שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את חדירות מחסום הדם-רשתית ואת שלמות הקרום המגביל הפנימי במודלים של מחלות רשתית בבעלי חיים. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקת חלקיקי AAV המכילים טרנסגן GFP לתוך הזגוגית או לתוך זרם הדם. השלב השני הוא דגימת דם בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקות.

דגימת הדם מושלמת על ידי דימות שבועי של קרקית העין in vivo. השלב הסופי הוא ביצוע אימונוהיסטוכימיה על דגימות שטוחות של הרשתית (retinal flat mounts) ועל חתכי קריו של הרשתית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית וב-PCR כדי להראות את תבנית הטרנסדוקציה המעידה על שלמות ה-ILM ולגילוי חלקיקי AAV בזרם הדם, ובכך להוכיח את חדירותו של מחסום הדם-רשתית.

היתרון המרכזי של טכניקה זו, בהשוואה לשיטות הקיימות, הוא ששיטת ה-AAV paste מספקת מידע על חדירות מחסום הדם-רשתית שאינו ניתן על ידי תאים אחרים. ההשלכות של טכניקה זו חולשות על טיפול גנטי מתווך AAV, כיוון שהיא מסייעת להבטיח את חדירות מחסום הדם-רשתית לחלקיקי AAV, ובכך מונעת תופעות לוואי בלתי רצויות. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שלמות הממברנה המגבילה הפנימית (inner limiting membrane) במודלים של בעלי חיים למחלות רשתית אחרות, כגון חולדות סוכרתיות.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ראינו כי הרשתית של מודל העכבר עם המוטציה DP 71 null, שהראתה פריצה של מחסום הדם-רשתית, עברה טרנסדוקציה ביעילות רבה יותר מאשר רשתית של סוג בר (wild type).

התחל בהרדמת עכברי C-57 black-six J. ודא את היעלמותם של שלושה רפלקסים: רפלקס ההזדקפות, רפלקס הנסיגה והתגובה ללחיצת זנב.

היעלמות רפלקסים אלה מאשרת את ההרדמה. בשלב הבא, הרחב את האישונים על ידי טפטוף של 5%neosynephrine ו-0.5%mydriaticum על הקרנית באמצעות טפטפת. לאחר מכן, השתמש במשחה וטרינרית כדי לשמן את העיניים כדי למנוע את התייבשותן המוגברת. כעת, טען מחט חד-פעמית דקה מאוד בכיול 30 gauge בתמיסת מקור המכילה 10¹¹ עד 4 × 10¹¹ חלקיקי AAV-GFP.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן עליהם לבצע הזרקה תוך-זגוגית בטוחה ככל האפשר מבלי לגעת בעדשה או ברשתית. לאחר מכן, יש להחדיר מחט חד-פעמית דקה מאוד בכילוב 30 דרך קו המשווה ובסמיכות ללימבו אל תוך חלל הזגוגית. לאחר החדרת המחט לעין, יש להזריק מיקרוליטר של תמיסה תוך מעקב אחר מיקום המחט במרכז חלל הזגוגית.

השתמשו בעין אחת כביקורת עבור ניסויי קרום הגבלה פנימי (inner limiting membrane) והזריקו לשתי העיניים עבור ניסויי מחסום דם-רשתית (blood retinal barrier). לאחר ההזרקה, החילו טיפול טופקלי אנטי-דלקתי ואנטי-בקטריאלי לכל עין שהוזרקה. שבוע לאחר מכן, הרחיבו את האישונים באמצעות neosynephrine ו-mydriaticum ובצעו בדיקות קרקית העין באמצעות מצלמת קרקית עין.

עקבו אחר ביטוי ה-GFP באמצעות תצפיות שבוע אחד, שבועיים, חודש וחודשיים לאחר ההזרקה. לאחר הוצאת העיניים מבעל חיים מוזרק שהורדם, בצעו דיסקציה של העיניים כדי להסיר את העדשה ואת הקרנית. לאחר מכן, בצעו קיבוע בטבילה של העין המנותחת ב-4% paraformaldehyde למשך שעה אחת. לאחר שעה, בצעו הגנה קריוגנית של העיניים ב-10% sucrose למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השרו את העיניים ב-20% sucrose למשך שליש שעה בטמפרטורת החדר.

לבסוף, השארו את העיניים בתמיסת sucrose 30% למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, טמנו והקפיאו את כוסיות העין (eye cups) בשרף טמינה כגון cryo-matrix. לאחר מכן, באמצעות קריוסטט, הכינו חתכים בעובי 10 micron והעבירו אותם לסליידים המיועדים לרקמה קפואה.

כעת בצעו פרמיביליזציה של החתכים על השקופיות באמצעות דטרגנט למשך חמש דקות. לאחר מכן, בצעו שתי שטיפות קצרות ב-PBS. לאחר מכן, חסמו את העיניים למשך שעה בטמפרטורת החדר.

עבור דגימות שטוחות של הרשתית (retinal flat mounts), הקלו את הניתוח על ידי קיבוע של העיניים שהוצאו ב-4% para formaldehyde למשך 15 עד 30 דקות. קיבוע זה, וכן הקיבוע שלאחר הניתוח, חייבים להתבצע כראוי שכן הם קריטיים לשימור פלורסצנציית ה-GFP. בתוך 15 עד 30 דקות מתקופת הקיבוע, בצעו את ניתוח העיניים והסירו את הקרנית ואת העדשה.

הפרידו את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטרי של הרשתית ומהסקלרה על ידי חיתוך מסביב ל-ora serrata ולעצב האופטי. לאחר הדיסקציה, טבלו את הרשתיות ב-4% Paraformaldehyde למשך 30 דקות נוספות כדי לקבע את הרקמה ואת החלבון הפלואורסצנטי בתאי הרשתית שעברו טרנסדוקציה. לאחר הקיבוע, שטפו את הדגימה למשך חמש דקות ב-PBS סטרילי ב-pH 7.4.

לאחר מכן, החליפו את ה-PBS בתמיסת חסימה (blocking buffer) והדגיפו את הרשתיות למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. התחילו את שלב הסימון על ידי הדגפת הדגימות עם הנוגדנים הראשוניים בתמיסת חסימה, למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר יישום הנוגדן הראשוני, שטפו את הרקמות שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן הדגיפו את הרקמות בתמיסת חסימה המכילה נוגדנים מצומדים ל-Alexa Fluor בדילול של 1:500.

דגרו למשך שעה אחת עבור נתחים קריוגניים (cryo-sections) או למשך שעתיים עבור דגימות שטוחות (flat mounts). בצעו זאת בטמפרטורת החדר והגנו את הדגימות מאור. לאחר יישום הנוגדן המשני, הסירו אותו באמצעות שלושה שטיפות ב-PBS כפי שבוצע קודם לכן.

כעת, בצעו חתכי שחרור לרשתית כך שניתן יהיה להצמידה באופן שטוח לזכוכית של למסלידה, כאשר תאי הפוטורצפטורים או תאי הגנגליון של הרשתית פונים כלפי מעלה. מרחו מדיום הצמדה מימי והניחו כיסוי זכוכית. ניתן לשמור את הלמסלידות בטמפרטורה של 4 °C לפני ביצוע הדמיה במיקרוסקופ קונפוקאלי.

יש להתחיל ביצירת בקרת חיובית לחלקיקי AAV במחזור הדם. ראשית, יש לקחת דגימת דם של 10 עד 20 µL לפני הזרקת ה-AAV. לאחר מכן, לאחר הרדמה, יש להזריק 100 µL של תמיסת הווירוס מהמלאי אל זרם הדם.

הדרך הקלה יותר להזרקת חומרים למחזור הדם היא דרך וריד הפין.בצילום וידאו זה, אנו מזריקים צבע כחול כבקרת ויזואלית להזרקה. במהלך שלושת הימים הבאים המשיכו לדגום דגימות דם קטנות באופן תקופתי ולאחר מכן הקריבו את העכבר. מדגימת רקמה הוציאו את ה-genomic DNA מהדגימות באמצעות ערכה מסחרית, ובעזרת ה-DNA בצעו הגברה באמצעות PCR עם זוג פריימרים ל-GFP. הריצו 30 מחזורים עם שלבי הארכה של 45 שניות וטמפרטורת annealing של 55 degrees Celsius. דפוס הטרנסדוקציה של וקטור SHH 10 היה צפוי לעלות בעכברי DP 71 null. אם המודל החייתי הראה שיבושים במבנה של הקרום המגביל הפנימי, לעכברי DP 71 null יש מחסומי רשתית פגומים ולכן הם מהווים השוואה שימושית; בעכברי DP 71 null הזרקה תוך-זגגית (intravitreal) של SHH 10 פוגעת בתאי מילר גליאליים ביעילות רבה יותר.

דבר זה מעיד על דה-סטביליזציה של הקרום המגביל הפנימי (inner limiting membrane) בשורת העכברים התראנסגנית זו בהשוואה לבקרי wild type. הזרקת AAV5-GFP הדגימה גם היא חדירות של הקרום המגביל הפנימי. AAV5 לא היה יעיל בהזרקה לוויטריאית בעכברי wild type, אך הפך ליעיל מאוד בהעברת גנים לפוטורצפטורים בעכברים עם מחסומי רשתית פגומים, כגון בעכברי DP 71 null.

באמצעות אנליזת PCR נמצא כי מחסום הדם-רשתית בעכברים עם מחסור ב-DP 71 נותר סלקטיבי לחלקיקי AAV, שכן לא נמצאו עקבות של AAV בדגימות הדם שלהם לאחר הזרקה תוך-זגגית (intravitreal). לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן השימוש בנגיף adeno associated virus לצורך בדיקת שלמות ממברנת הגבלה פנימית (inner limiting membrane) או בדיקת חדירות מחסום הדם-רשתית, באמצעות אנליזה של דפוס הטרנסדוקציה ברשתית או נוכחות חלקיקי AAV בזרם הדם.