Name: חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: חקור קישור פולימר בודד לקצה מנוף AFM באמצעות ספקטרוסקופיית הדבקה פנייתית. השיטה משתמשת בקישורי פוליאתילן גליקול לצמצום אינטראקציות לא ספציפיות ומאפשרת מדידות כוח הדבקה מדויקות בביופיזיקה וננוטכנולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ל-DFG (Hu 997/2-2) על התמיכה הכספית. FS מכיר בקרן הנס-זיידל (HSS). SKr נתמך על ידי Elitenetzwerk Bayern במסגרת תוכנית הדוקטורט Material Science of Complex Interfaces. SKi מודה ל-SFB 863 על התמיכה הכספית.

<ol><li>Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Single+Membrane+Proteins+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Single-Molecule+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy.</a> Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).</li>
<li>Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+imaging+of+walking+myosin+V+by+high-speed+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.</a> Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).</li>
<li>Magonov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+in+Analysis+of+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers.</a> Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).</li>
<li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).</li>
<li>Li, H., Linke, W. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+of+the+giant+muscle+protein+titin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering of the giant muscle protein titin.</a> Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).</li>
<li>Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA mechanics.</a> Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).</li>
<li>Zhang, W., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+mechanochemistry+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Single molecule mechanochemistry of macromolecules.</a> Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).</li>
<li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Stretched+Single+Polymers%3A+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Physical Review Letters. 94 (4), 048301(2005).</li>
<li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lipid+Extraction+-+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid+Ordered+and+Liquid+Disordered+Phases%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases.</a> Biophysical journal. 107 (5), (2014).</li>
<li>Pirzer, T., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+mechanism+of+polypeptides+and+their+location+at+hydrophobic+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces.</a> Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).</li>
<li>Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+measurements+with+the+atomic+force+microscope%3A+Technique%2C+interpretation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications.</a> Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).</li>
<li>Nash, M. A., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Adhesion+of+a+Copolymer+to+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+NANO%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold.</a> ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).</li>
<li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+G+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Academic Press. New York. (1996).</li>
<li>Kienle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+molecular+architecture+on+single+polymer+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Effect of molecular architecture on single polymer adhesion.</a> Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).</li>
<li>Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+alkanethiols+on+gold%3A+comparisons+of+monolayers+containing+mixtures+of+short-+and+long-chain+constituents+with+methyl+and+hydroxymethyl+terminal+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups.</a> Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).</li>
<li>Dankerl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond+Transistor+Array+for+Extracellular+Recording+From+Electrogenic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells.</a> Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).</li>
<li>Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayer+formation+by+vesicle+fusion%3A+the+interaction+of+phospholipid+vesicles+with+surfaces+and+the+effect+of+gramicidin+on+bilayer+properties+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy.</a> Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).</li>
<li>Stetter, F. W. S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nanomechanical+Properties+of+Lipid+Membranes+are+Significantly+Influenced+by+the+Presence+of+Ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol.</a> Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).</li>
<li>Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+analysis+of+the+optical+beam+deflection+technique+for+use+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy.</a> Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).</li>
<li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+atomic-force+microscope+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868(1993).</li>
<li>Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+desorption+kinetics+from+single+molecule+force+spectroscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).</li>
<li>Li, I. T. S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+free+energy+governs+single+polystyrene+chain+collapse+in+water+and+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory%2C+analysis%2C+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li>
<li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lipid+Extraction%3A+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid-Ordered+and+Liquid-Disordered+Phases%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases.</a> Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).</li>
<li>Horinek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+adsorption+on+a+hydrophobic+surface+results+from+an+interplay+of+solvation%2C+surface%2C+and+intrapeptide+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).</li>
<li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization+of+probe+tips+and+supports+for+single-molecule+recognition+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+current+chemistry%22%5BJournal%5D)">Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy.</a> Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

<html> במהלך העשורים האחרונים, ניסויי מולקולה בודדים סיפקו תובנות חסרות תקדים לתוך מנגנונים מולקולריים והתבררו להיות גישה לא יסולא בפז בתחום מדעי חיים ומעבר. כדי להשיג נתונים סטטיסטיים טובים ומשמעותיים מניסויי SMFS, באופן אידיאלי ובעונה אחת המולקולה משמשת מעל כל מהלך הניסוי. בניגוד לניסויים בהרכבים של מולקולות, ניסויי SMFS מסוגלים לזהות אירועים נדירים ומדינות מולקולריות מוסתרות. יתרון נוסף של ניסויי מולקולה בודדים הוא שהם יכולים להיות מודל באמצעות סימולציות דינמיקה מולקולריות ...

במהלך 30 השנים האחרונות, במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התברר להיות טכניקת הדמיה רבת ערך כדי ללמוד 1,2 וסינתטי 3 חומרים ופני שטח ביולוגיים שכן הוא מספק רזולוציה מרחבית מולקולרית בכל שלושת הממדים ויכול להיות מופעל בממס שונים סביבות. בנוסף, כוח מולקולת ספקטרוסקופיה AFM-הורי (SMFS) מאפשרת למדוד כוחות הנעים בין pN לμN משטר ונתנה תובנות חסרות תקדים לדוגמא לחלבון מתקפלות 4,5, פיזיקת פולימר 6-8, ואינטראקציה מולקולה-משטח אחד 9 - 12 רציונל מאחורי .the לומד מולקולות בודדות ולא הרכב של מולקולות הוא להימנע מממוצע השפעות אשר לעתים קרובות להסוות אירועים נדירים או מדינות מולקולריות מוסתרות. יתר על כן, מספר רב של פרמטרים מולקולריים כגון אורך הגובה, אורך Kuhn, אנרגיה חופשית ההידבקות, וכו &#39;יכול להיותהושג. זה מפורט בדוגמאות שלהלן. בניסוי AFM-SMFS טיפוסי, מולקולת הבדיקה היא מצמידים את קצה חד מאוד באמצעות מולקולה מקשר. טיפ עצמו נמצא בסוף שלוחה bendable. אם הקצה הוא הביא במגע עם פני השטח מולקולת הבדיקה תהיה אינטראקציה עם פני השטח זה. על ידי התבוננות הסטייה של שלוחה על הכחשה של הקצה, הכוח, ולכן האנרגיה החופשית, כדי לנתק את המולקולה מפני השטח ניתן לקבוע. כדי לקבל נתונים סטטיסטיים משמעותיים, מספר רב של מה שנקראו עקומות כוח למרחקים שיירכש. יתר על כן, יש ניסויי מולקולה בודדת אמיתיים (כלומר, שימוש ובעונה אחת מולקולת בדיקה על משך הניסוי כולו) מולקולת הבדיקה צריכה להיות בשילוב קוולנטית לקצה AFM. כאן, פרוטוקול ניסוי לfunctionalization שלוחה עם מולקולה בודדת באמצעות קשר קוולנטי מוצג. המולקולה בודדת או יכולה להיות בשילוב באמצעות אמינו או thioקבוצת l לקצה AFM. התהליך הצמידה יכול להתבצע במגוון רחב של ממסים (אורגניים ומימיים) כדי להסביר את תכונות solvation של הפולימרים המשמשים. בחלקו הראשון, פרוטוקול כללי לצרף קוולנטית מולקולה בודדת (&quot;מולקולת בדיקה&quot;) באמצעות מולקולת מקשר לקצה AFM מתואר. לשם כך, NHS- האורגני או maleimide-הכימיה משמשת 13. יחד עם הפרוטוקול לשלוש מולקולות דוגמא, תהליכי רכישת נתונים וניתוח נתונים מתוארים ואזכור לקריאה נוספת מסופק. מולקולות הדוגמא הן: טירוזין הפולימר (ליניארי), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור השומנים. זה כולל שינויים קלים של הפרוטוקול, למשל לצרף קוולנטית cysteines. בנוסף, סעיף מוקדש להכנת משטחים שונים כגון משטח יהלום, 3 monolayer התאספו -self CH וbilayers שומנים. יש לי ממשקים אלה proven להיות אזכור טוב ודוגמאות.

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>חומרים</חזקים></td></tr><tr><td>תרכיז נוזלי אלקליין של Hellmanex III (תמיסת דטרגנטים)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (מים טהורים במיוחד, מי חמצן (35%), אמוניה (32%); 5:1:1(v/v/v)))</td> <td>מגיב סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>וקטבונד / APTES (3-אמינופרופיל)triethoxysilane</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטון יבש (< 50 ppm H2O)</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם יבש (> 99.9%)</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריאתילאמין</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד</td><td>ביוכרום, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>די-נתרן טטרבוראט (>&nbsp; 99.5%)</td> <td>ביוכרום, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>ביוכרום, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חד פונקציונלי &אלפא;-מתוקסי-ואומגה;-NHS PEG, 5 kDa, " מתיל-PEG-NHS"</td><td>Rapp, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &alpha;,&omega;-bis-NHS PEG, 6&nbsp; kDa, " NHS-PEG-NHS"</td><td>Rapp, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &alpha;-maleimidohexanoic- &omega;-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS"</td><td>ראפ, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מולקולת בדיקה (פולימר, שומנים, etc.)<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4"><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>כמות מספקת של כלי התגבשות זכוכית עם פיה (10&nbsp; מ"ל), צלחות פטרי מזכוכית (500 ומיקרו; l) ומכסי זכוכית</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr> <tr><td>תנור מעבדה דגם UF30</td><td>Memmert, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור מבוקר טמפרטורה</td><td>VWR International GmbH, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת פלזמה "Femto", 100 W</td><td>Diener, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק זכוכית נפרד אחד לכל ממס אורגני</td><td>VWR International GmbH, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערבולת מיקסר</td><td>VWR International GmbH, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה (0.5 מ"ל או 1.5 מ"ל)</td>פיפטות <td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 10-100 ומיקרו; l, 50-200 ומיקרו; l ו-100-1,000&nbsp; ומיקרו; l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM עם תא נוזל מבוקר טמפרטורה (למשל MFP-3D עם BioHeater)</td> <td>Asylulm Research, סנטה ברברה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN ctellevers cantilevers, עשוי בדרך כלל מסיליקון ניטריד (SiN) (קבוע קפיץ פחות מ-100 pN/nm, למשל MLCT)</td><td>Bruker AXS, סנטה ברברה</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

ספקטרוסקופיה כוח האטומית היא כלי אידיאלי ללמוד מולקולות על משטחים וממשקים. פרוטוקול ניסוי לזוג במגוון גדול של מולקולות בודדות קוולנטית על קצה AFM מוצג. באותו הזמן בקצה AFM הוא פסיבציה כדי למנוע אינטראקציות נוקבות בין הקצה ואת המצע, שהוא תנאי הכרחי ללימודי מולקולות בודדות מחוברת לקצה AFM. ניתוח כדי לקבוע את כוח ההידבקות, אורך ההידבקות, ואנרגיה החופשית של מולקולות אלה על משטחים מוצקים וביו-ממשקי זמן קצר הציגו והפניות חיצוניות לקריאה נוספת מסופקות. מולקולות דוגמא הן polytyrosine פולי (חומצת אמינו), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור פוספוליפידים (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine). מולקולות אלה desorbed ממשטחים שונים כמו CH 3 -SAMs, יהלומי מימן הסתיים ונתמך bilayers שומנים בתנאי ממס שונים. לבסוף,יתרונות של ניסויי מולקולת כוח ספקטרוסקופיות יחידים נדונים לרבות אמצעים כדי להחליט אם באמת מולקולה בודדת נחקרה בניסוי.

בחלק הבא, התוצאות עבור מעל מתוארות מולקולות דוגמא, כלומר polytyrosine פולי פולימרים (חומצת אמינו), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור פוספוליפידים, מוצגים. ראשית לכל דוגמא, להתנסות פרטים ספציפיים לרכישת נתונים והכנת הנתונים מסופקים. לאחר מכן, תוצאות המופת לניסויים שבם מולקולות אלה desorbed ממשטחים שונים (CH 3 -SAMs, bilayers יהלומים ושומני מימן הסתיים) מוצגות. נחישותו של כוח ההידבקות, אורך ההידבקות והאנרגיה החופשית הם הציגו. <p class="jove_content" style=";tex...

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחבר פולימר בודד לקצה של קנטילבר AFM, על מנת לבצע ארבעה ניסויי דסורבציה ספקטרוסקופיים מפני השטח עם אותם המולקולות מספר פעמים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הפעלת פלסמה של פני השטח של הקצה כדי ליצור קבוצות הידרוקסיל כשלב שני. קצה הקנטילבר עובר סיליליזציית אמינו באמצעות תמיסת בדיקה, היוצרת קבוצות אמינו על פני השטח של הקצה.השלב השלישי הוא צימוד של מולקולות פוליאתילן גליקול לקבוצות האמינו. הן מונעות אינטראקציות לא ספציפיות בין הקצה למצע ומשמשות כמולקולות מקשרות עבור הפולימרים. לבסוף, פולימרים מצומדים למולקולות הפוליאתילן גליקול כדי ליצור גשושית.מדידות מעידות כי הליך זה אכן מאפשר להשתמש באותה גשש כוח פולימרי עבור סט ניסויי מלא, או באופן דומה, עבור מאות עקומות מרחק-כוח. היתרונות העיקריים של ניסויי מולקולה בודדת על פני שיטות של אוכלוסייה (ensemble) הם היכולת לחקור קונפורמציות נדירות ומצבים שאינם שכיחים, אשר אחרת היו נסתרים בתוך ממוצע האוכלוסייה. בשל גודלם הקטן, ניתן להשוות ניסויים אלו באופן ישיר לסימולציות של דינמיקה מולקולרית.השלב הראשון הוא חיבור קוולנטי של מולקולות גשש לקצה הקנטילבר. התחל עם שבבי קנטילבר טריים מסיליקון ניטריד, והשתמש בשבבים בעלי קבוע קפיץ של 10 עד 100 pico newtons per nanometer.השתמשו בפינצטה כדי להניח אותם על תבנית זכוכית נקייה או בצלחת פטרי. לאחר מכן, הכניסו את התבנית עם השבבים לתא פלזמה של 100 watt, לאחר ריקון התא ושטיפתו בחמצן בלחץ של 0.25 millibar ובהספק של 20 watts למשך 15 דקות. בשלבים הבאים, השתמשו במנדף כדי למנוע שאיפה של אדים אורגניים במהלך עיבוד הפלזמה.הכינו את הקנטילברים לסילוזציה של חומצות אמינו בצלחת פטרי מזכוכית, תוך מזיגת 2.5 milliliters של תמיסת בדיקה. בנוסף, הכינו כלי המכיל אצטון. הוציאו את הקנטילברים מיד עם סיום עיבוד הפלזמה.טבלו כל קנטילבר באצטון למשך שנייה אחת, ולאחר מכן הניחו אותו בתמיסת ה-Optus. דגרו את הקנטילברים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני ההמשך. בזמן דגירת הקנטילברים, התחילו בהכנות לפגילציה (pegylation) כדי לצמצם את השפעות המים והאוויר על הרכיבים.התחל עם מבחנות eph שהוכנו מראש, אחת המכילה m peg, NHS והשנייה צבע. NHS Peg. קבע את משקל התוכן של כל מבחנה.בשלב הבא, עבדו עם המבחנה המכילה EG NHS והכינו את הכלורופורם להוספה. שפכו כלורופורם כדי להגיע לריכוז סופי של 25 millimolar ולנפח תמיסה מספיק כדי לכסות את הקנטילברים (cantilevers) בשלבים הבאים. הניחו את המבחנה על מערבל וורטקס (vortex mixer) כדי להבטיח את המסת האבקה.הניחי את המבחנה עם ה-EG NHS בצד כדי לעבוד עם הדיאט NHS peg. הוסיפי כלורופורם עד להגעה לריכוז סופי של 0.25 millimolar.השתמש במערבל וורטקס (vortex mixer) כדי להבטיח שהאבקה נמסה. לאחר מכן, ערבב את התמיסות כדי להתאים את היחס בין מולקולות ה-diet NHS peg לבין מולקולות ה-methyl peg NHS. יחס זה הוא בדרך כלל 1 ל-500.השג Petri dish זכוכית קטנה עם מכסה להגבלת אידוי ומלא אותה בתערובת כבסיס לזרועות התמיכה (cantilevers). סיים את הדגירה. עבור תמיסת הבדיקה של APT, הכן שני מכלים עם כ-10 milliliters של acetone ומכל אחד עם chloroform לשטיפתם.טבלו כל אחד מהם באצטון פעמיים ופעם אחת בכלורופורם, והניחו אותם בתמיסת הפוליאתילן גליקול. כסו את הצלחת והשאירו את הקנטילברים בתמיסה. למשך שעה אחת, הכינו את התהליך לצימוד קוולנטי של מולקולת גשש, שבמקרה זה היא פולי חומצת אמינו poly de tyrosine.התחל עם נפח של נתרן הידרוקסיד בריכוז one molar, והמס לתוכו את מולקולת הגשוש לריכוז של 1 mg/mL. עבור poly D tyrosine, החלף את נתרן ההידרוקסיד בבופר sodium borate ב-pH של 8 עד 8.5 מיד לפני הפונקציונליזציה.בעוד הקנטילברים משלימים את הדגירה בתמיסת פוליאתילן גליקול, הכין שלושה מכלים לשטיפתם ומכל אחד של תמיסת ה-poly tyrosine bore buffer. תמיסות השטיפה הן 5 mL של כלורופורם, 5 mL של אתנול ו-5 mL של תמיסת ה-bore buffer. השתמש בכ-300 µL של תמיסת ה-poly tyrosine bore buffer.הוציאו את הקנטילברים וטבלו כל אחד מהם תחילה בכלורופורם, לאחר מכן באתנול, ואז בתמיסת בופר borate. לפני הנחתם בתמיסת בופר borate עם פולי-טירוזין, הניחו לשבבי הקנטילבר לעבור אינקובציה למשך שעה אחת. לאחר שעה, הכינו כ-5 milliliters של בופר borate במכל אחד, ו-5 milliliters של מים אולטרה-טהורים במכל אחר לשטיפת הקנטילברים; הכינו בנוסף 20 milliliters של מים אולטרה-טהורים לצורך אחסון.הוצאו את הקנטילברים וטבלו כל אחד מהם בבופר Boite, ולאחר מכן במים אולטרה-טהורים לשטיפה. לאחר מכן, טבלו אותם במים אולטרה-טהורים לצורך אחסון. כעת ניתן להשתמש בקנטילברים לרכישת נתונים.לאחר שקצה ה-AFM פונקציונלי ושהמשטח הוכן והורכב, התחל בשלבים לרכישת נתוני FM. ראשית, הנח את הקנטילבר הפונקציונלי בתוך מחזיק קנטילבר של AFM המתאים למדידות בנוזלים. לאחר מכן, חבר את מחזיק הקנטילבר לראש ה-AFM.המשיכו במזיגת מים אל תוך תא הנוזל כדי להטביע את הקנטילבר ואת הפני השטח. לאחר מכן, הורידו את ראש ה-AFM על תא הנוזל. המתינו עד שהמערכת תגיע לשיווי משקל למשך חצי שעה לפחות.לאחר שביעות רצון מהשיווי המשקל, מקם את הקורת התנודה (cantilever) הרחק מהפני השטח, ולאחר מכן הקלט ספקטרומי רעש תרמי; נדרשים 10 ספקטרומים או יותר כדי להשיג יחס אות לרעש מספיק לשלילת השפעות של ריסון פני השטח. לאחר מכן, התקרב בזהירות לפני השטח כדי לבצע מדידה של רגישות המנוף האופטי ההופכית.תהליך זה כולל לחיצה של קצה הקנילבר (cantilever) כנגד משטח קשיח כדי להקליט את הכוח ביחס למרחק התזוזה של הפיזו (pizo). מדדו את השיפוע במהלך המגע והפכו אותו כדי לקבוע את רגישות המנוף האופטי ההפוכה. בשלב הבא, השתמשו ברגישות המנוף האופטי ההפוכה ובספקטרום הרעש התרמי כדי לקבוע את קבוע הקפיץ של הקנילבר באמצעות התאמת מתנד הרמוני לספקטרום הרעש התרמי.כעת הגדירו את הפרמטרים המתאימים לאיסוף הנתונים. הקליטו עקומות מרחק-כוח (forced distance curves) רבות עבור כל תנאי ניסויי בסיום איסוף הנתונים. קבעו שוב את הרגישות ואת קבוע הקפיץ, כדי לבדוק את העקביות והיציבות של המערכת.דוגמה זו של עקומת מרחק כפויה (forced distance trace) באדום היא מהנסיגה של poly tyrosine משכבה מונית-מולקולרית של מתיל (methyl self-assembled monolayer) במים לא טהורים. הירידה החד-שלבית לאפס כוח מעידה על ניתוק של מולקולה בודדת. התאמה סיגמואידית מוצגת בשחור.אורך הפלטו וכוח הפלטו שהופקו מסומנים בחצים. מהירות המתיחה והנסיגה של הקנטילבר הייתה 0.5 microns לשנייה, וזמן השהייה על פני השטח היה שנייה אחת. סביבות נוזליות שונות למדידה גרמו לשינויים בכוח הפלטו שהופק.היסטוגרמות אלו משקפות את כוח הפלטו שהופק ממדידות במים טהורים וממדידות בתערובות מים ואתנול, כאשר הוקלטו לפחות 300 עקבות של מרחק-כוח עבור כל תמיסה עבור פולימר בודד זהה. כאן מוצגות היסטוגרמות מקבילות עבור אורך הפלטו שהופק עבור מים טהורים ועבור תערובות מים ואתנול.הוספת אתנול מחלישה את האינטראקציה ההידרופובית בין הפולי-טירוזין לבין הפני השטח, מה שמוביל לכוח פלטו נמוך יותר ולירידה באורך הפלטו. נתונים אלו מסוכמים בלוח זה של אורך שיא הפלטו לעומת כוח שיא הפלטו. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע את פרוטוקול הפונקציונליזציה בערך בארבע שעות לאחר הפיתוח.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומי הפיזיקה והכימיה לחקור את ההידבקות והשבירה של פולימרים בממשקים.

investigating-single-molecule-adhesion-by-atomic-force-spectroscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

הנדסה

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים המיועדים לעיכול תאית. SMFS מבוסס AFM שימש לחקר התכונות המכניות ותצורת הקיפול של מכלולי חלבון הקשורים לתאית. אנו מציגים זרימת עבודה מלאה לקיבוע חלבונים, רכישת נתונים וניתוח נתונים כדי לחקור את האינטראקציות של קומפלקסים בודדים של קולטנים-ליגנדים המעורבים בהרכבת תאית.

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

ניתן להשתמש בננוסקופיה של בדיקה קולואידית במגוון תחומים כדי לקבל תובנה לגבי היציבות הפיזית וקינטיקה של קרישה של מערכות קולואידיות ולסייע במדעי גילוי וניסוח תרופות באמצעות מערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת בה מספקת אמצעי כמותי ואיכותי לחקר מערכות כאלה.

בחינה כמותית ואיכותי של אינטראקציות חלקיקי חלקיקים באמצעות קולואיד Probe Nanoscopy

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדוד את הכח של אינטראקציות בין משטח אורגני מוגדר היטב או פפטידים או חומצות אמינו על ידי מדידות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). המידע המתקבל מהמדידה חשוב להבין טוב יותר את שלבי חומר פפטיד-אורגנית.

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) היא טכניקה חזקה לפתיחה מכנית וחישה בזמן אמת של מערך אנסמבל של מבנים ביומולקולריים בתחומים ביופיזיים וביו-סנסורים.

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה

אנו מתארים את ההכנה של נקודתי קוונטיות colloidal עם גודל הידרודינמית ממוזער עבור דימות פלואורסצנטי מולקולה בודדה. בהשוואה לנקודות קוונטיות קונבנציונליות, חלקיקים אלה הם בגודל דומים לחלבונים כדוריים ומותאמים לבהירות מולקולה בודדה, יציבות נגד photodegradation, והתנגדות לקשירה לא ספציפית לחלבונים ותאים.

נקודות קוונטיות קומפקטיות להדמית מולקולה בודדה

חקור קישור פולימר בודד לקצה מנוף AFM באמצעות ספקטרוסקופיית הדבקה פנייתית. השיטה משתמשת בקישורי פוליאתילן גליקול לצמצום אינטראקציות לא ספציפיות ומאפשרת מדידות כוח הדבקה מדויקות בביופיזיקה וננוטכנולוגיה.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

גלה סרטונים נוספים