איתור של Exosomal ביומרקר על ידי שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM)

המטרה הכללית של הליך זה היא להוציא אקסוזומים מנוזלים ביולוגיים ביעילות, לשחרר את התוכן שלהם ולנתח את התוכן במהירות. דבר זה מושג תחילה על ידי הפקת אקסוזומים מנוזלים ביולוגיים באמצעות מיקרו-חלקיקים מגנטיים עם נוגדנים המכוונים לסמני אקסוזומים, ולאחר מכן על ידי העמסת האקסוזומים שהופקו על פני שטח של אלקטרודה. לאחר מכן, האקסוזום עובר ליזה באמצעות שדה חשמלי ותוכן האקסוזום עובר היברידיזציה עם גששים על פני השטח של האלקטרודה.

מולקולת דיווח (reporter molecule) מגיבית גם היא למערכת. השלב הסופי הוא הוספת תמיסת סובסטרט למשטח האלקטרודה ולאחר מכן קבלת הקריאה על ידי מדידת הזרם החשמלי. בסופו של דבר, מדידה אלקטרוכימית של הזרם משמשת להצגת כמות החומצה הגרעינית או תכולת החלבון בדגימת האקסוזום.

היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו על פני השיטות הקיימות, כגון אולטרה-צנטריפוגה ובופר ליזין, הוא שמדובר בשיטה פשוטה ומהירה למיצוי ובדיקה של תוכן אקסוזומים. אנו נרגשים מאוד מטכנולוגיה זו, שכן לראשונה, טכנולוגיית efim זו מאפשרת לנו לנצל את המידע המופרש על ידי איברים במצב מחלה או במצב תקין, אשר מופרש מהאיבר ממנו מקורו דרך מערכת כלי הדם ועד הגעתו לחלל הפה. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו ללכוד מידע זה ולשחרר את התוכן המולקולרי, אותו אנו יכולים לזהות בו-זמנית ובאופן גמיש.

מידע זה מבחין בין מחלות. באופן כללי, משתמשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להיתקל בקשיים, שכן השימוש במיקרו-חלקיקים מגנטיים עלול להיות מאתגר אם אין נקיטת זהירות. יתרה מכך, השימוש בשיטות אלקטרוכימיות לניתוח דגימות ביולוגיות עשוי להוות פרדיגמה חדשה עבור חלקם. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהשימוש במיקרו-חלקיקים מגנטיים והטעינה החשמלית הם נושאים שקשה ללמוד. יש לנהוג בזהירות מיוחדת בעת טיפול במיקרו-חלקיקים מגנטיים ובעת טעינתם על האלקטרודות.

כדי להתחיל, השביו מחדש תמיסת מלאי המכילה 10 µg/mL של מיקרו-חלקיקים מגנטיים מצופים ב-streptavidin והוסיפו 5 µL מהתמיסה למבחנה למיקרו-צנטריפוגה המכילה 495 µL של PBS לשטיפת החרוזים. ראשית, הניחו את המבחנה על מתקן מגנטי למשך דקה אחת והסִירו בזהירות את הבופר מבלי להשפיע על החרוזים.

לאחר מכן העבירו את המבנה למסגרת שאינה מגנטית. הוסיפו 500 µL של PBS וביצעו PET כדי לשטוף את החרוזיים. חזרו על פעולה זו שלוש פעמים בסך הכל; לאחר השטיפה האחרונה, השתמשו שוב.

השביה את החרו지를 ב-490 µL של PBS ולאחר מכן הוסף 5 µL של נוגדן עכבר אנטי-אנושי CD 63 מסומן בביוטין מתמיסת מלאי בריכוז 1 mg/mL. ערבב את התמיסה באמצעות פיפטור; תכנת מסובב דגימות (sample rotator) לסיבוב הדדי בזווית של 90 מעלות למשך חמש שניות ורעידה בזווית של 5 מעלות למשך שנייה אחת. הנח את המבחנות במסובב והפעל את התוכנית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, העבירו את המבחנות למערך המגנטי למשך חמש דקות. שטפו את החרוזיים שלוש פעמים עם 500 microliters של PBS ולאחר מכן השעיו אותם שוב ב-490 microliters של PBS המכיל Caine. סמנו מבחנה עם זיהוי הדגימה ולאחר מכן הוסיפו 10 microliters מהדגימה, ובצעו פיפוט מספר פעמים כדי לערבב את הדגימה עם החרוזיים המצומדים לנוגדן.

לאחר מכן, העבירו את המבחנות למסובב הדגימות והפעילו את אותה תוכנית למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 500 µL של בופר tris hydrochloride בריכוז 1 M. באמצעות ה racks הממגנט, האקסוזומים קשורים כעת לחרוזים הממגנטים כדי להכין את האלקטרודה.

ראשית, דוהלו במים מזוקקים את תמיסות המלאי של הגשש, הפוטסיום כלוריד ואת המונומר של האוליגו. גשש ה-DNA הביוטיניליר בן חמישה פרימרים ספציפי ל-mRNA של GAPDH. ערבבו את תמיסת הגשש המונומרית באמצעות וורטקס.

השתמש במערך של 16 אלקטרודות חיישנים, שבו כל אלקטרודת יחידה מורכבת מאלקטרודות עבודה, נגד ומספר העשויות מזהב נקי. הנח באר פלסטיק על מערך האלקטרודות כדי למנוע זיהום צולב של האלקטרודות. העבר 60 µL של תמיסת פרוב המonomer למשטח של אלקטרודת זהב, כך שאלקטרודות העבודה, הנגד והמספר יהיו מכוסות בנוזל.

החילו פרופיל שדה חשמלי של גל ריבוע מחזורי, הידוע כמרחב שדה A-C-S-W-E, כדי לבצע פולימריזציה אלקטרוכימית של פרוב מונומר. פעולה זו יוצרת שכבת פולימר מוליכה על פני השטח של האלקטרודה. שטפו את החיישן שלוש פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן ייבשו אותו באמצעות גז חנקן כדי להסיר נוזלים מפני השטח של האלקטרודה.

לאחר טיפול מקדמי של האלקטרודה עם הגשוש הלוכד, הוסף 5 µL של תמיסה בריכוז 1 µM של הגשוש הגשש ל-495 µL של תמיסת קומפלקס החרוגים-אקסוזומים, ולאחר מכן ערבב באמצעות פיפטינג. הגשוש הוא פריימר DNA מסומן בفلואורסצאין בקצה '3, הספציפי ל-GA dh. הנח מערך אלקטרודות שעבר טיפול מקדמי מעל מערך מגנטים המורכב מ-16 מגנטים המיושרים לאלקטרודות העבודה של החיישן.

לאחר מכן, העבירו 60 µL של תמיסת חרוזי האקסוזומים למשטח האלקטרודה. החילו שדה A-C-S-W-E למשך 20 מחזורים. המטען האקסוזומלי ששוחרר יתרחב (hybridize) אל הגשושית שעל משטח האלקטרודה.

שטוף את פני האלקטרודה שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר אנליטים שאינם קשורים, ולאחר מכן ייבש את האלקטרודה באמצעות גז חנקן. לאחר מכן, הכן דילול של 1:1000 של נוגדן anti-fluorescein המשולב עם HRP ב-PBS המכיל Casein. לאחר מכן, הוסף 60 µL של תמיסת הנוגדן המדוללת לפני האלקטרודה.

החל את שדה ה-A-C-S-W-E על פני השטח של האלקטרודה כדי לצמד את הנוגדן anti fluorescein HRP לפרובה הגלאית. שטוף את פני השטח של החיישן שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר נוגדנים עודפים, ולאחר מכן ייבש את האלקטרודה באמצעות גז חנקן. לאחר מכן, העמס 60 µL של סובסטרט TMB על פני השטח של כל חיישן באמצעות פיפטה רב-ערוצית, ומדוד את זרם האלקטרודה ב-200- mV למשך 60 שניות באמצעות מכשיר למדידת פוטנציאלים אלקטרוכימיים.

כדי לקבל את תוצאות ה-tric, נעשה שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) כדי לקבוע אם האקסוזומים נקשרו לחרוזי המגנט. הגרנולות בגודל של 70 עד 100 ננומטר הצמודות לחרוזים תואמות לגודל הידוע של אקסוזומים לאחר ליזיס על ידי שדה חשמלי או דטרגנט. לא נראים אקסוזומים בסביבת החרוזים.

GA DH mRNA באקסוזומים זוהה באמצעות קריאת atric. כמות ה-GA DH הנוכחת לאורך זמן פוחתת כמצופה בעקבות ליזיס של האקסוזומים על ידי השדה החשמלי או דטרגנט, מה שמעיד על חשיפה לסביבה החוץ-וסיקולרית של הרוק. Efim שימש למדידת התוכן האקסוזומלי של הסרום והרוק של עכברים שהוזרקו להם תאי סרטן ריאה אנושיים המייצריםים סמן אקסוזומלי אנושי CD 63 GFP.

לאחר 20 ימים, נמצאו רמות גבוהות יותר של CD 63 GFP הן בסרום והן ברוק של העכברים שהוזרקו תאי סרטן, אך לא בעכברים שהוזרקו תמיסת סליין. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להימנע מלגעת בחרוזים כדי להוציא כמות מספקת של נוזל בעת שטיפת החרוזים לשטיפה אחידה של פני האלקטרודה, ולהטעין את האזורים על האלקטרודה כראוי. טכנולוגיה זו, טכנולוגיית efim, סיפקה את היכולת הקריטית והבלתי מענה להבין כיצד מחלה סיסטמית, באיבר מרוחק, יכולה לשחרר את המידע שלה ולחשב אותו בישות זו הנקראת אקסוזומים.

כיצד הן מגיעות לרוק, לחלל הפה שלנו, ומסוגלות ללכוד את האקסוזומים, לשחרר את המטרות המולקולריות הללו, ולאפשר את זיהוין בו-זמנית עבור מחלות מאיימות, כגון סוכרת, סרטן הלבלב או הפרעות מסכנות חיים אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להפיק במהירות אקסוזומים מנוזל ביולוגי, כיצד לפרוק את המטען של האקסוזומים, וכיצד לנתח במהירות את תוכנם של האקסוזומים באמצעות מערכת אלקטרודות משולבת.