Transposon מתווך האינטגרציה של פלסמיד דנ"א לתוך אזור Subventricular של עכברים בילוד ליצירת מודלים חדשניים של גליובלסטומה

מטרת הליך זה היא ליצור מודלים חדשים לגליובלסטומה ובסופו של דבר לפתח גישות טיפוליות חדשות על ידי גרימת היווצרות גליובלסטומה המכילה מוטציות גנטיות ספציפיות בעכברים. זה מושג על ידי יצירת פלסמידים טרנספוזונים, המקודדים את הגנים הספציפיים המעניינים. השלבים הבאים הם הכנת הפלסמידים עם מגיב טרנספקציה והזרקתם לחדר הצדדי של עכברים יילודים.

לאחר מכן מנוטרים הספיגה בהתקדמות הגידול על ידי זוהר. כאשר בעלי החיים הופכים לשופעים יותר, הם מוקרבים לניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי. לפיכך, גליובלסטומות חדשות עם שינויים גנטיים ספציפיים מושרות בסוג בר או רקע גנטי ממוקד.

ניתן לחקור גידולים אלה in vivo או להשתמש בהם במבחנה ליצירת קווי תאים חדשים הניתנים לניתוח ביוכימי וניסויים ציטוטוקסיים באמצעות חומרים כימותרפיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כמו למשל, הזרקות אורתוטופיות של קו תאי גליובלסטומה, הוא שגידולים מושרים על ידי טרנספורמציה ממאירה של תאים אנדוגניים לבעל חיים בעל יכולת חיסונית אחת באמצעות שינויים גנטיים שנבחרו באופן ספציפי מאוד. תהליך זה משחזר את האטיולוגיה של המחלה האנושית מקרוב יותר ומסכם את המאפיינים ההיסטופתולוגיים הבולטים של GBM אנושי.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-אונקולוגיה, כגון מהן המוטציות המניעות האחראיות להשראת סוגים שונים של גליובלסטומה מולטיפורמה, קלאסית, קדם עצבית, עצבית במבוגרים או בגידולים בילדים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול ב-GPM מאז כימותרפיה חדשה. טיפולים חיסוניים בקרינה או שילוב שלהם יכולים להיבדק במהירות יחסית in vivo או in vitro באמצעות מודל זה.

הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כששוחחתי עם עמיתי, ד"ר ג'ון מאוניברסיטת מינסוטה, שפיתח את המודל הראשוני של גידול המוח באמצעות היפהפייה הנרדמת מעבירה אינטגרציה מתווכת של אונקוגנים, מעכב גנים מדכאי גידול לתוך הדנ"א הגנומי של המארח. חשבתי שהמתודולוגיה הזו תהיה חזקה מאוד לחקור את ההשפעה של מוטציות חדשות על התקדמות הגידול ולסייע בפיתוח טיפולים ממוקדים לסרטן המוח שלושה עד ארבעה שבועות לפני הניסוי, להקים כלוב רבייה של עכברים עם זכר אחד ונקבה אחת, לכלול איגלו פלסטיק צבעוני כדי להעשיר את הסביבה ולהגדיל את סיכויי ההזדווגות. הסר את הזכר לאחר אישור ההריון, ו-18 יום לאחר יום ההזדווגות, התחל לעקוב אחר הנקבה ללידה.

ודא שאם פונדקאית זמינה בסביבות מועד הלידה. ביום הראשון לאחר הלידה, בצע את הזריקות התוך חדריות. הכן את תמיסת ההזרקה על ידי עלי תחילה, תוך ציטוט של 20 מיקרוליטר מתערובת ה-DNA המכילה את הטרנספוזיציה על פלסמידים בריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם DNA למיקרוליטר.

לאחר מכן, בכמות של 20 מיקרוליטר של תמיסת PEI לתמיסת ה-DNA ותנו להם לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד שעה, ולאחר מכן יש לאחסן את התערובת על קרח. עבור מחט ההזרקה, חבר מזרק של 10 מיקרוליטר למחט היפודרמית בגודל 30, משופעת ב-12.5 מעלות. לאחר מכן חבר את המזרק למשאבת מיקרו עם הזרקה אוטומטית.

בדוק את ההתקנה עם 10 מיקרוליטר מים והקפד לרוקן את המזרק. כעת, קררו את השלב הסטריאוטקסי של היילודים עם תערובת של קרח יבש ואלכוהול. כאשר הוא מקורר בין שתיים לשמונה מעלות צלזיוס, המשך בזריקות.

ראשית יש להרדים גור על ידי הנחתו על קרח למשך שתי דקות. בזמן שהגור על קרח, טען את המזרק בתמיסת ההזרקה. לאחר ההרדמה, העבירו את הגור למסגרת ושותקו את ראשו בין מוטות האוזניים המכוסים בגזה.

בדוק שהצד הגבי של הגולגולת אופקי ומקביל למשטח המסגרת. כמו כן, תפרי הגולגולת צריכים להיות גלויים בבירור. אם ראש הגור אינו משותק מספיק חזק, הוא יזוז במהלך ההזרקה.

בעוד שאם הוא נלחץ חזק מדי בין מוטות האוזניים של המסגרת, הלמבדה לא תהיה גלויה והלחץ בתוך הראש יאלץ את התמיסה המוזרקת לדלוף החוצה כשהגור אחוז בחוזקה במסגרת, נגב את הראש עם אתנול 70%, ולאחר מכן הורד את המחט והתאם את מיקומה כך שהיא תיגע בלמבדה. לאחר מכן, הרם את המחט והזיז אותה 0.8 מילימטרים לרוחב ו -1.5 מילימטרים. לאחר מכן הורד אותו שוב עד שהוא גומות מעט את העור.

רשום את הקואורדינטות של עמדה זו. לאחר מכן הורד את המחט, 1.5 מילימטרים דרך העור והגולגולת ולתוך קליפת המוח בחדר הצדדי שם. הזרקו 0.75 מיקרוליטר במשך 90 שניות, והמתינו דקה כדי לתת לתמיסה להתפזר בזמן ההמתנה.

ניתן להרדים את הגור הבא שיוזרק. לאחר המשקל, הרם לאט את המחט, ולאחר מכן העביר את הגור למקום התאוששות מתחת למנורת חימום. הזמן מהרדמה להתחממות חייב להיות פחות מ -10 דקות.

ככל שיותר מהר יותר כך טוב יותר לפקח על הנשימה שלו, ובמידת הצורך, לשפשף בעדינות את הגפיים כדי לעורר את הנשימה. לאחר שהגור מתחמם, יש לו צבע ורוד ונשימה יציבה, החזירו אותו לאמו. זה בדרך כלל לוקח חמש עד שבע דקות מההזרקה.

אם מזריקים כמה גורים, יש להחזיר את כולם לפני החזרתם לאם. אם לאחר חצי שעה כל הגורים לא מוכנים, החזירו לה מחצית מהם ואז החזירו את השאר מאוחר יותר בסוף ההליך, עקבו אחר הסכר. לאחר החזרת הגורים.

אם היא לא מגיבה לגורים, הוסף את האם הפונדקאית לכלוב. 24 עד 72 שעות לאחר ההזרקה, עקוב אחר ספיגת הפלסמיד והעביר את כל הגורים לשש מנות תרבית רקמות באר גור אחד לכל באר. לאחר מכן טען מזרק מיליליטר אחד עם 30 מיליגרם למיליליטר לוציפר במי מלח או PBS וחבר מחט היפודרמית בגודל 30

הזריקו 30 מיקרוליטר תמיסה תת עורית בין השכמות של כל גור כדי למנוע פציעה של הגור, הזריקו את התמיסה מתחת לקפל עור קטן. העבירו מיד את הגורים למערכת הדמיה ביולומינסנציה in vivo. הגדר רצף כדי לקבל ארבע תמונות עוקבות במרווחי זמן של דקה אחת עם חשיפה אוטומטית, סבב גדול וצמצם של אחד. מאוחר יותר.

לאחר כ-17 יום, בעלי החיים עשויים להתחיל ליצור גידולים מקרוסקופיים הניתנים לזיהוי על ידי ביולומינסנציה והיסטולוגיה. ייתכן שיידרשו עד שישה שבועות לניטור הגידולים. הזרקו 100 מיקרוליטר של תמיסה לוציפרית תוך-צפקית עם מחט בגודל 26.

לאחר שלוש דקות, יש להרדים את החיות בתא הרדמת חמצן פלואור ISO, ולהניח את החיות בתא הדמיה המצויד בקונוסים כדי לפזר את הפלואור ISO. רכוש סדרה של שש תמונות במרווחי זמן של שתי דקות עם זמן חשיפה אוטומטי, שילוב בינוני ונקודת עצירת F עם צמצם פתוח של אחת. אזור העניין הוא בדרך כלל אליפסה מעל הראש, שנמדדה את עוצמת הזוהר בכל בעל חיים תוך שימוש באותן הגדרות כדי לאפיין מאפיינים היסטופתולוגיים של גליובלסטומה הנגרמת על ידי SB.

C 57 שישה עכברים ילודים שחורים הוזרקו ב-P אחד עם פלסמיד וציפוי לוציפראז בשילוב עם NRA S ו-SV 40 פלסמידים T גדולים אינוד טרנספוזונים עם DNA אונקוגני. לחלופין, פלסמיד המקודד סיכת ראש קצרה P 53 עם PDGF beta, ומדווח GFP הוזרק בשילוב עם NRAS. נמק פסאודו פאליס היה ניכר כמו גם פרי-וסקולרי ומפוזר לתוך המוח.

פרנכימה גליובלסטומה נוטרו גם עם ביולומינסנציה. בעלי חיים בדרך כלל נכנעים לעומס הגידול. כאשר הזוהר הגיע לעוצמה של 10 עד השביעית עד 10 עד התשיעית יחידות מכוילות.

ההישרדות החציונית של בעלי חיים הייתה תלויה באופן צפוי בשילובים של טרנספוזונים אונקוגניים שהוזרקו למוח היילוד. הגידולים האגרסיביים ביותר הושרו עם NRS וגידולי אנטיגן T גדולים SV 40 התאפיינו בביטוי של מולקולות אופייניות. גידולים מתפתחים שנועדו לבטא GFP המושרה עם SHP 53 ו-nras ביטאו את סמן תאי הגזע העצביים נסטון, וחלקם ביטאו גם חלבון חומצי גליו סיבי.

לאחר 56 ימים, נמצא גידול מוקף באסטרוציטים חיוביים רבים ל-GFAP. תאי גידול אלה ביטאו נין אך לא GFAP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום להיווצרות גליובלסטומות, המכיל מוטציות גנטיות ספציפיות באמצעות הזרקות תוך חדריות לעכברים יילודים, וכיצד לעקוב אחר התקדמות המחלה באמצעות ביולומינסנציה.

במאמר תמצאו פרטים כיצד לשכפל בקלות פלסמיד טרנס פרו חדש, המקודד גנים מעניינים, וגם כיצד לנטר את הגידולים ולנתח אותם באמצעות היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה. בנוסף, תמצאו שיטה מפורטת כיצד ליצור קווי תאי גליובלסטומה חדשים מבעלי חיים עם גידולים מהונדסים גנטית. אנו מקווים שהמאמר הזה יסייע להאיץ את הגילוי של טיפולים חדשים למחלה האנושית ההרסנית הזו.