הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות Elegans Caenorhabditis
22 בפברואר 2015
אנו מתארים את השלבים המפורטים של בדיקה כימית בעלת תפוקה גבוהה בנמטודה Caenorhabditis elegans המשמשת להערכת רעילות קו הנבט. בבדיקה זו, הפרעה בתפקוד קו הנבט בעקבות חשיפה לכימיקלים מנוטרת באמצעות מדווח פלואורסצנטי ספציפי לעוברים אנופלואידים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך באופן מקיף את הרעילות הכימית של קו הנבט באמצעות הנמטודה C No Haitis elgan. זה מושג על ידי סנכרון תולעים על ידי הוספת תמיסת אקונומיקה מדוללת לאוכלוסיית תולעים בשלב מעורב של זן C Elgan PXOL 1 GFP. שלב זה מייצר מספר רב של עוברים המוגנים מפני האקונומיקה על ידי קליפת הביצה שלהם.
השלב השני הוא יצירת אוכלוסיית זחלים מסונכרנת של L אחד על ידי מתן אפשרות לעוברים לבקוע בנוזל ללא מזון. לאחר מכן, התולעים גדלות לשלב הזחל הרביעי שלהן או לשלב הארבע, ואז הן נחשפות לכימיקלים המעניינים בנוזל למשך 65 שעות. השלב האחרון הוא הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של ביטוי מדווחי GFP בעוברים בתוך רחם התולעים.
בסופו של דבר, שיעור העוברים החיוביים ל-GFP בהשוואה לביקורת DMSO משקף את האנטיגניות של התרכובות שנבדקו. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מודלים של רודן או מבחני תרבית תאים, הוא שאנו יכולים להעריך את הגאניות והרעילות של קו הנבט של כימיקלים במודל של בעלי חיים שלמים ובמקביל לבצע בדיקת תפוקה גבוהה בביצוע ההליך. היום תהיה עמיתת הפוסט-דוקטורט ד"ר דניאלה פרוטי.
התולעים הגרפיות להליך זה הוכנו בעבר כמתואר בטקסט הפרוטוקול הנלווה, אוספות את תולעי ה-GR ממדיום גידול הנמטודות או לוחות NGM על ידי שטיפתן עם מיליליטר אחד עד שניים של M תשע והעברתן לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הניחו לתולעת ה-GR לשקוע לתחתית הצינור החרוטי של 15 מיליליטר למשך כחמש עד 10 דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התולעת.
העבירו את כדור התולעת לשניים עד ארבעה צינורות מיקרו צנטריפוגה והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת אקונומיקה מדוללת לכל צינור. דוגרים שתיים-שלוש דקות בטמפרטורת החדר. עקוב אחר התקדמות התגובה תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שכל התולעים מתות.
אין להלבין יותר מחמש דקות מכיוון שהעוברים עלולים למות. אוספים את התולעים על ידי צנטריפוזיה למשך דקה. ב-3000 סל"ד.
הסר את הסופרנט והוסף מיליליטר אחד של M 9 סטרילי כדי לנטרל את התגובה. ודא שכל החומרים הבאים במגע עם התולעים לאחר הטיפול באקונומיקה הם סטריליים. שטפו את התולעים פעמיים עם מדיה M nine.
הסר את הסופרנטנט והוסף M תשע עד 100 עד 200 מיקרוליטר. בעזרת פיפטת מרעה מזכוכית, הוסיפו טיפה מתערובת התולעת M nine כדי לנקות צלחות NGM ודגרו עליהן לפחות 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לעוברים לבקוע ללא מזון. צמיחת הזחלים תיעצר בשלב L שלב אחד שני שלבי סנכרון.
נעשה שימוש בהלבנה ורעב במילה L מכיוון שחיוני להשיג אוכלוסייה חמה סינכרונית מאוד כדי למקסם את מספר ארבעת הזחלים שישמשו לחשיפה. יום אחד לאחר הקמת אוכלוסיית זחלי L אחד מסונכרנת, אסוף את זחלי L one מלוחות ה-NGM השקופים. שוטפים את הצלחות עם מיליליטר אחד עד שניים של M תשע ומעבירים את הזחלים של L אחד לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
תנו לתולעים הבוגרות המתות לשקוע לתחתית הצינור החרוטי של 15 מיליליטר למשך כחמש דקות. אסוף את הסופרנטנט היכן שתולעי L 1 נמצאות בצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. זרז את התולעים על ידי צנטריפוזיה במשך שתי דקות ב -2, 600 סל"ד.
הסר את הסופרנטנט והשאיר כ -500 מיקרוליטר. קבע את ריכוז התולעים בתמיסת M 9 על ידי ספירת מספר התולעים ב-10 טיפות מיקרוליטר. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו ספרו לפחות חמש טיפות.
התאם את ריכוז התולעים ל-20 עד 25 תולעים למיקרוליטר ב-M 9, ולאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת התולעת M nine לצלחות NGM. יושבים עם זרחנים אורגניים 50, מאכילים חיידקים דוגרים במשך 65 שעות ב-15 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאוכלוסייה המסונכרנת L אחת לגדול עד שהם מגיעים לשלב L 4. מסך זה משתמש ב-CL נגד זן המכיל מדווח שעתוק פלואורסצנטי כדי לזהות הפרעה בקו הנבט ואינדוקציה של אנופלואידיה עוברית.
אספו את ארבעת הזחלים מלוחות ה-NGM השקופים על ידי שטיפת הצלחות עם מיליליטר אחד עד שניים של M 9 והעברתם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. תן ל-L ארבע משקעי תולעת לתחתית הצינור החרוטי של 15 מיליליטר למשך כחמש עד 10 דקות. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התולעת.
הוסיפו שלושה עד חמישה מיליליטר של M 9 וקבעו את ריכוז התולעים בתמיסת M 9 על ידי ספירת מספר התולעים בטיפות של 10 מיקרוליטר. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ספרו לפחות חמש טיפות לכל דגימה. השעו מחדש את התולעים בריכוז של תולעת אחת למיליליטר ב-M תשע.
מדללים את חיידקי ה-OP 50 שהוכנו בעבר פי עשרה עם M תשע. ודא שהחיידקים המרחפים מגיעים לטמפרטורת החדר מכיוון שטמפרטורות נמוכות יותר משפיעות על התפתחות התולעת באמצעות פיפטה רב-ערוצית תחילה, הוסף 100 מיקרוליטר של תערובת התולעת M nine לכל באר של צלחת תחתונה עגולה בעומק של שני מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של חיידקי ה- OP 50 המדוללים לכל באר בסוף.
בכל באר יהיו 100 תולעים ב-500 מיקרוליטר. הוסף 0.5 מיקרוליטר של כימיקל הבדיקה לבארות הרצויות כדי להשיג ריכוז סופי של 100 מיקרומולר. ריכוז נפוץ במסכים כימיים ב-CL elgan חושף בקרות אתנול או ממס DMSO בריכוז סופי של 0.1% כבקרה חיובית.
השתמש ב-100 מיקרומולר ללא קוסול. אוטמים את הצלחת בעזרת סרט דבק. הקפידו לאטום היטב את הצלחת כדי למנוע זיהום צולב בין בארות.
עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום. מעבירים את הצלחת לשייקר בטמפרטורה המתאימה למשך זמן מתאים. שמרו על טמפרטורת החדר סביב 20 מעלות צלזיוס מכיוון שהטמפרטורה משפיעה על צמיחת התולעים בסיום החשיפה הכימית בשייקר.
הניחו לצלחות 96 הבאר לנוח במשך 10 עד 15 דקות כדי לאפשר לתולעים הבוגרות לשקוע לתחתית הצלחת באמצעות פיפטה רב-ערוצית. הסר 350 מיקרוליטר של תשע M מכל באר והקפיד לא להפריע לתולעים בתחתית הצלחת. שטפו את התולעים עם מיליליטר אחד של M 9 ותנו לצלחת לנוח שוב למשך 10 עד 15 דקות כדי לאפשר לתולעים הבוגרות לשקוע לתחתית.
הסר מיליליטר אחד של תשע M מכל באר והקפיד מאוד לא להפריע לתולעים בתחתית הצלחת. החייאה, השעו את התולעים ב-M 9 הנותר. אוספים 100 מיקרוליטר מתערובת התולעת M nine מצלחת 96 הבאר ומעמיסים אותה לבארות של צלחת באר תחתונה 384 שקופה בקיר שחור.
חזור על התהליך באמצעות תולעים מ -4 96 צלחות באר עד שכל הבארות של צלחת הבאר 384 נטענות. חשוב שלכל הבארות יהיה אותו נפח על מנת להגביר את היעילות והמהירות של המיקוד האוטומטי במהלך תהליך רכישת התמונה. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של מצקת לכל באר ותנו לתולעים לדגור במשך כ -30 דקות.
ללה פועלת כאגוניסט לקולטן אצטילכולין ומשתקת את התולעים, מעבירה את הצלחת למיקרוסקופ בעל תכולה גבוהה בשדה רחב המסוגל לספק הדמיה אוטומטית. השתמש בתוכנה לרכישת וניתוח תמונות בתוכן גבוה בהתאם להנחיות היצרן. בחר את המטרה ארבע x כדי להשיג תמונה אחת לכל .
התאם היטב את פרמטרי ההדמיה של GFP ל -45 אלפיות השנייה של חשיפה ורזולוציית תמונה ל -2160 על 2160. התחל ברכישת תמונה תולעים חשופות מצולמות ישירות על 384 לוחות באר. מספר התולעים המכילות לפחות עובר אחד חיובי ל-GFP נספר עבור כל באר ומנורמל על ידי המספר הכולל של התולעים באותה באר כפי שמוצג כאן.
חשיפה לחומרים כימיים כגון AOL ללא קוד רעל מיקרו-צינוריות מובילה לאינדוקציה של שיעור גבוה של עוברים המבטאים GFP בהשוואה לבקרת DMSO. העוברים החיוביים ל-GFP בהירים משמעותית מהפלואורסצנטיות החלשה שנצפתה בעוברים אחרים, כמו גם האוטופלואורסצנטיות שנצפתה במעיים של בעלי החיים. החץ האדום מציין עוברים חיוביים ל-GFP הנראים בבירור בתוך הרחם של תולעת שטופלה ב-AOL ללא קוד.
בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות נוספות כגון צביעת DNA של התולעים על מנת לקבל מבט מפורט יותר על השפעת הכימיקלים על קו הנבט. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הטוקסיקולוגיה להעריך במהירות את רעילות הרבייה ורעילות קו הנבט של כימיקלים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר בדיקה כימית בעלת תפוקה גבוהה בנמטודה Caenorhabditis elegans להערכת רעילות לקו הנבט. הבדיקה מנטרת הפרעה בתפקוד קו הנבט בעקבות חשיפה כימית באמצעות רפורטר פלואורסצנטי הספציפי לעוברי aneuploid.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- רעלנות
רקע
- Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל למחקרים גנטיים.
- لرעילות של תאי הנבט עלולה להיות השלכות משמעותיות על ההתפתחות והרבייה.
- סממנים פלואורסצנטיים שימושיים להדמיה של תהליכים תאיים ספציפיים.
- בדיקות בסביבה של תפוקה גבוהה (High-throughput) מאפשרות סריקה יעילה של כימיקלים מרובים.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעה של חשיפה לחומרים כימיים על תפקוד תאי הנבט.
- שימוש באוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans לקבלת תוצאות מדויקות.
- הדמיה של השפעות חומרים כימיים על ההתפתחות העוברית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סנכרון של תולעים באמצעות תמיסת הלבנה מדוללת.
- הבקת עוברים בנוזל ללא מזון ליצירת לרוואות מסונכרנות.
- חשיפת לרוואות בשלב L4 לחומרים כימיים למשך 65 שעות.
- הדמיה של ביטוי רפורטר GFP באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
תוצאות עיקריות
- סנכרון מוצלח של אוכלוסיות תולעים לקבלת תוצאות עקביות.
- ניטור יעיל של רעילות בקו הנבט באמצעות רporters פלואורסצנטיים.
- זיהוי כימיקלים המשבשים את תפקוד תאי הנבט.
- הדגמה של התועלת של *C. elegans* במחקרים טוקסיקולוגיים.
מסקנות
- הבדיקה מספקת שיטה מהימנה להערכת רעילות של תאי הנבט.
- דיווחים פלואורסצנטיים הם כלים יעילים לניטור תהליכי התפתחות.
- ניתן להחיל גישה זו לסריקת כימיקלים שונים לצורך בדיקת רעילות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
הערכת רעילות של תאי הנבט היא שלב מוקדם קריטי בהערכת בטיחות כימית, אך מודלים מסורתיים של חוליתיים הם בעלי תפוקה נמוכה ודורשים משאבים רבים. בדיקה זו, המבוססת על *C. elegans*, מאפשרת סריקה מהירה של בעל חיים שלם לאיתור תרכובות המשבשות את ההפרדה הכרומוזומלית בתאי נבט, ובכך מספקת תובנה מכניסטית לגבי סיכון רבייתי. באמצעות אספקת תוצאות כמותיות המבוססות על פלואורסצנציה בפורמטים של 96 עד 384 בארות, היא תומכת בהפחתת סיכונים מוקדמת של ספריות כימיות בצינורות של רעילות גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד לקוי בתאי הנבט המושרה כימית באמצעות מדדי aneuploidy כמותיים.
- ערך תפעולי: עושה שימוש באוכלוסיית תולעים מסונכרנת להפחתת השונות ולהגברת השחזוריות של הבדיקה בסריקות של תרכובות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: ביטוי של רפורטר GFP מספק פלט ספציפי ומדיד להפרעה בקו הנבט לאחר חשיפה כימית.
- ערך תפעולי: תואם למיקרוסקופיית פלואורסצנציה אוטומטית ולפורמטים של פלטות רב-בארים לצורכי קמפיינים של סריקה בthroughput גבוה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מבדיל בין מקורות מיוטיים למקורות עובריים של אנאויפלואידיה, ובכך מספק מידע למעקב מכניסטי בבדיקות משניות.
- ערך תפעולי: מציב את הבדיקה כסינון ראשוני לתיעדוף תרכובות לצורך הערכה מעמיקה יותר של רעילות תאי נבט או רעילות התפתחותית.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה משתלבת בשלבי הגילוי המוקדמים של רעילות, ומשמשת כסריקה של תאי הנבט בעלת תפוקה גבוהה לפני ביצוע פרופיל מכניסטי או מעקב ביונקים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות בנוגע להשפעות כימיות על יציבות הגנום בתאי הנבט ועל הפרדה כרומזומלית.
- סריקה: מספק קריאות פלואורסצנציה כמותיות וסטנדרטיות המאפשרות השוואה בין ספריות כימיות.
- אנליטיקה: ספירת עוברים חיוביים ל-GFP בנורמליזציה מספקת מדד בר-הרחבה לזיהוי פגיעות (hits) ומידול תגובה למינון.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פגיעות מסריקה ראשונית לבדיקות מנגנוניות הבוחנות את מקור האנויפלואידיה בתאי נבט או בעוברים בשלבים מוקדמים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית לבדיקת רעילות בתאי נבט, הישמה על פני מחלקות כימיות ופרויקטי גילוי שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור חשיפה כימית לפגמים מדידים בתאי הנבט.
- ערך תפעולי: מאפשר סריקה בתפוקה בינונית עד גבוהה תוך שימוש מינימלי בבעלי חיים וסנכרון סטנדרטי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי זיהוי רעלים רבייים בשלב מוקדם של שלבי הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי סימון תרכובות בעלות פוטנציאל לנזק לתאי הנבט לפני השקעה משמעותית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול ב-C. elegans, סנכרון ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בגישה למערכות דימוי אוטומטיות וקוראי לוחיות רב-בארים לקבלת תוצאות במבנה הניתן להרחבה.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת התולעים, החשיפה הכימית ודירוג העוברים.
- שיקולי התאמה כוללים זני דווח (reporter strains) חלופיים או משכי חשיפה עבור נקודות סיום שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות הסתמכות על דווחים ספציפיים לקו הנבט וחוסר יכולת לתעד השפעות התפתחותיות לאחר ההשתלה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Establishment of a Synchronized L1 Larvae Populations
3:40
Establishment of a Synchronized L4 Larvae Populations
5:03
Exposure of Worms to Chemicals in 96-well Plates
7:25
Image Acquisition of Gravid Worm in a 384-well Plate
9:23
Results: Germline Disruption is Detected by GFP Fluorescence in a C. elegans Reporter Strain Exposed to Nocodazole
10:19
Conclusion
