת שולטת assay quantal הכולל culturable וירוס או מתחת -70 ° C לאחר בחינת כלי ביום האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את כל התרבויות ולסנן ≥15% של המדיום מכל כלי הבדיקה CPE חיובי דרך פילטר עיקור 0.2 מיקרומטר. אם הנפח המוגדר ולא ניתן להעברה דרך המסנן עקב סתימה, צנטריפוגה בינוני למשך 10 דקות ב 1,500-18,000 XG ו -4 ° C לפני הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע קטע שני של כל כלי הבדיקה מעבר -1 באמצעות כלי בדיקת BGM שטף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את כלי בדיקה החדשים עם נפח חיסון מייצג 10% של המדיום המופשר מכל כלי הבדיקה השליליים מהמדיום המסונן מכלי חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.2.4-3.4.3, אך להקפיא את כל כלי בדיקה היה שלילי ב -1 מעבר רח וחיובי על 2 nd כמתואר שלב 3.3. בצע גבה 3 rdגיל כמתואר למעבר 2 nd באמצעות הפקדים assay ו בתרביות תאים שלילי רק כי היו שליליות במהלך 1 חלוף רח וחיובי במעבר 2 nd. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי כלי בדיקה אישית כמו וירוס חיובי כאשר הם מראים CPE הוא -1 ו -2 קטעי nd או, במקרה שבו CPE אינו מתרחש עד חלוף 2 nd, הוא 2 nd ו -3 הקטעים rd. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש במחשבון המספר הסביר ביותר של USEPA עם הגדרות תכנית ברירת המחדל להגדיר כפי שמוצג בטבלה S2 לחשב את titers הווירוס של כל דגימות הבדיקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את מספר כלי הבדיקה לשכפל חיובית וירוס משלב 3.6 עבור כל מדגם הבדיקה לתוך המחשבון כדי לקבוע את ערך MPN / מ&quot;ל (M מ&quot;ל) ואת העליונות (CL UML) ונמוך (CL LML) 95% גבולות הסמך / ערכים מ&quot;ל . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Obtain ערך MPN / L (L M) של מדגם הבדיקה התואם באמצעות 2 משוואה. <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> משוואה 2 M מ&quot;ל הוא הערך MPN / ml בשלב 3.7, S הוא נפח דגימה Assay, ו- D הוא נפח של דגימת מים מקורי assayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את גבול / L אמון העליון על ידי החלפת ערך CL UML עבור הערך M מ&quot;ל. חשב את L / גבול ביטחון נמוך על ידי החלפת ערך CL LML עבור הערך M מ&quot;ל. חישוב דוגמא מוצג S4.2 סעיף וחומרים משלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דווח M מ&quot;ל ערכים של 0 כמו ≤ 1 / D. לדוגמה, ≤ 0.002 MPN / L (≤ 1/500 L) עבור דגימות מי התהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבת את ערכי גבול ביטחון MPN ו -95% עבור כל מעבדה מחוזקת בלנק המעבדה Reהסוכן בלנק ידי הכפלת המ&quot;ל / הערכים הראשונים שהושג במחשבון ידי S ולאחר מכן חלוקת התוצאה ב -0.3. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li>
<li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li>
<li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlass%2C+RI+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+surveillance--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Surveill.+Summ%22%5BJournal%5D)">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li>
<li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+infections%3A+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Pediatr.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li>
<li>Abzug, M. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbzug%2C+MJ+%22Hot+Topics+in+Infection+and+Immunity+in+Children%22">Hot Topics in Infection and Immunity in Children</a>. Finn, A., Pollard, A. J. , Springer. (2008).</li>
<li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths+from+norovirus+among+the+elderly%2C+England+and+Wales%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li>
<li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+J.+Med%22%5BJournal%5D)">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li>
<li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+murine+norovirus%2C+feline+calicivirus%2C+poliovirus%2C+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li>
<li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li>
<li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus%2C+Coxsackievirus%2C+Echovirus%2C+and+Murine+Norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li>
<li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W. 3rd, Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , U.S. Environmental Protection Agency, I. (1996).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li>
<li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J. Virus occurrence and health risks in drinking water . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+S+%22Information+Collection+Rule+Data+Analysis%22">Information Collection Rule Data Analysis</a>. McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. , AWWA Research Foundation and American Water Works Association. 437-462 (2002).</li>
<li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+RJ+%22Microbial+monitoring+of+vulnerable+public+groundwater+supplies%22">Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies</a>. , American Water Works Association. Denver, CO. (2002).</li>
<li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li>
<li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee%2C+wisconsin%2C+collected+august+1994%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li>
<li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

USEPA שיטת 1615 פותחה לשימוש במהלך מחזור הניטור השלישי של תקנת הניטור המזהמת ללא פיקוח (UCMR3) 17 ו מיועדת בעיקר למדידת התרחשות וירוס במי תהום. היא חולקת מספר צעדים משותפים עם כלל איסוף מידע (ICR) השיטה, 15,18 אבל יש שני הבדלים קלים. שניהם להשתמש מבחני quantal למדוד וירוס מייצרי CPE על משטחי תא BGM עם quantitation בהיותה מבוססת על חישובים רוב מספר Probable (MPN). השיטה 1615 מאפשרת השימוש במסנן electropositive חדש לריכוז מוירוס מטריצות מים שונים מפחיתה את מספר כלי בדיקת תרבית תאים משכפל לכל דילול מ -20 עד 10. שניהם שינויים קלים להפחית עלויות שיטה כוללות. הירידה במספר משכפל מפחית עבודה, אבל התוצאה היא גבול הגילוי נמוך במקצת. למרות groundwaters צפוי להיות בעלי ריכוזים נמוכים של וירוסים מאשר מים עיליים, 19,20 הכמות מדגם E assayed גבוה פי חמישה מריכוז של מים עיליים, פיצוי בין השאר על ההבדלים. השימוש משכפל יהיה פחות נאות עבור המים העיליים ביותר, אבל כמה ידרשו דילול מדגם. יש שיטה 1615 מספר צעדים ומגבלות קריטיים. תמציות בשר להשתנות ממגרש למגרש. כל הרבה צריך ייבדקו אפקטיבי של elution הווירוס ואת יכולת ריכוז וירוס לאורך שלבי ריכוז משני כמתואר הוא S2.3 סעיף וחומרים משלימים. השיטה משתמשת בנוסחאות מדויקות לחישוב כמות מדגם לחסן על תרביות תאים BGM ולקבוע titers וירוס. תוצאות לא מדויקות תופקנה אם נוסחות אלה אינן אחריו בקפדנות. טכניקת aseptic פרופר חייבת לשמש לשמירה על תרביות תאים. שולט נגוע תרבית תאי BGM המראים מצוקה במהלך תקופת דגירת 14 היום להצביע על בעיות סבירות עם תחזוקת תרבית תאים. בזהירות רבה גם חייבת להיות taקן במהלך pipetting השלבים הכרוכים עם חיסון של והוספת בינוני עד צלוחיות תרבית תאים, כדי למנוע זיהום צולב. פקדי האיכות המתוארים S2 סעיף חומרי משלים חייבים להיות מלווה בקפדנות. סעיף S2 גם מספק ייעוץ לפתרון בעיות איכות. המנגנון העיקרי של ספיחת נגיף electropositive מסנן אינטראקצית תשלום הקשורים לחוזק של המטען החיובי על המסנן ואת הכח של המטען השלילי &quot;הווירוס הקשורים חודה איזואלקטרית ואת ה- pH של המים נבדקים 21. Elution ממסנני מושפע גם את עוצמת האינטראקציות הללו. כי הם משתנים בין סוגי וירוס ואפילו בין זנים בתוך אותו הסוג, elution מהמסננים אינו אחיד. משמעות הדבר היא כי כל תוצאה שעלולה להמעיט בהערכת רמת בפועל של וירוס נוכחי במי סביבה. השימוש של הקו הסלולרי BGM היחיד גם מזלזל התרחשות וירוס. הטווחשל וירוס מעיים שיכולים לייצר CPE בתור תא זה בעיקר מוגבל polioviruses ו קפסיד מינים enterovirus B, כמו גם כמה reoviruses 14,15,22. סוגי וירוס מדבק אחרים לא יזוהו. החלמת poliovirus ממי קרקע כיתה המגיבה עמדה בקריטריונים לקבלת ביצועי USEPA שיטת 1615 הן הערכת הביצועים (PE; כלומר, דגימות מי כיתה מגיבה זורעת עם טיטר הידוע אנליסט המשמשים כדי להעריך את הביצועים של המטפל לפני התחילה מחקר) ודגימות LFB (S1 טבלת חומרים משלימים). התאוששות 58% ממי תהום באמצעות הליך התרבות דומה לזו שדווחה על ידי אחר באמצעות ברז מים 23,24. ההתאוששות הממוצעת מתחיילת דגימות LFB של 111% עם מקדם שונה (CV) של 100% גם פגשה את הקריטריונים לקבלת ביצועי שיטה למרות שהם גבוהים מזה שנצפה עבור דגימות PE during ICR. ICR מתכוון התאוששות מעבדתיות הייתה 56% עם מקדם השונה (CV) של 92% תוך החלמת intralaboratory ממוצע נעה בין 36 ל -85% (קו&quot;ח 58 כדי 131%; נתונים שלא פורסמו ממסד נתוני PE ICR). החלמה גבוהה נצפתה במחקר זה עבור דגימות נמוכות זרע LFB מאשר דגימות זרע גבוהות יותר (122 לעומת 42%). בזמנו כי ICR היה מתוכנן, זה היה צפוי כי דגימות PE קבלת ערכי זרע נמוכים תצטרכנה התאוששות נמוכה כי מקבלי זרעים גבוהים. דומה לזה שנצפה כאן עבור דגימות LFB, התאוששות poliovirus עבור דגימות PE ICR היו 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), ו -44% (CV 71%) עבור ערכים זרע ≤300 MPN, 300 1,500 MPN, ו&gt; 1,500 MPN, בהתאמה. ישנן שיטות רבות למדידת וירוס מדבק בדגימות מי 25. שיטה זו היא משמעותית ביחס לשיטות אחרות במידת סטנדרטיזציה. הסטנדרטיזציה לא רק כוללת בקרות איכות וביצועים,אלא גם משתמש כרכים ונוסחות מוגדרים על מנת להבטיח כי כל מעבדות האנליטיות לבצע את השיטה זהה. ללא סטנדרטיזציה, קשה להשוות את התוצאות על פני מעבדות, ולכן תקינה חיונית בעת ביצוע מחקרים רחבי היקף מעבדות אנליטיות מרובות. עם סטנדרטיזציה מובנית בשיטה זו ניתן להרחיב בעתיד לכלול סוגי וירוס נוספים שורות תאים. מחקר מתנהל כדי לספק נתונים עבור הכללת אדנו לתוך השיטה.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

וירוסים מעיים הם קבוצה מגוונת של וירוסים המדביקים מערכת העיכול האנושית ואשר מועברים באמצעות מחזור צואה-פה. וירוסים אלה להיכנס למים משטח הקרקע באמצעות מכון טיהור שפכים וקולחין בור ספיגה, בורות שופכין תוכנן או שבורה כהלכה, קווי ביוב שבורים, גלישות הביוב בשילוב, ומקורות נקודת והלא נקודה אחרת 1-4. זיהומים ומחלות אדם מפני וירוסי waterborne להתרחש באמצעות צריכת מים מזוהמים או לחטא כראוי או באמצעות מגע מים ופנאי. תסמיני המחלה עשויה להיות כרוכה קלה עד גסטרואנטריטיס חמור; דַלֶקֶת הַלַחמִית; קַדַחַת; מצוקת נשימת עליונות; מחלת הפה, הידיים והרגליים; דַלֶקֶת שְׁרִיר הַלֵב; דלקת קרום המוח; דַלֶקֶת הַמוֹחַ; שיתוק; אלח דם 5-8, ומוות 9,10. USEPA שיטה 1615 מספקת הליך למדוד חלקיקי נגיף מעיים זיהומיות במי סביבה ושתייה. מים אלה יכולים להכילתערובת של virions זיהומיות שאינם מדבק, אלא רק את חלקיקי זיהומיות להוות סיכון בריאותי פוטנציאלי. חלקיקי הנגיף מדבק לאבד infectivity לאורך זמן במים הסביבה ושתייה מאיבוד שלמות קפסיד חלבון, נזק חומצות גרעין בשל קרינת UV מפני השמש, ונזק עקב כל חומרי חיטוי שעשויים להיות נוכחים 11-13. הליך הווירוס culturable הכולל שנקבע השיטה מבוסס על הייצור של תופעות cytopathic (CPE) בכליות הקוף באפלו גרין (BGM) שורת התאים. שורת תא זו נבחרה בגלל השימוש הנרחב שלה בתחום וירולוגיה הסביבתי 14,15, למרות מגוון סוגי וירוס מדבקים שיאותרו מוגבלים בעיקר enteroviruses מסוים 15. מטרת מאמר זה היא לתאר לנהלי שיטת 1615 עבור elution של מסנני מחסנית electropositive חמש אינץ &#39;, ריכוז משני, ומדידה של וירוסי culturable הכולל. הערכה שלשיטה הכוללת מתוארת Cashdollar et al. 16.

<table><tbody><tr><td>תמצית בקר, אבקה מיובשת</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>צינורות קריוגניים</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s תמיסת מלח מאוזנת</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת נדנדה מכנית</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עיקור עם מסנן מקדים</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק עיקור</td><td>קורנינג</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>תקני</td> <td>pHסיגמא-אולדריץ'</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1018 או M4642</td><td></td></tr><tr><td>לייבוביץ L-15</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט, 7.5%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td><td>אנטיביוטיות-אנטימיקוטיות</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת שיטת epa 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות rt-qpcr. ii. assay וירוס culturable סה&quot;כ

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

נדרשת שיטה סטנדרטית כאשר מחקרים לאומיים על הופעת וירוסים במי סביבה ושתייה משתמשים במעבדות אנליטיות מרובות. שיטת 1615 של הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב (USEPA) פותחה במטרה לספק תקן כזה למדידת אנטרו-וירוס ונורו-וירוס במים אלה. הנגיף מרוכז מהמים באמצעות מסנן אלקטרו-פוזיטיבי, נפלט ממשטח המסנן עם תמצית בקר, ולאחר מכן מרוכז עוד יותר באמצעות פלוקולציה אורגנית. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול משיטה 1615 לפליטת מסנן, ריכוז משני ומדידה של סך הנגיפים הניתנים לתרבות. חלק מהפליטה המרוכזת מכל דגימה מחוסן על עשר צלוחיות משוכפלות של תאי כליה של באפלו גרין קוף. מספר הצלוחיות המדגימות השפעות ציטופתיות משמש לכימות המספר הסביר ביותר (MPN) של יחידות זיהומיות לליטר. השיטה משתמשת במספר בקרות איכות כדי להגביר את איכות הנתונים ולהפחית את השונות הבין-מעבדתית והתוך-מעבדתית. מעבדות חייבות לעמוד בתקני ביצועים מוגדרים. שיטה 1615 הוערכה על ידי בחינת התאוששות הנגיף ממי תהום בדרגת ריאגנט ומי תהום שנזרעו בנגיף פוליו סבין מסוג 3. ממוצע המחלימים מנגיף הפוליו עם סך הבדיקה הניתנת לתרבות היה 111% במים בדרגת ריאגנט ו-58% במי תהום.

וירוס התרכז מהמקור מי התהום של מתקני טיהור מי שלוש שתייה מסננת electropositive באמצעות היטב פרטי. שני סטים מדגמים, מורכבת מדגם שדה ובקרת LFSM, נאספו מתקני הטיהור בהזדמנויות נפרדות, וערכת דגימה אחת נאספה מן הבאר הפרטית. התאוששות וירוס בסך הכל נקבע באמצעות דגימות LFSM משני של צמחים ובעלי הבאר פרטית (שתי דגימות מצמח אחד מדגם אחד למשנהו לא נכללו בחישוב מפני ששווי MPN מזרע בשימוש עם כל דגימה לא ניתן לקבוע במדויק בשל לתוצאות CPE נורמליות בין צלוחיות לשכפל). Mean התאוששות poliovirus ממדגמים תהום בממוצע 58% עם מקדם השונה של 79% (איור 2) 16. אין וירוסי culturable זוהו באף אחד דגימות תחום מים הכפולות unseeded קרקע. ביצועי שיטה גם נמדדו באמצעות LFB samples שונה באמצעות שתי רמות זרע שונות. כייל &quot;נמוך&quot; של 300 MPN של poliovirus שמש להעריך את ביצועים ברמות פחות מאשר 500 MPN LFB הרמה &quot;הסטנדרטית&quot; המשמשת USEPA שיטת 1615. כייל &quot;גבוה&quot; של 1,000 MPN של poliovirus שמש כדי לבדוק ביצועים בבית רמת השליטה LFSM. בקרות אלה באופן דומה עם התאוששות ממוצעת של 111% וכן מקדם שונה של 100% (איור 2). כל LRB הדגימות היו שליליות וכל דגימות LFB בצעו בטווח הקבלה (S1 טבלת חומרים משלימים). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> איור 1. מסנן Elution. סכימטי לשימוש במיכל הלחץ elution מסנן מחסנית מוצג. לחץ אוויר חיובי משמש לדחוף פתרון תמצית בשר במיכל הלחץ דרך con דיור מחסניתtaining מסנן מחסנית electropositive. משאבת peristaltic ניתן להחליף עבור מיכל הלחץ, עם הכניסה של המשאבה שתוצב בתוך המכל מחזיק פתרון תמצית בשר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> איור 2. ממוצע poliovirus Recovery (%) מגראונד ו מגיב-כיתה מים. ההתאוששות אחוז ממוצע מוצג עבור שנגיף הפוליו מן הקרקע ( <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) ומים מגיבים כיתה ( <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) דגימות. שנים עשר דגימות מים כיתה מגיב כלל שישה זורעים עם 300 MPN ושישה זורעים עם 1,000 MPN של poliovirus. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן.

כאן אנו מציגים נוהל למדידת סך כל הנגיפים הניתנים לתרבית באמצעות קו תאי הכליה של הקוף הירוק של באפלו. הנוהל מספק כלי סטנדרטי למדידת הופעת נגיפים זיהומיים במי הסביבה ובמי השתייה.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

המטרה הכוללת של הפרוטוקול הבא היא למדוד את רמת חלקיקי הנגיף הזיהומיים בדגימת מים. מטרה זו מושגת על ידי שימוש בתמיסת מיצוי בסיסית כדי לאלוט חלקיקי נגיף בעלי מטען שלילי ממסנן אלקטרו-חיובי שרוכזו בו נגיפים ממי שתייה או ממי סביבה. איסוף הנגיפים על גבי מסנן מחסית אלקטרו-חיובי מכוסה בחלק הראשון של סדרה זו.בשלב השני, ה-pH של האלוואט מופחת באיטיות, דבר הגורם להיווצרות פלוק (flock) של חלבוני המיצוי והנגיף הנוכחים בדגימה. לאחר מכן, הפלוק נאסף באמצעות סנטריפוגציה, מומס בבופר סודיום פוספאט, ועובר סטריליזציה בסינון להסרת חיידקים ועובש. בשלב הבא, האלוואט המרוכז הסופי מוחדר לתאי כליה של קוף ירוק מבאפלו, והתאים נבחנים לאיתור אפקט ציטופתי, או CPE, למשך 14 ימים, כדי לזהות שעתוק של הנגיף.כדי לשחרר חלקיקי נגיף הקשורים לתאים, כל מבחנות התאים מוקפאות בתום 14 ימים, או כאשר ה-CPE בכל מבחנה הוא 75% ומעלה. לאחר מעבר שני ושלישי כדי לאשש כי ה-CPE נובע משכפול נגיפים, נעשה שימוש בתוכנת מחשב לחישוב המספר הסבירי ביותר, או MPN, כדי לקבוע את המספר הסבירי ביותר לליטר של כל דגימה שנבדקה. בסופו של דבר, מרכיב חומצת הנגיף הניתן לתרבית הכולל של שיטת EPA 1615 מספק מדד לרמת חלקיקי הנגיף המדבקים בדגימת המים.בדיקת סך הנגיפים זו היא רק מרכיב אחד של שיטת EPA 1615. השיטה המלאה מודדת את השכיחות של enterovirus ו-norovirus במים לשתייה ובמי סביבה. ממצאים של נגיפים כלשהם יכולים לשמש לאחר מכן כנתוני קלט למדידת הסיכון מחשיפה לנגיפים אלה במי שתייה ובמי פנאי.היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק גישה סטנדרטית אחת למדידת נגיפים במים. הגישה מבוססת למעשה על שיטת Information Collection Rule שפורסמה בשנת 1996. הבעיה העיקרית שנתקלים בה חוקרים חדשים בשיטה זו היא שמירה על שורת התאים BGM נקייה מזיהומים ופענוח של CPE, או אפקטים ציטופתים.שיי פוט ואני נדגים את נהלי האלוציה והפלוקולציה האורגנית, ולאחריהם את טכניקת תרבית התאים. כדי לבצע את האלוציה הראשונה, מקריו 500 milliliters של תמצית בקר 1.5% בבופר בטמפרטורת החדר, pH 9.0, למדוד של משבצת. לאחר מכן, פתחו את בית מחסנית המסנן, והוסיפו כמות מספקת של תמצית בקר כדי לכסות את המסנן האלקטרופוזיטיבי לחלוטין.העבירו את שאר תמצית הבקר לכוס כימית. החזירו את המכסה למעטפת המסנן. לאחר דקה אחת של זמן מגע, השתמשו במשאבה פריסטלטית ובצינור סטרילי כדי להעביר לאט את תמיסת תמצית הבקר שבמעטפת, יחד עם זו שנותרה בכוס הכימית, דרך המסנן.אסוף את התסנין (eluate) לתוך כוס כימית מזכוכית סטרילית בנפח 2 ליטר. חזור על שלבים אלו עם 500 מיליליטר נוספים של תמצית בקר בריכוז 1.5% בבופר, אך השתמש בזמן מגע של 15 דקות. הוסף את תמצית הבקר מהאלוציה השנייה לכוס הכימית בנפח 2 ליטר המכילה את התסנין מהאלוציה הראשונה, והוסף לכוס מגנט ערבוב סטרילי.הניחו את הכלי עם התשלוף (eluate) על פלטפורמת ערבוב. הדליקו את הפלטפורמה והגבירו את מהירות הערבוב עד להיווצרות מערבולת. התאימו לאט את ה-pH של התשלוף ל-3.5 פלוס או מינוס 0.1 על ידי הוספה טיפטופית של חומצה כלורית בריכוז 1.2 molar, או HCL.הוסיפו את החומצה באופן מדורג (טיפה אחר טיפה), מכיוון שהוספה מהירה תשבית את הנגיף. במהלך זמן זה, התמיסה שנשטפה (eluate) תהפוך לעכורה, עם תחילת היווצרות משקע. הפחיתו את מהירות הערבוב לערבוב איטי, והמשיכו לנטר ולשמור על pH של 3.5 פלוס או מינוס 0.1 בתמיסה שנשטפה, בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר מכן, שפכו את תרחיף תמצית הבקר שהשקיעה לתוך בקבוק צנטריפוגה אחד או יותר, וסובבו בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-2,500 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הוציאו את הבקבוקים מהצנטריפוגה, ושפכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) כדי למנוע אובדן של המשקע. ניתן להשליך את הנוזל העליון.עבור מנות של תמצית בקר שנמסות תוך 5 דקות, יש להוסיף 30 milliliters של נתרן פוספט 0.15 molar, pH 9.0, לבקבוק הצנטריפוגה המכיל את המשקע. עיין בפרוטוקול הכתוב להוראות להמסת משקעים שאינם נמסים תוך חמש דקות. ערבב במשך 10 דקות לאחר שהמשקע נמס לחלוטין.בשלב הבא, הוציאו את מוט הבחישה וסבבו במ centri-fuge את המשקיף המומס למשך 10 דקות, ב-4,000 עד 10,000 times g, ובטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. שפכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) לתוך כוס כימיקה מזכוכית מבלי להפריע למשקע (pellet). הוסיפו מוט בחישה לכוס והשליכו את המשקע.הנח את הכוס על בוחש מגנטי וערבב את התמיסה. הוסף HCl 1.2 molar בטפטוף כדי לכוון את ה-pH לערך שבין 7.0 ל-7.5. בצע סטריליזציה של הנוזל העליון באמצעות סינון במעבר דרך מסנן סטרילי הכולל מסנן מקדים שטופל מראש ב-15 milliliters של תמצית בקר 1.5% בבפר, pH 7.0 עד 7.5.עיינו בפרוטוקול הטקסט כדי לחשב את נפח דגימת הבדיקה, S, עבור כל דגימות הבדיקה. לאחר מכן, חשבו את נפח התמים על ידי חלוקת S ב-10. בהתבסס על חישובים אלה, חלקו את נפח הדגימה המרוכזת הסופי, שהיא הדגימה המתקבלת לאחר סטריליזציה בסינון, לשלוש תתי-דגימות, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.בצע הדבקה של 10 כלי בדיקה המכילים שכבה אחת של תאי BGM עבור כל דגימת בדיקה, עם נפח של תת-דגימה אחת השווה ל-Inoculum Volume, יחד עם בקרות בדיקת הכמות של הנגיף הניתן לתרבית. עבור ה-Lab Fortified Blank וה-Lab Fortified Sample Matrix, הכן מהלולי דילול של פי 5, 25 ו-125 באמצעות תת-דגימה שלוש ו-0.15 molar sodium phosphate, pH 7.0 to 7.5, כחומר מדלל. בנוסף לכלים שהודבקו בתת-דגימה אחת לא מדוללת, הדבק 10 כלי בדיקה של תרבית תאים שטופים עבור כל סדרת דילול, תוך שימוש ב-Inoculum Volume בכל כלי בדיקה.פזרו את האינוקולום על פני השכבות Ein-cell של התאים, על ידי הטיה של הכלי קדימה ואחורה. דגרו את כלי הבדיקה בטמפרטורת החדר למשך 80-120 דקות על פלטפורמת נדנוד מכנית בקצב של תנודה אחת עד חמש תנודות לדקה, או באמצעות נדנוד של הכלי כל 15 עד 20 דקות, כדי לאפשר לכל וירוס שנמצא להיספג בתאים. לאחר מכן, הוסיפו למכלי הבדיקה מצע תחזוקה שחומם מראש, לפני דגירתם בטמפרטורה של 36.5 פלוס או מינוס מעלה אחת צלסיוס.חפשו הופעה של אפקטים ציטופתיים בכל כלי בדיקה באמצעות מיקרוסקופ במהלך שלושת הימים הראשונים, ולאחר מכן בחנו אותם מדי יומיים עד שלושה ימים עד ליום ה-14. העבירו כל כלי בדיקה המראה אפקטים ציטופתיים של יותר מ-75% למקפיא המכוון לטמפרטורה של minus 70 °C או פחות. לאחר בדיקת הכלים ביום האחרון, הקפיאו את כל התרביות הנותרות ואת בקרות בדיקת הכמות הכוללת של נגיפים הניתנים לתרבית בטמפרטורה של minus 70 °C או פחות.לאחר מכן, הפשיתו את כל התרביות, וסננו יותר מ-15% מהתווך מכל כלי בדיקה חיובי ל-CPE, דרך מסנן סטריליזציה של 0.2 מיקרון. השלב הבא הוא ביצוע מעבר שני של כל כלי הבדיקה מהמעבר הראשון תוך שימוש בכלי בדיקה של תאי כליה BGM שטופים. לשם כך, חסנו את כלי הבדיקה החדשים עם נפח חסון המהווה 10% מהתווך שהופשר מכל כלי הבדיקה השליליים, וכן מהתווך המסונן של הכלים החיוביים.חזור על השלבים שבוצעו במעבר הראשון, והקפא כל כלי בדיקה שהיה שלילי במעבר הראשון וחיובי בשני. לאחר מכן, בצע מעבר שליעי כפי שמתואר עבור המעבר השני, תוך שימוש בבקרי הבדיקה השליליים בלבד, ובתרביתי תאים שהיו שליליים במהלך המעבר הראשון וחיוביים במעבר השני. זהה כלי בדיקה בודדים כחיוביים לנגיף כאשר הם מראים אפקטים ציטופתיים הן במעבר הראשון והן במעבר השני, או, במקרה שבו אפקט ציטופתי אינו מופיע עד למעבר השני, הן במעבר השני והן במעבר השלישי.השתמשו במחשבון ה-Most Probable Number של הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב (U.S. Environmental Protection Agency), כאשר הגדרות התוכנית ברירת המחדל מוגדרות כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב, כדי לחשב את תיתורי הנגיפים של כל דגימות הבדיקה. לאחר מכן, השתמשו בערכים שהתקבלו עבור ה-Most Probable Number של יחידות זיהום למיליליטר, בנוסף לגבולות אמון העליונים והתחתונים למיליליטר, כדי לחשב את ה-Most Probable Number של יחידות זיהום לליטר, ואת גבולות האמון המתאימים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. אחוז השחזור הממוצע מוצג עבור Poliovirus מדגימות מים מהקרקע ומדגימות מים בדרגת רהיט (reagent-grade).ממוצע השחזור של Poliovirus מדגימות מי תהום היה 58% עם מקדם וריאציה של 79%. לא זוהה נגיף שניתן לתרבית באף אחת מהדגימות הכפולות של מי תהום מהשטח שלא נזרו). ביצועי השיטה נמדדו גם באמצעות דגימות Lab Fortified Blank, ששונו על ידי שימוש בשתי רמות זריעה שונות. שתים עשרה דגימות של מים בדרגת ריאגנט כללו שש דגימות שנזרעו ב-300 MPN של יחידות זיהומיות, ושש דגימות שנזרעו ב-1,000 MPN של יחידות זיהומיות של Poliovirus.ביקורות אלו הראו תוצאות דומות, עם השבה ממוצעת של 111% ומקדם וריאציה של 100%. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בטכניקה אסיפטית ובנהלי מעבדה תקינים כדי למנוע זיהום של הדגימות. כמו כן, חשוב לזכור כי בעבודה עם פתוגנים ויראליים, יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בכפפות בכל פעם שמבצעים פרוצדורה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן דילול וירוסים ושימוש במסננים אלקטרופוזיטיביים, וכן ביצוע פלוקולציה אורגנית ובדיקות תרביות תאים.בנוסף להליך זה, ניתן לבצע גם בדיקות מולקולריות לזיהוי וגילוי של סוגי נגיפים נוספים.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

שיטת EPA 1615 משתמשת במסנן אלקטרו-פוזיטיבי כדי לרכז אנטרו-וירוסים ונורו-וירוסים במי הסביבה ובמי השתייה. כתב יד זה מתאר את הליך איסוף הדגימות לניתוחי שיטה 1615.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

כאן אנו מציגים הליך לכימות אנטרו-וירוס ונורו-וירוס במי סביבה ושתייה באמצעות PCR כמותי של שעתוק הפוך. התאוששות הנגיף הממוצעת ממי תהום עם הליך סטנדרטי זה משיטת EPA 1615 הייתה 20% עבור נגיף הפוליו ו-30% עבור נורו-וירוס עכברים.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

מתודולוגיית דגימה מבוססת קצף מאקרו פותחה והוערכה לאיתור וכימות של נורו-וירוס על משטחים קשים סביבתיים.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

פותחה גישה לזיהוי תנאי ריכוז נגיפי אופטימליים עבור דגימות מים בנפח קטן באמצעות קוצים של אדנו-וירוס אנושי. הטכניקות המתוארות כאן משמשות לזיהוי פרמטרי ריכוז עבור מטרות נגיפיות אחרות, ומיושמות על ניסויים בריכוז נגיפי בקנה מידה גדול.

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת spp אנטרוקוקוס זמנית. ואת סמנים גנטיים HF183 כאינדיקטורים לזיהום צואתי כללית אדם הקשורים במים פנאי.

Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; Spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

אנו מציגים את VacuSIP, שיטה פשוטה, לא פולשנית ואמינה לדגימה נקודתית נקייה ומדויקת של מים. המערכת פותחה והוערכה לאיסוף בו-זמני של המים הנשאפים והנשפים על ידי מזיני תרחיף בנתיים באתרם, כדי למדוד בצורה נקייה הסרה והפרשה של חלקיקים ותרכובות מומסות.

VacuSIP, שיטת INEX משופרת<em&gt; באתרו</em&gt; מדידה של חלקיקים מומס תרכובות מעובד על ידי האכלת השעית Active

הנייר הזה מדווח הפרוטוקול עבור וזמינותו זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק מבוסס על טכנולוגיית בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה). הפרוטוקול דורש הכשרה מינימלית מעבדה, לכן, ניתן ליישם באתר בנקודות של ערך היבוא צמח כגון הקנתה ושדות תעופה.

בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק

פרוטוקול זה מאבחן אמנון אגם וירוס (TiLV) ברקמות אמנון באמצעות מתודולוגיות RT-PCR. השיטה כולה מתוארת מן דיסקציה רקמות כדי הכולל החילוץ RNA, ואחריו cDNA סינתזה וזיהוי של TiLV באמצעות PCR קונבנציונאלי או PCR כמותי באמצעות dsDNA מחייב צבע הכריכה פלורסנט.

זיהוי של אמנון אגם וירוס באמצעות קונבנציונאלי RT-PCR ו SYBR ירוק RT-qPCR

עיצוב מיקרועלילה למשך 15N מחקר המחקר מתואר כדי להכיל מספר רב של העונה באירועים המפעל הקרקע. הליכי איסוף ועיבוד של הקרקע והצומח, כולל פרוטוקולים לטחינת ושקילה, עבור הניתוח של 15N מושם.

מיקרועלילה עיצוב וצמח הכנה לדגימת קרקע עבור 15ניתוח חנקן

למדו שיטה סטנדרטית לזיהוי נגיפים זיהומיים במי שתייה ומי סביבה באמצעות תרביות תאי כליה של Buffalo Green Monkey. השיטה מבוססת על פרוטוקול EPA 1615 ומסייעת בהערכת סיכוני בריאות ציבורית.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה"כ

גלה סרטונים נוספים