חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה
27 בפברואר 2015
מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחבר פולימר בודד לקצה שלוחה A FM על מנת לבצע ארבעה ניסויי ספיגה ספקטרוסקופיים של פני השטח עם אחד באותן מולקולות מספר פעמים. זה מושג על ידי פלזמה ראשונה המפעילה את פני השטח של הקצה על מנת ליצור קבוצות הידרוקסיל כשלב שני. קצה השלוחה מבודד אמינו על ידי תמיסת בדיקה למעלה, היוצרת קבוצות אמינו על פני הקצה.
השלב השלישי הוא זיווג מולקולות פוליאתילן גליקול לקבוצות האמינו. הם מונעים אינטראקציות לא ספציפיות בין הקצה למצע ומשמשים כמולקולות מקשרות לפולימרים. לבסוף, פולימרים מצומדים למולקולות הפוליאתילן גליקול ליצירת בדיקה.
מדידות מצביעות על כך שהליך זה אכן מאפשר להשתמש באותו גשוש כוח פולימרי עבור מערך ניסוי שלם, או באופן דומה, מאות רבות של עקומות מרחק כוח. היתרונות העיקריים של ניסויים במולקולה בודדת על פני שיטות אנסמבל הם שניתן לחקור אישורים נדירים ומצבים נדירים, שאחרת היו מוסתרים במיצוע אנסמבל. בגלל גודלם הקטן, ניתן להשוות ניסויים אלה ישירות לסימולציות דינמיות מולקולריות.
הצעד הראשון הוא לחבר קוולנטית מולקולות בדיקה לקצה השלוחה. התחל עם סיליקון ניטריד טרי. שבבי שלוחה משתמשים בשבבים עם קבוע קפיץ של 10 עד 100 פיקו ניוטון לננומטר.
השתמש בפינצטה כדי להניח אותם על מגלשת זכוכית נקייה או צלחת פטרי. לאחר מכן, הכניסו את השקופית עם השבבים לתא פלזמה של 100 וואט לאחר פינוי החדר ושטיפתו בחמצן המופעל ב-0.25 מיליבר ו-20 וואט למשך 15 דקות. בשלבים הבאים, השתמש במכסה מנוע כדי למנוע שאיפת אדים אורגניים במהלך עיבוד הפלזמה.
התכוננו לסילוק אמינו של השלוחים בצלחת פטרי מזכוכית, המונחת 2.5 מיליליטר של תמיסת בדיקה למעלה. בנוסף, יש לתקן כלי המכיל אצטון. אחזר את השלוחים מיד לאחר השלמת עיבוד הפלזמה.
המשך לטבול כל שלוחה באצטון למשך שנייה אחת, ולאחר מכן הנח אותה בתמיסת Optus. דגרו על השלוחה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני שתמשיכו. כאשר השלוחים דוגרים, התחל בהכנה לפגילציה כדי למזער את השפעות המים והאוויר על הרכיבים.
התחל עם צינורות eph שהוכנו בעבר, האחד מכיל m peg, NHS והשני צבע. NHS Peg. קבע את משקל התוכן של כל צינור.
לאחר מכן, עבדו עם השפופרת המכילה EG NHS והתכוננו להוספת כלורופורם. יוצקים את הכלורופורם כדי להשיג ריכוז סופי של 25 מילימולרית ותמיסה מספקת לכיסוי השלוחים בשלבים הבאים. הנח את הצינור על מערבל מערבולת כדי להבטיח שהאבקה תתמוסס.
הניחו את הצינור עם ה-EG NHS בצד כדי לעבוד עם התזונה. יתד NHS. הוסף כלורופורם כדי שיגיע לריכוז סופי של 0.25 מילימולר.
השתמש במערבל מערבולת כדי להבטיח שהאבקה מומסת. לאחר מכן, ערבבו את התמיסות כדי להתאים את היחס בין מולקולות התזונה של NHS peg לבין מולקולות ה-NHS של מתיל peg. יחס זה הוא בדרך כלל אחד ל-500.
השג צלחת פטרי קטנה מזכוכית עם מכסה כדי להגביל את האידוי ומלא אותה בתערובת כשלוחים. סיים את הדגירה. בתמיסת בדיקת APT, יש שני מיכלים עם כ-10 מיליליטר אצטון ואחד עם כלורופורם מוכנים לשטיפתם.
טובלים כל אחד מהם באצטון פעמיים ופעם אחת בכלורופורם ומניחים אותם בתמיסת הפוליאתילן גליקול. מכסים את הכלי ושומרים את השלוחים בתמיסה. למשך שעה, התכוננו לצימוד קוולנטי של מולקולת בדיקה במקרה זה חומצת אמינו פולי דה טירוזין.
התחל בנפח של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד להתמוסס לתוך זה, מולקולת הבדיקה לריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר. עבור פולי D טירוזין, החלף נתרן הידרוקסיד עבור קידוח נתרן של שמונה עד 8.5 pH. שמונה מאגרים מיד לפני הפונקציונליזציה.
כאשר השלוחים מסיימים את הדגירה שלהם בתמיסת פוליאתילן גליקול, הכינו שלושה מיכלים לשטיפתם ומיכל של קידוח הפולי טירוזין. תמיסת חיץ שמונה לשטיפה היא חמישה מיליליטר כלורופורם, חמישה מיליליטר אתנול, חמישה מיליליטר של מאגר הקדח. השתמש בכ-300 מיקרוליטר מתמיסת חיץ קידוח פולי טירוזין.
אחזר את השלוחים וטבל כל אחד מהם תחילה בכלורופורם, אחר כך באתנול, ולאחר מכן את המאגר השמיני. לפני שמכניסים אותם לפולי טירוזין נשא שמונה תמיסת חיץ. אפשרו לשבבי השלוחה לדגור במשך שעה לאחר שעה של הכנה, כחמישה מיליליטר של מאגר בייט במיכל אחד, וחמישה מיליליטר מים טהורים במיוחד במיכל אחר לשטיפת השלוחה יש גם 20 מיליליטר מים טהורים במיוחד לאחסונם.
קח את השלוחה וטבל כל אחד מהם במאגר Boite, ואחריו מים טהורים במיוחד לשטיפה. לאחר מכן טבלו אותו במים טהורים במיוחד לאחסון. כעת ניתן להשתמש בשלוחים לרכישת נתונים.
לאחר שקצה ה- A FM מתפקד והוכן והותקן משטח, התחל בשלבים לרכישת נתוני FM. ראשית הנח את השלוחה הפונקציונלית לתוך מחזיק שלוחה FM המתאים למדידה בנוזלים. לאחר מכן, חבר את מחזיק השלוחה לראש A FM.
המשך על ידי שפיכת מים לתא הנוזל כדי לטבול את השלוחה ואת פני השטח. לאחר מכן הורד את ראש ה- A FM על התא הנוזלי. תן למערכת להתאזן למשך חצי שעה לפחות.
לאחר שיווי משקל. מקם את השלוחה הרחק מפני השטח, ואז הקלט ספקטרום רעש תרמי 10 ספקטרום או יותר נדרשים כדי להשיג יחס אות לרעש מספיק כדי לא לכלול אפקטים של שיכוך פני השטח. לאחר מכן, התקרב בזהירות למשטח כדי לבצע מדידה של רגישות המנוף האופטי ההפוך.
זה כרוך בדחיפת קצה השלוחה על משטח קשיח כדי לתעד את הכוח לעומת מרחק הנסיעה של הפיזו. מדוד את השיפוע במהלך המגע והפוך אותו כדי לקבוע את רגישות המנוף האופטי ההפוך. העבודה הבאה, רגישות המנוף האופטי ההפוכה וספקטרום הרעש התרמי קבעו את קבוע הקפיץ של השלוחה על ידי התאמת מתנד הרמוני לספקטרום הרעש התרמי.
כעת הגדר את הפרמטרים המתאימים לאיסוף נתונים. רשום עקומות מרחק מאולצות רבות עבור כל תנאי ניסוי בסוף איסוף הנתונים. קבע שוב את הרגישות ואת קבוע הקפיץ, כדי לבדוק את העקביות והיציבות של המערכת.
דוגמה זו לעקבות מרחק מאולץ באדום היא מנסיגה של פולי טירוזין ממים לא טהורים חד-שכבתיים בהרכבה עצמית. ירידה בצעד אחד לאפס כוח מצביעה על ניתוק של מולקולה בודדת. ההתאמה הסיגמואידית מוצגת בשחור.
אורך הרמה שחולץ וכוח הרמה מסומנים בחצים. מהירות הנסיגה של השלוחה הייתה 0.5 מיקרון לשנייה, וזמן השהות על פני השטח היה שנייה אחת. סביבות נוזליות שונות למדידה גרמו לשינויים בכוח הרמה שחולץ.
היסטוגרמות אלה משקפות את כוח הרמה המופק למדידות במים טהורים ומדידות במים. תערובות אתנול לפחות 300 עקבות מרחק כוח נרשמו עבור כל תמיסה עם אחד באותו פולימר בודד. כאן מוצגות היסטוגרמות אנלוגיות לאורך הרמה המופקת במים טהורים ובתערובות אתנול במים.
תוספת אתנול מחלישה את האינטראקציה ההידרופובית בין פולי טירוזין למשטח, מה שמוביל לכוח רמה נמוך יותר ולירידה באורך הרמה. זה מסוכם בלוח זה של אורך שיא הרמה לעומת שיא כוח הרמה. לאחר השליטה, ניתן לבצע את פרוטוקול הפונקציונליזציה תוך כארבע שעות לאחר הפיתוח.
טכניקה זו סללה לחוקרים בתחום הפיזיקה והכימיה לחקור את ההדבקה של הפרת פולימרים בממשקים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את צימודם של פולימרים בודדים לקצה של קנטילבר ב-AFM עבור ניסויי דסורפציה ספקטרוסקופית של פני שטח. הוא מתווה את השלבים הדרושים להכנת הקצה ולהצמדת מולקולות פוליאתילן גליקול, המשמשות כמקשרים עבור הפולימרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביופיזיקה
- כימיה של פני שטח
- ננוטכנולוגיה
רקע
- מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) משמשת לניתוח פני שטח.
- צימוד קוולנטי של מולקולות משפר את הספציפיות במדידות.
- פוליאתילן גליקול (PEG) משמש בדרך כלל להפחתת אינטראקציות לא ספציפיות.
- הבנת כוחות ההיצמדות היא קריטית ליישומים שונים במדעי החומרים ובביולוגיה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לחיבור מולקולות בודדות לקצוות של AFM.
- הס facilitar של ניסויים ספקטרוסקופיים חוזרים עם אותן המולקולות.
- שיפור הדיוק של מדידות כוח הידבקות על תמיכות מוצקות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפעלת פלזמה של פני השטח של קצה ה-AFM להחדרת קבוצות הידרוקסיל.
- סילניזציה של קצה הפרובה בקבוצות אמינו ליצירת קבוצות אמינו.
- צימוד של מולקולות פוליאתילן גליקול (polyethylene glycol) לקבוצות האמינו.
- צימוד פולימרים למולקולות ה-PEG ליצירת פרובה פונקציונלית.
תוצאות עיקריות
- הוכח חיבור מוצלח של פולימרים לחודים של AFM.
- הושגה הפחתה של אינטראקציות לא ספציפיות באמצעות מקשרי PEG.
- מדידות של כוחות היצמדות ואנרגיה חופשית בוצעו ביעילות.
- השיטה מאפשרת ביצוע מספר ניסויים עם אותו מבנה מולקולרי.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה ורסטילית לצימוד מולקולרי על קצוות AFM.
- הוא משפר את המהימנות של מחקרי אינטראקציה עם פני השטח.
- ניתן ליישם שיטה זו על סוגים שונים של מולקולות ומשטחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ספקטרוסקופיה של כוח אטומי ברמה של מולקולה בודדת מאפשרת כימות ישיר של כוחות היצמדות מולקולריים בממשקים ביולוגיים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מספקת נתונים כמותיים ברזולוציה גבוהה על אינטראקציות מולקולריות, המנחים את תיקוף המטרה ואת הביטחון החזוי עבור פורטפוליוי מו"פ של ביו-פרמה. היכולת לבודד ולמדוד שוב ושוב אירועים מולקולריים בודדים משפרת את מהימנות קבלת ההחלטות בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של היצמדות מולקולרית, ובכך מבהיר את מנגנוני האינטראקציה ברמת המולקולה הבודדת.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הבחנה בין אירועי קישור ספציפיים לאירועי קישור לא ספציפיים.
- מספק נתונים כמותיים של כוח ואנרגיה המשמשים לבניית מודלים חזויים ולסינון מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקל על הכנת גששים (probes) פסיביים ופונקציונליים עבור בדיקות מולקולה בודדת הניתנות לשחזור.
- מאפשר יצירת מאות עקומות כוח-מרחק לכל גשש, מה שתומך בסטנדרטיזציה חסונה של הבדיקה.
- מספק פלטיים כמותיים (כוח הידבקות, אורך, אנרגיה חופשית) להערכה מהימנה של תרכובות או משטחים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני אינטראקציה מולקולרית עם ממשקים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- תומכת בקידום מותאם סיכונים באמצעות אספקת תובנה מכניסטית לגבי היצמדות מולקולרית תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
- מאפשרת השוואה של התנהגות מולקולרית בסביבות ממס ומשטחים שונים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות מוקדמת, דרך פיתוח בדיקות ועד לבחירת מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות אינטראקציות מולקולריות ספציפיות ומנגנוני היצמדות.
- סקר (Screening): מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור בדיקת מוכנות המבחן והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר עקומות כוח-מרחק והתפלגויות סטטיסטיות להשוואה חסונה של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מקשר נתוני היצמדות מולקולרית לרלוונטיות של ממשקים ביולוגיים, ותומך בהתאמת סמנים ביולוגיים במידת הצורך.
- שימוש חוזר בארגון: מציע פרוטוקול סטנדרטי הניתן להתאמה למולקולות ומשטחים מגוונים לשימוש רחב במו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מנגיסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק מדידות של מולקולה בודדת, סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי אספקת נתונים מולקולריים ברזולוציה גבוהה בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום מועמדים מותאם סיכונים, המבוסס על מדדי היצמדות כמותיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתפעול AFM ובספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת.
- דורש גישה למכשור ייעודי ולתשתית אנליטית לרכישת נתונים וניתוחם.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים לגבי פונקציונליזציה של הגשוש ופרוטוקולי מדידה.
- ייתכן שיידרש התאם למערכות מולקולריות שונות או לכימיה של פני השטח.
- מגבלות מעשיות כוללות את קצב העבודה (throughput) ואת הצורך בבקרה קפדנית על אינטראקציות לא ספציפיות.
