הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להעריך באופן מקיף רעילות כימית של תאי נבט באמצעות הנמטודה C. elegans. דבר זה מושג תחילה על ידי סנכרון התולעים באמצעות הוספת תמיסת הלבנה מדוללת לאוכלוסיית תולעים בשלבי התפתחות מעורבים מהזן C. elegans PXOL1 GFP. שלב זה מייצר מספר רב של עוברים המוגנים מההלבנה על ידי קליפת הביצה שלהם.

השלב השני הוא יצירת אוכלוסייה מסונכרנת של זחלי L1 על ידי השארת העובריים לבקיעה בנוזל ללא מזון. לאחר מכן, התולעים גדלות לשלב הזחלי הרביעי, או L4, ובשלב זה הן נחשפות לכימיקלים הרלוונטיים בנוזל למשך 65 שעות. השלב הסופי הוא ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיה פלורסצנטית של ביטוי ה-GFP reporters בעובריים בתוך הרחם של התולעים.

בסופו של דבר, שיעור העוברים החיוביים ל-GFP בהשוואה לבקרת ה-DMSO משקף את האנטיגניות של התרכובות שנבדקו. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מודלים של Rodin או בדיקות תרביות תאים, הוא שניתן להעריך את הגנויות והרעילות של כימיקלים בקו הנבט במודל של בעל חיים שלם, ובמקביל לבצע את ההליך כבדיקה בעלת תפוקה גבוהה. היום תדגים זאת עמיתת הפוסט-דוקטורט, ד"ר Daniella Perotti.

התולעים הגרפיות לפרוצדורה זו הוכנו בעבר כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול המצורף. אספו את תולעי ה-GR ממצע גידול לנמטודות או מלוחיות NGM על ידי שטיפתן עם 1 עד 2 מיליליטר של M9 והעברתן למבחנה קונית של 15 מיליליטר. הניחו לתולעי ה-GR לשקוע לתחתית המבחנה הקונית של ה-15 מיליליטר למשך כ-5 עד 10 דקות. לאחר מכן, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע התולעים.

העבירו את משקע התולעים לשני עד ארבעה מבחנות מיקרו-צנטריפוגה והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת הלבנה מדוללת לכל מבחנה. דגרו למשך שתי עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר. עקבו אחר התקדמות התגובה תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שכל התולעים מתו.

אין להלבין למשך יותר מחמש דקות, שכן העוברים עלולים למות. אספו את התולעים באמצעות צנטריפוגה למשך דקה אחת, ב-3000 RPM.

הסיר את הנוזל העליון והוסף מיליליטר אחד של M nine סטרילי כדי לנטרל את התגובה. ודא שכל החומרים הבאים במגע עם התולעים לאחר טיפול הלבנתו הם סטריליים. שטוף את התולעים פעמיים עם מצע M nine.

הסר את הנוזל העליון והוסף 100 עד 200 µL של M9. בעזרת פיפטת פסטור מזכוכית, הוסף טיפה מתערובת התולעים ב-M9 לצלחות NGM נקיות והדגר אותן למשך 24 שעות לפחות ב-20 °C כדי לאפשר לעוברים לבקוע ללא מזון. צמיחת הזחלים תיעצר בשלב L1. שני שלבי סנכרון.

הבהלה והרעבה לשלב L נעשה כדי להשיג אוכלוסיה סנכרונית מאוד של תולעים בטמפרטורה חמימה, דבר החיוני למקסום מספר הזחלים בשלב L4 שישמשו לחשיפה. יום אחד לאחר הקמת אוכלוסייה סנכרונית של זחלי L1, אספו את זחלי ה-L1 מלוחיות NGM שקופות. שטפו את הלוחיות עם 1 עד 2 מיליליטר של M9 והעבירו את זחלי ה-L1 לפרועת קונית של 15 מיליליטר.

הניחו לתולעי המבוגרים המתים לשקוע לתחתית המבחנה הקונית בנפח 15 מיליליטר למשך כחמש דקות. אספו את העליון (supernatant), שבו נמצאות תולעי L1, למבחנה קונית חדשה בנפח 15 מיליליטר. השקיעו את התולעים באמצעות צנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 2,600 RPM.

הסיר את הנוזל העליון והשאר כ-500 microliters. קבע את ריכוז התולעים בתמיסת M nine על ידי ספירת מספר התולעים בטיפות של 10 microliter. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו, ספור לפחות חמש טיפות.

כווננו את ריכוז התולעים ל-20 עד 25 תולעים למיקרולטר ב-M nine, ולאחר מכן הוסיפו 50 מיקרולטר של תערובת התולעים ב-M nine לצלחות NGM. לאחר הזריעה עם חיידקי OP 50 המשמשים להזנה, דגרו למשך 65 שעות ב-15 degrees Celsius כדי לאפשר לאוכלוסייה המסונכרנת בשלב L one לגדול עד להגעה לשלב L four. סריקה זו משתמשת בזן CL against המכיל רפורטר תעתוק פלורסצנטי לזיהוי שיבוש בקו הנבט והשראת אנאופלואידיה עוברית.

אספו את הלרווה בשלב L4 מלוחות NGM השקופים על ידי שטיפת הלוחות עם 1 עד 2 מיליליטר של M9 והעברתם לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. המתינו כ-5 עד 10 דקות עד שהתולעים בשלב L4 ישקעו לתחתית השפופרת הקונית של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע התולעים.

הוסיפו שלושה עד חמישה מיליליטר של M9 וקבעו את ריכוז התולעים בתמיסת ה-M9 על ידי ספירת מספר התולעים בטיפות של 10 µL. בעזרת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, ספרו לפחות חמש טיפות עבור כל דגימה. השעו את התולעים בריכוז של תולעת אחת למיליליטר ב-M9.

דללו את חיידגאי ה-OP 50 שהוכרו לפני כן פי עשרה עם M nine. ודאו שהחיידקים לאחר התגשייה הגיעו לטמפרטורת החדר, כיוון שטמפרטורות נמוכות יותר משפיעות על התפתחות התולעים. ראשית, הוסיפו באמצעות פיפטה רב-ערוצית 100 µL של תערובת ה-M nine לתולעים לכל באער של פלטת 96 באערים בעומק שני מיליליטרים ובתחתית עגולה. לאחר מכן, הוסיפו לבסוף 400 µL של חיידגאי OP 50 מדוללים לכל באער.

בכל באער יהיו 100 תולעים ב-500 µL. יש להוסיף 0.5 µL מהכימיקל הנבדק לבאערים הרצויים כדי להגיע לריכוז סופי של 100 µM. ריכוז זה נפוץ בבדיקות סריקה כימית ב-CL elgan. יש לחשוף את בקרות הממס אתנול או DMSO בריכוז סופי של 0.1% כבקרת חיוביות.

השתמש ב-100 micromolar ללא cosol. אטום את הפלטה באמצעות סרט דביק. ודא שהפלטה אטומה היטב כדי למנוע זיהום צולב בין הבארות.

עטפו את הצלחת בנייר אלומיניום. העבירו את הצלחת לשייקר בטמפרטורה המתאימה למשך פרק זמן הולם. שמרו על טמפרטורת החדר סביב 20 °C, כיוון שהטמפרטורה משפיעה על צמיחת התולעים עם סיום החשיפה הכימית בשייקר.

המתינו 10 עד 15 דקות כדי לאפשר לתולעי המבוגרים לשקוע לתחתית הפלטה של 96 הבארים. הסירו 350 µL של M9 מכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית, תוך הקפדה לא להפריע לתולעים השקועות בתחתית הפלטה. שטפו את התולעים עם 1 mL של M9 והמתינו שוב 10 עד 15 דקות כדי לאפשר לתולעי המבוגרים לשקוע לתחתית.

הסיר מיליליטר אחד של M nine מכל באער, תוך הקפדה רבה לא להפריע לתולעים בתחתית הפלטה. השהה מחדש את התולעים ב-M nine שנותר. אסוף 100 µL מתערובת התולעים ב-M nine מפלטת 96 הבאערים והעבר אותה לבאערים של פלטת 384 באערים עם דפנות שחורות ותחתית שקופה.

חזרו על התהליך תוך שימוש בתולעים מ-4 פלטות של 96 בארות עד שכל הבארות בפלטה של 384 בארות ימולאו. חשוב שכל הבארות יכילו את אותו נפח כדי להגביר את היעילות והמהירות של המיקוד האוטומטי (autofocus) במהלך תהליך רכישת התמונות. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של lale לכל בארה והניחו לתולעים לעבור אינקובציה למשך כ-30 דקות.

Lale פועל כ възושיסט (agonist) של קולטן אצטילכולין ומקבע את התולעים; העבירו את הצלחת למיקרוסקופ רחב שדה בעל תוכן גבוה (high content microscope) המסוגל לספק דימוי אוטומטי. השתמשו בתוכנה לרכישה וניתוח של תמונות בתוכן גבוה בהתאם להנחיות היצרן. בחרו בעדשה עם הגדלה של 4x כדי לרכוש תמונה אחת לכל.

נתאים את פרמטרי הדמיות ה-GFP לזמן חשיפה של 45 milliseconds ורזולוציית תמונה של 2160 על 2160. נתחיל ברכישת התמונות; תולעים שנחשפו מדומיינות ישירות על פלטות של 384 בארות. מספר התולעים המכילות לפחות עובר אחד חיובי ל-GFP נספר עבור כל בארה ומנורמל לפי המספר הכולל של התולעים באותה בארה, כפי שמוצג כאן.

חשיפה לחומרים כימיים כגון הרעל למיקרוטובולי no-code AOL מובילה להשראה של שיעור גבוה של עוברים המבטאים GFP בהשוואה לבקרת ה-DMSO. העוברים החיוביים ל-GFP בהירים משמעותית מהפלורסצנציית הרקע החלשה הנצפית בעוברים אחרים, וכן מהאוטופלורסצנציה הנצפית במעי של החיות. החץ האדום מצביע על עוברים חיוביים ל-GFP הנראים בבירור בתוך הרחם של תולעת שטופלה ב-no-code AOL.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון צביעת DNA של התולעים כדי לקבל מבט מפורט יותר על השפעת הכימיקלים על קו הנבט. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הרעילות להעריך במהירות את הרעילות הרבייתית ואת הרעילות לקו הנבט של כימיקלים.