Name: שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: חקור חדירות מחסום הדם-רשתית ושלמות הממברנה הפנימית המגבילה ברשתית בעזרת נגיפי AAV. שיטה זו מאפשרת הערכת חסמים רשתיתיים במחלות עיניים שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפלטפורמת ההדמיה של Institut de la Vision. אנו מודים לאגודה הצרפתית לניוון שרירים (AFM) על מלגת דוקטורט ל-O.V. ו-Allergan INC. עבודה זו שבוצעה במסגרת LABEX LIFESENSES [התייחסות ANR-10-LABX-65] נתמכה על ידי קרנות ממשלתיות צרפתיות המנוהלות על ידי ANR. אנו מודים לפגי בארב ולמליסה דסרוזיירס על הסיוע הטכני בהכנות ל-AAV. אנו אסירי תודה לסטפן פוקט על הסיוע הטכני המצוין במיקרוסקופיה קונפוקלית ועל תרומתו המומחה בפירוש התוצאות.

כל בעלי החיים ששמשו במחקר זה טופלו ויטופלו בהתאם להצהרת Arvo לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון. 1. הפקת רקומביננטי AAV (rAAV) על ידי חלוף Transfection של HEK-293 תאים 17,18 הערה: ראה מקלור C, יופיטר (2011) 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר הכנת פלסמיד בקנה מידה גדולה (מ&quot;ג לפחות 1 / מיליליטר) של פלסמידים וקטור AAV. השתמש 3 פלסמידים. פלסמיד עוזר AAV נושא את הגנים השכפול וקפסיד ללא המסוף ההפוך AAV חוזר ITRS, קלטת ביטוי transgene ביצוע ITR AAV מכונה פלסמיד ההעברה, ופלסמיד אספקת גני עוזר אדנווירוס E2, E4, וגני VA RNA מצוינים כלpHELPER. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect 293 תאים עם 3 פלסמידים אלה באמצעות polyethyleneimine (או מגיב transfection אחר). מעל 80% מיעילות transfection הוא הכרחי לvi הטובתשואות RAL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר AAV רקומביננטי מ293 lysates תא בשיפוע iodixanol. 15%, 25%, 40%, וiodixanol 60% משמש להשגת השיפוע. לאסוף 40% חלק iodixanol המכיל חלקיקי AAV, לרכז את החלק לאחר ultracentrifugation ב500,000 XG במשך שעה וחיץ תמורת 1 נגד PBS (נאגר מלוח פוספט) עם 0.001% pluronic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע כייל הגנומי נגיפי 20, לבצע ProteinaseK לעכל DNAse אחרי QPCR. פריימרים קדימה הפוך להגביר את אזור 62 נ&quot;ב ממוקם בITR AAV2. לסטנדרטי פלסמיד, החללית שכותרתו עם FAM ויש לו חור שחור מרווה (BHQ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע qPCR (תגובת השרשרת של פולימראז כמותי) בנפח סופי של 25 μl באמצעות 340 ננומטר לאחור תחל ITR, פריימר ITR קדימה 100 ננומטר, 100 ננומטר בדיקה AAV2 ITR, 0.4 מ&quot;מ dNTPs, 2 מ&quot;מ MgCl2, 1x פלטינום תקי מאגר, 1U פלטינום תבנית תקי ו -5 μl (סטנדרטי, מדגם ואין שליטת תבנית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסטנדרטי, השתמש בפלסמיד לtransfection ב7 x 10-לקפל דילולים סדרתי (5 μl כל אחד מ2 x 10 x 9 עד 2 10 3 הגנום מיליליטר / וכתוצאה מכך ריכוז סופי מאוקטובר 10-אפריל 10 הגנום מיליליטר /). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל את התכנית על ידי צעד denaturation ראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ואחריו 40 מחזורים של denaturation בב 95 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות וחישול / סיומת ב 60 ° C 1 דקות. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח קצר או ב -20 ° C לתקופות ארוכות אחסון. </li></ol> 2. הזרקת תוך של AAV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי C57BL6J עם קטמין (50 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם) ולאמת את אובדן ליישר רפלקס, תגובת רפלקס הנסיגה וקמצוץ הזנב מצביעה הרדמה מתאימה. להתרחב תלמידים על ידי יישום של קרנית של 5% neosynephrine וmydriaticum 0.5% בטיפי עיניים. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור disposab G ultrafine 30מחט le דרך הקו המשווה ובסמוך לימבוס, לתוך חלל הזגוגית (ראה צ&#39;יו K, יופיטר (2007) 21). הזרק מניות μl 1 מכילות 1 עד 4 x 10 11 סמנכ&quot;ל ShH10-GFP או AAV5-GFP עם תצפית ישירה של המחט במרכז חלל הזגוגית (איור 1). השתמש בעין אחת כביקורת על ניסויי ILM. להזריק את שני העיניים לניסויי BRB. החל טיפול מקומי נוגד דלקת ואנטי-בקטריאלי על עיניים מוזרקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרחב תלמידים עם neosynephrine וטיפות עיני mydriaticum להדמיה. לבצע בדיקות קרקעית עין עם מצלמה קרקעית העין לעקוב GFP (חלבון פלואורסצנטי הירוק) ביטוי שבוע 1, 2 שבועות, 1 חודש, ו -2 חודשים לאחר הזרקת תוך (איור 1). להקריב את עכברי משאיפת CO 2 1-2 חודשים לאחר הזרקה. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לcryosections רשתית (איור 1), לנתח את עיני enucleated להסיר lתיקון ENS וקרנית, והטבילה בparaformaldehyde 4% עבור שעה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect עיניים קבועות בעבר בסוכרוז 10% עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, סוכרוז 20% עבור שעות נוספות בטמפרטורת חדר. Cryoprotect בתמיסת סוכרוז 30%, הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. להקפיא ולהטביע eyecups בהטבעת שרף כגון קריו מטריצה. הפוך 10 מיקרומטר cryosections והר בשקופיות טיפול מיוחד לקטעי רקמה קפוא ושתשפר את דבקות רקמות במהלך צביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize חלקים עם 0.1% X100 טריטון בPBS pH 7.4 למשך 5 דקות. לשטוף 2x בPBS ולחסום עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר בPBS עם BSA 1%, 0.1% Tween 20. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לflatmounts רשתית (איור 1), לתקן את עיני enucleated בparaformaldehyde 4% במשך 15 דקות כדי להקל על הנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב15-30 דקות, לנתח את העיניים כדי להסיר את הקרנית ועדשה. הפרד את הרשתית מאפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) ולובן העין על ידי חיתוך סביב serrata אורה ועצב הראייה. לטבול בparaformaldehyde 4% למשך 30 דקות נוספות כדי לתקן את הרשתית וחלבון פלואורסצנטי בתאי רשתית transduced (קיבעון לא יעלה על 24 שעות). לשטוף 5 דקות בPBS סטרילי, pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את PBS לחיץ חסימה (PBS עם BSA 1%, 2% עזים נורמלי או חמור בדם, 0.5% Triton X-100), ודגירה בחסימת מאגר לאו 4 שעות בטמפרטורת חדר או 4 ° C למשך הלילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמות עם נוגדנים עיקריים בחסימת מאגר לאו 4 שעות בטמפרטורת חדר או 4 ° C למשך הלילה. 3x לשטוף עם PBS. הערה: הנוגדנים המשמשים הם כדלקמן: אנטי laminin (1/1000), 4D2 (1/500) מוטות תיוג, שיבוט synthetase אנטי-גלוטמין GS-6 (1/1500) תאי תיוג ILM שיבוט אנטי-רודופסין תיוג Müller , PNA קטינים (1/40) תיוג קונוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמות עם 1: 500 דילול של נוגדנים משני מצומדות פלואוריד Alexa חסימת חיץ במשך שעה 1 (cryosections) או 2 שעות (flatmounts) בטמפה החדרrature ומוגן מפני אור. 3x לשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חתכים להקלה לרשתית וflatmount זה על גבי זכוכית עם שני קולטי האור או צד תא הגנגליון ברשתית (RGC) יפנו כלפי מעלה. להוסיף mountingmedium המימי, להחיל coverslip ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיקרוסקופיה confocal על מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה. לרכוש ברצף תמונות, שורה אחרת שורה, כדי להפחית את העירור והפליטה crosstalk. להגדיר את גודל צעד על פי תורת הדגימה. השתמש בהגדרות חשיפה שלמזער פיקסלים oversaturated בתמונות הסופיות. תמונות תהליך 12-bit עם פיג&#39;י, Z-סעיפי פרויקט על מטוס בודד באמצעות עוצמה מקסימלית תחת Z-פרויקט פונקציה ולבסוף להמיר 8 סיביות מצב צבע RGB. </li></ol> 4. ניתוח PCR של דגימות דם עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 100 מניות μl המכילות 1 עד 4 x 10 11 חלקיקים של AAV-GFP לוריד הפין של עכברים מורדמים C57BL6J (5% מisofluraneלזירוז בתא קרוב ו -2.5% מisoflurane באמצעות חרטומו במהלך ניתוח) באמצעות מזרק אינסולין עם מחט 6 מ&quot;מ עדין במיוחד. בעלי חיים זה ישמשו כביקורת חיובית של מחזורי חלקיקי AAV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם מדגם מזנב עכבר לפני ההזרקה ו -3 שעות, 24 שעות, 2 ימים, ו -3 ימים לאחר הזרקת תוך ShH10 או לאחר הזרקת intrapenile (איור 1). על 10-20 μl נאסף בצינורות הפרין. להקריב את עכברי משאיפת CO 2 לאחר השלמת ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מדגימות דם באמצעות ערכת החילוץ על פי בחירתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הגברה PCR של DNA גנומי. לפרוטוקול זה משתמש בזוג פריימר הבא: GFP, לחוש 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &quot;, antisense 5&#39;-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&quot;. תכנית ה- PCR הבאה בוצעה: 95 ° C 2 דקות (מחזור 1); 95 ° C 45 שניות, 1 דקות 55 ° C, 72 ° C שניות 45 (30 מחזורים); 72 ° C 5 דקות (מחזור 1);4 ° C אחיזה. </li></ol> 5. אופציונאלי אוונס הכחול שיטה הערה: לכמת חדירות כלי דם על ידי מדידת דליפת אלבומין מכלי דם לרשתית בשיטה הכחולה אוונס 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צבע הכחול אוונס על ידי פירוק בפתרון נורמלי מלוח (6 מ&quot;ג / מיליליטר), sonication במשך 5 דקות בשואב קולי, וסינון באמצעות מסנן 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי C57BL6J (שאיפת isoflurane, ראה שלב 4.1), לבדוק את אובדן ליישר רפלקס, רפלקס הנסיגה ותגובת קמצוץ הזנב מצביעה הרדמה מתאימה, ולהזריק אוונס כחול (45 מ&quot;ג / קילוגרם) דרך וריד הפין (איור 1). בדוק שכפות, לוע, ואוזניים של העכברים להיות ברור כחולות לאחר הזרקה כחולה אוונס, המאשרים את הספיגה והפצה של הצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי C57BL6J 3 שעות לאחר ההזרקה של הצבע עם קטמין (50 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם) ולאמת את אובדן righting רפלקס המצביע על הרדמה מתאימה. לדוגמא intracardially כ -500 μl דם בצינורות הפרין ותנקב עכברים למשך 2 דקות באמצעות החדר השמאלי עם חיץ ציטרט (0.05 M, pH 3.5; לפזר 7.8 גרם של חומצת לימון ו -3.8 גרם של נתרן ציטרט בL 1 של מים מזוקקים) טרום חימם עד 37 ° C כדי למנוע התכווצות כלי דם. עכברים הקריבו באמצעות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זלוף, enucleate ובזהירות לנתח את שני העיניים תחת מיקרוסקופ הפעלה כדי לאסוף את הרשתית (ראה סעיף 3.2). רשתית יבש במאייד צנטריפוגלי הלילה, לשקול, ולחלץ את הצבע הכחול אוונס ידי דוגרים רשתית עם של פוראמיד 100 μl במשך 18 שעות על 65 מעלות צלזיוס עם הרועד (100 XG). דגימות רשתית צנטריפוגה ב30K צינורות מסנן אומגה ב20,798.5 XG לשעה 2 ב 4 ° C ודגימות דם צנטריפוגות ב20,798.5 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בשתי supernatants למדוד הספיגה. לקבוע הספיגה של כל דגימה על ידי הפחתת הספיגה המקסימלי for אוונס הכחול ב620 nm למינימום הספיגה ב 740 ננומטר. חישוב ריכוז הכחול אוונס בפלזמה ורשתית מעקומה סטנדרטית של אוונס הכחול בפוראמיד. הגעה חדירות BRB בmicroliter של אוונס כחול לגרם של רשתית יבשה לשעה (μl hr / פלזמה / g רשתית wt היבש). </li></ol> 6. אופציונאלי ההעמסה אנגיוגרפיה הערה: דליפה מכלי דם ברשתית בעכברים ניתן דמיינה ידי הזרקת intraperitoneal של והעמסת נתרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי C57BL6J (שאיפת isoflurane, ראה שלב 4.1) ולהתרחב תלמידים עם טיפות עיניים (neosynephrine וmydriaticum). השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק intraperitoneally .01-0.02 מיליליטר של 10% והעמסת נתרן בתמיסת מלח סטרילית 0.1 מיליליטר לאנגיוגרפיה והעמסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות של שני העיניים לאחר הזרקה באמצעות מצלמה קרקעית העין. להקריב את עכברי משאיפת CO 2 לאחר פרוcedure. הערה: 20 שניות נחוצות לכלי הרשתית להיות גלויים על אנגיוגרפיה. תמונות צריכים להיות בשבי בין 3-10 דקות לכל היותר לאחר הזרקה והעמסת. כתמי הדליפה (אם קיימים) ניתנים לצפייה לאחר 2.5 דקות. בנקודות זמן מאוחר יותר את איכות התמונה הולכת לאיבוד בשל העמסת נתרן לשדר לתמונות זגוגית, ובכך רק זמן קצר לאחר שהושגו משמשים לניתוח. </li></ol>

<ol><li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+retinal+basal+lamina+during+early+embryonic+development+leads+to+a+retraction+of+vitreal+end+feet%2C+an+increased+number+of+ganglion+cells%2C+and+aberrant+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth.</a> J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).</li>
<li>Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+disruption+of+the+retinal+basal+lamina+and+its+effect+on+retinal+histogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis.</a> Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).</li>
<li>Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane-dependent+survival+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).</li>
<li>Abdelkader, E., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+limiting+membrane+peeling+in+vitreo-retinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery.</a> Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+limiting+membrane+barriers+to+AAV-mediated+retinal+transduction+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous.</a> Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).</li>
<li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Muller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li>
<li>Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+release+by+retinal+glia+depends+on+both+oxygen+and+glucose+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply.</a> Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).</li>
<li>Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier+in+hypoxic+ischaemic+conditions%3A+basic+concepts%2C+clinical+features+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).</li>
<li>Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+response+of+neurons+and+glial+cells+to+hypoxia+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).</li>
<li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li>
<li>Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).</li>
<li>Yang, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-mediated+transduction+of+murine+retina+with+adeno-associated+virus%3A+effects+of+viral+capsid+and+genome+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size.</a> J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+following+subretinal+AAV5+vector+delivery+is+not+affected+by+a+previous+intravitreal+AAV5+vector+administration+in+the+partner+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye.</a> Mol Vis. 15, 267-275 (2009).</li>
<li>Koerber, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+adeno-associated+virus+for+enhanced+glial+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery.</a> Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).</li>
<li>Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+adeno-associated+viral+variant+for+efficient+and+selective+intravitreal+transduction+of+rat+Muller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells.</a> PLoS One. 4 (10), e7467(2009).</li>
<li>Vacca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+delivery+in+Dp71-null+mouse+model+with+compromised+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers.</a> Glia. , (2013).</li>
<li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).</li>
<li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use.</a> Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> J Vis Exp. (8), 313(2007).</li>
<li>Kolstad, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration.</a> Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).</li>
<li>Sene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implication+of+Dp71+in+osmoregulation+and+vascular+permeability+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina.</a> PLoS One. 4 (10), e7329(2009).</li>
<li>Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

BRB מסדיר את חילופי מולקולות בין הדם לרשתית. התמוטטותה קשורה למחלות שונות כגון רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרים הקשור לגיל (AMD). לאחרונה הראו כי בעכבר דיסטרופין נוק-אאוט, אשר מציג BRB החדיר, הרשתית הופכת להיות יותר מתירנית למסירת הגן בתיווכו של וקטורי adeno הקשורים ויראלי (AAV). עם זאת, למרות חלקיקי AAV חדירות BRB הוחדר intraocularly להישאר מרותק לתא העיני במודל זה. התוצאות שלנו מצביעות על כך שהריפוי גנטי למחלות המציגות BRB החדיר אינו מייצג סיכונים נוספים של תופעות לוואי מערכתי...

תאי מולר הם המרכיב העיקרי גליה של הרשתית. מורפולוגית, הם משתרעים על פני רשתית רדיאלית וendfeet, במגע עם הזגוגית, להתמודד ILM ורכיבים סודיים של זה האחרון. ILM הוא קרום במרתף מורכב מעשרה חלבונים שונים תאיים מטריצה ​​(laminin, Agrin, perlecan, nidogen, קולגן וכמה proteoglycans סולפט הפרין). במהלך פיתוח, הנוכחות שלה היא הכרחית עבור histogenesis רשתית, ניווט של אקסונים האופטיים, והישרדות של תאי הגנגליון 1-3. עם זאת, ILM הוא בלתי חיוני ברשתית מבוגרת וניתן להסיר בניתוח בפתולוגיות מסוימות מבלי לגרום לניזק לרשתית 4. בריפוי גנטי, קרום זה הופך להיות מכשול פיזי לתמרה יעילה של הרשתית באמצעות AAVs על ידי הזרקת תוך 5. דרך arborization הנרחב של התהליכים שלהם, תאי מולר לספק suppo התזונתי והרגולציהrt לשני נוירונים ברשתית ותאי כלי דם. תאי מולר מעורבים גם בוויסות של הומאוסטזיס ברשתית, בהקמה והתחזוקה של BRB 6. צמתים הדוקים בין תאי האנדותל נימי רשתית, תאי מולר, האסטרוציטים וpericytes יוצרים BRB. BRB מונע מחומרים מסוימים מלהיכנס למחלות רבות כמו retina.In רטינופתיה סוכרתית, חסימת וריד רשתית ומחלות בדרכי הנשימה, חוסר חמצן של הרשתית גורם לדליפה באמצעות 7-9 BRB. קרע זה קשור לעלייה בחדירות כלי דם שמובילה לבצקת vasogenic, היפרדות רשתית ופגיעה ברשתית. תאי מולר קשורים באופן הדוק עם כלי דם והקרום במרתף, ששיחקו תפקיד חשוב בשתי יושרת BRB וILM. כתוצאה מכך, תיוג תאי גליה מולר הוא רלוונטי במיוחד למחקר של המצב הפיזי של מחסומי רשתית אלה. קלאסיברית, חדירות BRB נמדדות באמצעות assay הכחול אוונס המורכב מהזרקה המערכתית של צבע הכחול אוונס, אשר נקשר אינה קוולנטית לאלבומין פלזמה. assay זה מודד את דליפת אלבומין (חלבון בגודל ביניים, ~ 66 KDA) מכלי דם לתוך הרשתית (ראה פרוטוקולי סעיף 5) 10. לחלופין, הדליפה של כלי הדם ניתן דמיינה ידי אנגיוגרפיה הקרינה רשתית המעידה על דליפה של העמסה (מולקולה קטנה, ~ 359 Da; ראה סעיף פרוטוקולים 6) 11. עם זאת, בשתי השיטות מאפשרות הערכה של חדירות BRB למולקולות קטנות וחלבונים אבל הם לא מספקים מידע על יושר ILM. לפיכך, ללמוד חדירות BRB, השתמשנו בשיטה המבוססת AAV שנותנת מידע על חדירות BRB למולקולות גדולות יותר (חלקיקי AAV למשל,, 25 בקוטר ננומטר). ואכן, השיטה שלנו יכולה לזהות נוכחות של transgene AAV בדם, שהייתי מציעה ש~ חלקיקי 25 ננומטר קוטר הייתתוכל לחדור לזרם הדם. שיטה זו גם מספקת מידע על המבנה של ILM וחלבוני מטריצה ​​תאיים במצבים פתולוגיים. שתי גרסאות AAV שימושיות למחקר כזה: AAV5 וShH10. הזריק Subretinally, יש AAV5 כמיהות טבעיות לקולטניים אור ואפיתל הפיגמנט ברשתית 12 אבל זה לא יכול להעביר לרשתית החיצונית כאשר מנוהלים לתוך הזגוגית ברשתית wild-type עם ILM שלם 5,13. ShH10 היא גרסת AAV שתוכנן במיוחד כדי למקד את תאי גלייה על נוירונים 14,15. ShH10 סלקטיבי תוויות בתאי מולר בשתי רשתיות בריאים וחולה עם התייעלות ברשתית עם מחסומים נפרצו 16. כלים הנגיפיים אלה בשילוב עם immuhistochemistry ובדיקות הדם-DNA לספק מידע על מצבם של חסמי רשתית ומעורבותם במחלה (איור 1).

<table><tbody><tr><td>זן עכברי C57BL6J</td><td>JANVIER LABS</td><td></td><td>עכברים</td></tr><tr><td>קטמין 500</td><td>Virbac צרפת</td><td></td><td>חומר הרדמה</td></tr><tr><td>קסילזין רומפון 2%</td> <td>Bayer Healthcare</td><td></td><td>חומר הרדמה</td></tr><tr><td>ניאו-סינפרין 5% Faure</td><td>Europhta</td><td></td><td>דילאטנט</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0.5%</td> <td>Thea</td><td></td><td>dilatant</td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>אנטי דלקתי</td></tr><tr><td>Cryomatrix הטמעת שרף</td><td>תרמו מדעי</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost פלוס הידבקות שקופיות</td><td>תרמו מדעי</td><td>10143352</td><td>שקופיות</td></tr><tr><td>אנטי למינין</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>אנטי רודופסין שיבוט 4D2</td><td>Millipore</td><td>MABN15</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>אנטי גלוטמין סינתטאז שיבוט GS-6</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>נגד גליה חלבון חומצי</td><td>סיבי Dako</td><td>334</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>PNA לקטין</td><td>Invitrogen</td><td>L32459</td><td>בדיקה</td></tr><tr><td>Alexa fluor נוגדנים משניים מצומדים</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>מגיב</td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td>הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>QIAmp DNA Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA פולימראז</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>צבע כחול אוונס</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>צבע</td></tr><tr><td>5 ומיקרו; m filter</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>Sigma</td><td>C1909-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד ספקטרופוטומטרי</td><td>סיגמא</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין</td><td>סיגמא</td><td>F2456</td><td>צבע</td></tr><tr><td>מיקרון III</td><td>מעבדות</td><td></td> <td>מחקר פניקסמערכת מיקרוסקופיה המבוססת על מצלמה צבעונית 3-CCD, תופס מסגרת ותוכנת מדף מאפשרת לחוקרים לצלם רשתית עכבר.</td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין</td><td>Terumo</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 ומיקרו; l Hamilton</td><td>Dutscher</td><td>74487</td><td>Seringue 1701</td></tr><tr><td>מחט RN G33, 25 מ"מ, PST 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11530332</td><td>הזרקה תוך זגוגית</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>מזרק רב-תכליתי משתמש במיקרו-מזרקים כדי לספק נפחי פיקוליטר</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (אחד) עם בקר SYS-Micro4</td><td>בקר</td><td></td> דיגיטלי <td>UMP3-1</td></tr><tr><td>זכוכית מגדלת דו-עינית SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>זום 0.66 x 5 x נוריות LED עם מעמד אפי וקוטר / דיסקציה של רשתית</td></tr><tr><td>מספריים קפיציים ישרים - 8.5 ס"מ</td><td>Bionic France S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>דיסקציה של רשתית</td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים של ואנה</td><td>15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont 5</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well טכנולוגיות חיים תרמיות</td><td></td><td>4375786</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>מנקה אולטרסאונד</td><td>ציוד מעבדה</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 30k צינורות אומגה</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Fisher Scientific</td><td>SC 110 A</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופלואורומטר</td><td>TECAN</td><td>אינסופי M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בנגיף adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

תאי מולר הם תאי גליה העיקריים של הרשתית. קצה רגליהם יוצרות את הגבולות של הרשתית בקרומים החיצוניים ופנימיים הגבלה (ILM), ובשיתוף עם האסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל הם מקימים את מחסום הדם-רשתית (BRB). BRB מגביל תחבורה מהותית בין זרם הדם והרשתית תוך ILM פועל כקרום במרתף שמגדיר בהיסטולוגיה גבול בין הרשתית וזגוגית החלל. תיוג תאי מולר הוא רלוונטי במיוחד כדי ללמוד את מצבו הפיזי של המחסומים ברשתית, תאים אלה הם חלק בלתי נפרד מBRB וILM. שני BRB וILM לעתים קרובות שינו במחלת רשתית ואחראי לתסמיני מחלה. ישנן מספר שיטות מבוססות היטב ללמוד על שלמות BRB, כגון assay הכחול אוונס או אנגיוגרפיה והעמסת. עם זאת שיטות אלה אינן מספקים מידע על המידה של t חדירות BRBo מולקולות גדולות יותר, בטווח ננומטר. יתר על כן, הם אינם מספקים מידע על מצבם של חסמים אחרים ברשתית כגון ILM. ללמוד חדירות BRB צד ILM רשתית, השתמשנו בשיטה המבוססת AAV שמספקת מידע על חדירות של BRB למולקולות גדולות יותר תוך ציון המצב של חלבוני ILM ומטריצת חוץ-תאית במצבי מחלה. שתי גרסאות AAV שימושיות למחקר כזה: AAV5 וShH10. יש AAV5 כמיהות טבעיות לקולטני אור, אבל זה לא יכול להעביר לרשתית החיצונית כאשר מנוהל לתוך הזגוגית כאשר ILM הוא שלם (כלומר, ברשתית wild-type). יש ShH10 כמיהות חזקות לתאי גלייה וסלקטיבי תווית גליה מולר בשתי רשתיות בריאים וחולה. ShH10 מספק מסירת גן יעילה יותר ברשתית שבו ILM נפגעת. כלים הנגיפיים אלה בשילוב עם ניתוח אימונוהיסטוכימיה והדם-DNA לשפוך אור על מצבם של חסמי רשתית במחלה.

אנו מצפים לתמרת רשתית של תאי גליה מולר באמצעות ShH10 אם מודל החיה מראה הפרעות במבנה של ILM (איור 2 א - ב). לדוגמא, הראינו כי בהעדר Dp71, מטרות ShH10 במיוחד אבל בצורה יעילה יותר Müller תאי גלייה ידי הזרקת תוך, המצביעים על חדירות מוגברות של ILM בקו העכבר הזה בהשוואה לעכברי wild-type 16 (איור 2C - F). גם AAV5 יכול לשמש כמדד לחדירות ILM. A...

כדי לחקור את חדירות מחסום הדם-רשתית ואת שלמות הממברנה המגבילה הפנימית במודלים של מחלות רשתית בבעלי חיים, השתמשנו במספר גרסאות של נגיף הקשור לאדנו-(AAV) ככלים לתיוג נוירונים ברשתית וגליה. ביטוי גן מדווח בתיווך וירוס משמש לאחר מכן כאינדיקטור לחדירות מחסום הרשתית.

שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את חדירות מחסום הדם-רשתית ואת שלמות הקרום המגביל הפנימי במודלים של מחלות רשתית בבעלי חיים. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקת חלקיקי AAV המכילים טרנסגן GFP לתוך הזגוגית או לתוך זרם הדם. השלב השני הוא דגימת דם בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקות.דגימת הדם מושלמת על ידי דימות שבועי של קרקית העין in vivo. השלב הסופי הוא ביצוע אימונוהיסטוכימיה על דגימות שטוחות של הרשתית (retinal flat mounts) ועל חתכי קריו של הרשתית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית וב-PCR כדי להראות את תבנית הטרנסדוקציה המעידה על שלמות ה-ILM ולגילוי חלקיקי AAV בזרם הדם, ובכך להוכיח את חדירותו של מחסום הדם-רשתית.היתרון המרכזי של טכניקה זו, בהשוואה לשיטות הקיימות, הוא ששיטת ה-AAV paste מספקת מידע על חדירות מחסום הדם-רשתית שאינו ניתן על ידי תאים אחרים. ההשלכות של טכניקה זו חולשות על טיפול גנטי מתווך AAV, כיוון שהיא מסייעת להבטיח את חדירות מחסום הדם-רשתית לחלקיקי AAV, ובכך מונעת תופעות לוואי בלתי רצויות. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שלמות הממברנה המגבילה הפנימית (inner limiting membrane) במודלים של בעלי חיים למחלות רשתית אחרות, כגון חולדות סוכרתיות.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ראינו כי הרשתית של מודל העכבר עם המוטציה DP 71 null, שהראתה פריצה של מחסום הדם-רשתית, עברה טרנסדוקציה ביעילות רבה יותר מאשר רשתית של סוג בר (wild type).התחל בהרדמת עכברי C-57 black-six J. ודא את היעלמותם של שלושה רפלקסים: רפלקס ההזדקפות, רפלקס הנסיגה והתגובה ללחיצת זנב.היעלמות רפלקסים אלה מאשרת את ההרדמה. בשלב הבא, הרחב את האישונים על ידי טפטוף של 5%neosynephrine ו-0.5%mydriaticum על הקרנית באמצעות טפטפת. לאחר מכן, השתמש במשחה וטרינרית כדי לשמן את העיניים כדי למנוע את התייבשותן המוגברת. כעת, טען מחט חד-פעמית דקה מאוד בכיול 30 gauge בתמיסת מקור המכילה 10¹¹ עד 4 × 10¹¹ חלקיקי AAV-GFP.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן עליהם לבצע הזרקה תוך-זגוגית בטוחה ככל האפשר מבלי לגעת בעדשה או ברשתית. לאחר מכן, יש להחדיר מחט חד-פעמית דקה מאוד בכילוב 30 דרך קו המשווה ובסמיכות ללימבו אל תוך חלל הזגוגית. לאחר החדרת המחט לעין, יש להזריק מיקרוליטר של תמיסה תוך מעקב אחר מיקום המחט במרכז חלל הזגוגית.השתמשו בעין אחת כביקורת עבור ניסויי קרום הגבלה פנימי (inner limiting membrane) והזריקו לשתי העיניים עבור ניסויי מחסום דם-רשתית (blood retinal barrier). לאחר ההזרקה, החילו טיפול טופקלי אנטי-דלקתי ואנטי-בקטריאלי לכל עין שהוזרקה. שבוע לאחר מכן, הרחיבו את האישונים באמצעות neosynephrine ו-mydriaticum ובצעו בדיקות קרקית העין באמצעות מצלמת קרקית עין.עקבו אחר ביטוי ה-GFP באמצעות תצפיות שבוע אחד, שבועיים, חודש וחודשיים לאחר ההזרקה. לאחר הוצאת העיניים מבעל חיים מוזרק שהורדם, בצעו דיסקציה של העיניים כדי להסיר את העדשה ואת הקרנית. לאחר מכן, בצעו קיבוע בטבילה של העין המנותחת ב-4% paraformaldehyde למשך שעה אחת. לאחר שעה, בצעו הגנה קריוגנית של העיניים ב-10% sucrose למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השרו את העיניים ב-20% sucrose למשך שליש שעה בטמפרטורת החדר.לבסוף, השארו את העיניים בתמיסת sucrose 30% למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, טמנו והקפיאו את כוסיות העין (eye cups) בשרף טמינה כגון cryo-matrix. לאחר מכן, באמצעות קריוסטט, הכינו חתכים בעובי 10 micron והעבירו אותם לסליידים המיועדים לרקמה קפואה.כעת בצעו פרמיביליזציה של החתכים על השקופיות באמצעות דטרגנט למשך חמש דקות. לאחר מכן, בצעו שתי שטיפות קצרות ב-PBS. לאחר מכן, חסמו את העיניים למשך שעה בטמפרטורת החדר.עבור דגימות שטוחות של הרשתית (retinal flat mounts), הקלו את הניתוח על ידי קיבוע של העיניים שהוצאו ב-4% para formaldehyde למשך 15 עד 30 דקות. קיבוע זה, וכן הקיבוע שלאחר הניתוח, חייבים להתבצע כראוי שכן הם קריטיים לשימור פלורסצנציית ה-GFP. בתוך 15 עד 30 דקות מתקופת הקיבוע, בצעו את ניתוח העיניים והסירו את הקרנית ואת העדשה.הפרידו את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטרי של הרשתית ומהסקלרה על ידי חיתוך מסביב ל-ora serrata ולעצב האופטי. לאחר הדיסקציה, טבלו את הרשתיות ב-4% Paraformaldehyde למשך 30 דקות נוספות כדי לקבע את הרקמה ואת החלבון הפלואורסצנטי בתאי הרשתית שעברו טרנסדוקציה. לאחר הקיבוע, שטפו את הדגימה למשך חמש דקות ב-PBS סטרילי ב-pH 7.4.לאחר מכן, החליפו את ה-PBS בתמיסת חסימה (blocking buffer) והדגיפו את הרשתיות למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. התחילו את שלב הסימון על ידי הדגפת הדגימות עם הנוגדנים הראשוניים בתמיסת חסימה, למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר יישום הנוגדן הראשוני, שטפו את הרקמות שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן הדגיפו את הרקמות בתמיסת חסימה המכילה נוגדנים מצומדים ל-Alexa Fluor בדילול של 1:500.דגרו למשך שעה אחת עבור נתחים קריוגניים (cryo-sections) או למשך שעתיים עבור דגימות שטוחות (flat mounts). בצעו זאת בטמפרטורת החדר והגנו את הדגימות מאור. לאחר יישום הנוגדן המשני, הסירו אותו באמצעות שלושה שטיפות ב-PBS כפי שבוצע קודם לכן.כעת, בצעו חתכי שחרור לרשתית כך שניתן יהיה להצמידה באופן שטוח לזכוכית של למסלידה, כאשר תאי הפוטורצפטורים או תאי הגנגליון של הרשתית פונים כלפי מעלה. מרחו מדיום הצמדה מימי והניחו כיסוי זכוכית. ניתן לשמור את הלמסלידות בטמפרטורה של 4 °C לפני ביצוע הדמיה במיקרוסקופ קונפוקאלי.יש להתחיל ביצירת בקרת חיובית לחלקיקי AAV במחזור הדם. ראשית, יש לקחת דגימת דם של 10 עד 20 µL לפני הזרקת ה-AAV. לאחר מכן, לאחר הרדמה, יש להזריק 100 µL של תמיסת הווירוס מהמלאי אל זרם הדם.הדרך הקלה יותר להזרקת חומרים למחזור הדם היא דרך וריד הפין.בצילום וידאו זה, אנו מזריקים צבע כחול כבקרת ויזואלית להזרקה. במהלך שלושת הימים הבאים המשיכו לדגום דגימות דם קטנות באופן תקופתי ולאחר מכן הקריבו את העכבר. מדגימת רקמה הוציאו את ה-genomic DNA מהדגימות באמצעות ערכה מסחרית, ובעזרת ה-DNA בצעו הגברה באמצעות PCR עם זוג פריימרים ל-GFP. הריצו 30 מחזורים עם שלבי הארכה של 45 שניות וטמפרטורת annealing של 55 degrees Celsius. דפוס הטרנסדוקציה של וקטור SHH 10 היה צפוי לעלות בעכברי DP 71 null. אם המודל החייתי הראה שיבושים במבנה של הקרום המגביל הפנימי, לעכברי DP 71 null יש מחסומי רשתית פגומים ולכן הם מהווים השוואה שימושית; בעכברי DP 71 null הזרקה תוך-זגגית (intravitreal) של SHH 10 פוגעת בתאי מילר גליאליים ביעילות רבה יותר.דבר זה מעיד על דה-סטביליזציה של הקרום המגביל הפנימי (inner limiting membrane) בשורת העכברים התראנסגנית זו בהשוואה לבקרי wild type. הזרקת AAV5-GFP הדגימה גם היא חדירות של הקרום המגביל הפנימי. AAV5 לא היה יעיל בהזרקה לוויטריאית בעכברי wild type, אך הפך ליעיל מאוד בהעברת גנים לפוטורצפטורים בעכברים עם מחסומי רשתית פגומים, כגון בעכברי DP 71 null.באמצעות אנליזת PCR נמצא כי מחסום הדם-רשתית בעכברים עם מחסור ב-DP 71 נותר סלקטיבי לחלקיקי AAV, שכן לא נמצאו עקבות של AAV בדגימות הדם שלהם לאחר הזרקה תוך-זגגית (intravitreal). לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן השימוש בנגיף adeno associated virus לצורך בדיקת שלמות ממברנת הגבלה פנימית (inner limiting membrane) או בדיקת חדירות מחסום הדם-רשתית, באמצעות אנליזה של דפוס הטרנסדוקציה ברשתית או נוכחות חלקיקי AAV בזרם הדם.

using-adeno-associated-virus-as-tool-to-study-retinal-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה אנו משתמשים adenovirus נושאת את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי העוברית נושאת אלל floxed Rac1.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

סרטון זה מראה הדבקת נוירונים ראשוניים במוח התיכון של עכבר בנגיפים הקשורים לאדנו הנושאים מחוון סידן פלואורסצנטי. הפלואורסצנטיות של המדד מאשרת הדבקה מוצלחת ומאפשרת ניטור בזמן אמת של זיהום עצבי.

הדבקת נוירונים ראשוניים במוח התיכון של עכבר בנגיפים מהונדסים הקשורים לאדנו

מקור: Grames, M. S., et al. שיטות וטיפים למתן תוך ורידי של נגיף הקשור לאדנו לחולדות והערכת התמרה של מערכת העצבים המרכזית. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את הזרקת וריד הזנב של נגיף אדנו-קשור רקומביננטי (AAV) בחולדות. לאחר ההזרקה לווריד הזנב הרוחבי, הנגיף נכנס לזרם הדם, מסתובב דרך הלב ומגיע למוח, שם הוא נכנס לתאי עצב ומקל על ייצור חלבון מטרה ליישומים נוירותרפיים.

 מתן תוך ורידי של וקטורים רקומביננטיים של וירוסים הקשורים לאדנו במודל חולדה 

הזרקה תת-רשתית היא טכניקה כירורגית להעברת גנים יעילה לאפיתל פיגמנט הרשתית בעין העכבר.  כאן אנו מתארים שיטה קלה וניתנת לשכפול להזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לאפיתל פיגמנט רשתית בעכברי ניסוי.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

שיטות משלוח הגן רחב היקף מערכת העצבים המרכזית בחולדה מכוסים. בדוגמה זו, המטרה היא לחקות מחלה המשפיעה על חוט השדרה כולו. התמרה חושית רחבה יכול לשמש כדי לספק חלבון טיפולית מערכת העצבים מהמינהל, היקפי חד פעמי.

שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית

כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.

הדמיה בזמן לשגות של arborization עצבי באמצעות תיוג וירוסים דליל אדנו הקשורים של אוכלוסיות תאי רשתית ממוקדים גנטית

פרוטוקול זה מציג כיצד לכמת את יעילות התמרה של AAV ברשתית העכבר באמצעות PCR טיפה דיגיטלית (dd-PCR) יחד עם ייצור AAV בקנה מידה קטן, הזרקה תוך-ויטמינית, הדמיית רשתית ובידוד DNA גנומי ברשתית.

שיטת PCR טיפה דיגיטלית לכימות יעילות טרנסדוקציה AAV ב- מורין רשתית

בכתב יד זה, הזרקה תת-קרקעית מודגמת כשיטת העברה וקטורית תקפה לרקמות עיניים בעכברים באמצעות מערכת הזרקה המורכבת ממשאבת מזרק אינפוזיה/נסיגה ומזרק נשלף גז בשילוב עם מחטי מיקרו-הזרקה. מערכת הזרקה זו ניתנת להתאמה גם לנתיבי ניהול תוך עיניים אחרים.

מתן תת-לחמית של וקטורים של וירוסים הקשורים לאדנו במודלים של בעלי חיים קטנים

וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .

תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירה וטיהור של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות שיטת כרומטוגרפיית זיקה אופטימלית מבוססת הפרין. הוא מציג גישה פשוטה, ניתנת להרחבה וחסכונית, ומבטל את הצורך באולטרה-צנטריפוגה. הווקטורים המתקבלים מפגינים טוהר גבוה ופעילות ביולוגית, מה שמוכיח את ערכם במחקרים פרה-קליניים.

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי

חקור חדירות מחסום הדם-רשתית ושלמות הממברנה הפנימית המגבילה ברשתית בעזרת נגיפי AAV. שיטה זו מאפשרת הערכת חסמים רשתיתיים במחלות עיניים שונות.

שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

גלה סרטונים נוספים