דור של אגרגטים תא Murine לב קוצב לב בהתבסס על ES-Cell-תכנות בשילוב עם Myh6-יזם-בחירה

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תאי קשרית סינוסים טהורים ביותר. זה מושג על ידי השראת התמיינות תאים על ידי שינוי המדיום ויצירת טיפות תלויות המביאות להיווצרות גופים עובריים בגודל מוגדר. לאחר מכן, הגופים העובריים יושבים על צלחת מצופה ג'לטין כך שהם יוצרים שכבת תאים.

ואז מתחילה בחירת האנטיביוטיקה ורק קרדיומיוציטים שורדים. לבסוף, שכבת התא מנותקת כדי להשיג תאי קשרית סינוס בודדים פועמים במהירות, או גופי קשרי סינוס קטנים. בסופו של דבר, הדמיית תאים חיים משמשת להצגת תדירות פעימות גבוהה של תאי קשריות סינוס.

היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שניתן לייצר תאי קשריות סינוס טהורים ביותר, למשל, לבדיקת סמים. השיטה יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח במחלת בלוטות הסינוס מכיוון שהתאים יתנו לנו תובנות לגבי המנגנונים הבסיסיים. הטכנולוגיה תוצג במעבדה על ידי ג'וליה יונג, הדוקטורנטית שלנו שפיתחה את השיטה, החל מקו תאי ES ותאי גזע פלוריפוטנטיים שגודלו יחד עם תאי הזנה מוקרנים כמתואר בפרוטוקול הטקסט יומיים לפני הליך ההתמיינות הסירו את ה-PSCs מתאי ההזנה על ידי שאיבת המדיום תחילה.

השתמש ב -10 מיליליטר PBS כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן הוסיפו שבעה מיליליטר קולגנאז ארבע תמיסות ודגרו על התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הניחו פילטר סטרילי של 40 מיקרומטר בצינור של 50 מיליליטר.

לאחר מכן שטפו בזהירות את מושבות ה-PSC על ידי פיפטינג של תמיסת הקולגנאז למעלה ולמטה חמש פעמים. העבירו את מתלה התאים למסנן והשתמשו בשמונה מיליליטר PBS כדי לשטוף את המסנן שלוש פעמים. לאחר מכן הפוך את המסנן והניח אותו הפוך בצלחת פטרי ופיפטה 10 מיליליטר PBS בתחתית המסנן.

כדי להסיר את מושבות ה-PSC, כעת העבירו את תרחיף התאים לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 פעמים. ז. הסר את ה- PBS, השהה את התאים במיליליטר אחד של אקוטן ודגר בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הדגירה מוסיפים 10 מיליליטר PBS.

מערבבים את תמיסת התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב -300 פעמים G.לאחר הסרת ה- PBS, השתמש ב -10 מיליליטר של מדיום גידול תאים כדי להשעות מחדש את התאים ולקבוע את זרע מספר התא. 15,000 תאים לסנטימטר מרובע בבקבוק פילטר של 75 סנטימטר מרובע ומטפחים אותם במשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו- 5% פחמן דו חמצני כאשר הבקבוק צריך להיות 50 ל-70% קונפלונט. לאחר קצירת התאים וה-Resus המושעים במדיום התמיינות על פי פרוטוקול הטקסט, פיפטה 20 מיליליטר מים וחמישה מיליליטר טיפה תלויה או תמיסת HD לתוך צלחת פטרי ריבועית כדי למנוע ייבוש ה-hds.

לאחר מכן, פיפטה עד 50 מיליליטר של תרחיף תאים במגש. לאחר מכן הופכים את המכסה של צלחת הפטרי ובעזרת פיפטה של 12 ערוצים מניחים 180 HDS כל אחד המכיל 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים על המכסה. הופכים בזהירות את המכסה ומניחים אותו על צלחת הפטרי.

לאחר דגירה של יומיים כדי לאפשר לתאים להיווצר ebs, הופכים בזהירות את מכסה צלחת הפטרי הריבועית ומעבירים את ה-EBS שמקורו בשתי צלחות פטרי לתוך שפופרת של 50 מיליליטר. המתן 10 דקות כדי לתת ל-EBS להתייצב בתחתית הצינור, ולאחר מכן שאב כמה שיותר בינוני. השתמש ב-10 מיליליטר של מדיום בידול כדי להשעות את ה-EBS ולהעביר את המתלה לצלחת פטרי של 10 סנטימטרים.

לאחר שהתאים תרבבו בתרחיף במשך ארבעה ימים, על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו את ה-EBS לצלחת תרבית תאים מצופה ג'לטין בגודל 10 סנטימטר רבוע ודגרו במהלך היומיים עד שישה הימים הבאים תחת מיקרוסקופ, בדקו את התאים לאיתור מוקדים פועמים והיווצרות שכבת תאים שלושה ימים לאחר שהתאים החלו לפעום. שאפו את המדיום והוסיפו 10 מיליליטר של בידול טרי. מדיום המכיל 400 מיקרוגרם למיליליטר של G ארבע 18 לתאים ארבעה ימים לאחר מכן. הסר בזהירות את המדיום מבלי לשאוב את שכבת התא.

לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר PBS כדי לשטוף את התאים. לאחר הסרת ה- PBS בזהירות, הוסף 10 מיליליטר תמיסת קולגנאז ארבע והעביר את התאים לצינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן, לאחר הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ערבבו במרץ את התרחיף על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים ודגרו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות נוספות.

צריכה להיות השעיה של אשכולות קטנים. לאחר מכן הוסיפו 20 מיליליטר PBS וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב -300 פעמים. G, שאפו בזהירות את ה-PBS ואם מייצרים גופי פרוזדורים מושרים, השתמשו ב-12 מיליליטר של מדיום התמיינות המכיל 400 מיקרוגרם למיליליטר של G 4 18 ל-Resus, השעו את התאים וראו שני מיליליטר כל אחד על שש בארות של צלחת מצופה ג'לטין 24 בארות כדי ליצור תאים בודדים במקום להוסיף מדיום התמיינות.

לאחר הסרת ה-PBS, השתמש בחמישה מיליליטר של אקוטן כדי להשהות את התאים ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. פיפטה למעלה ולמטה במרץ. מערבבים את המתלה לאחר הדגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הוסף 20 מיליליטר PBS וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב -300 פעמים G עם 12 מיליליטר בידול. מדיום המכיל G ארבע 18. השעו את התאים וראו שני מיליליטר כל אחד על שש בארות של תרבית צלחת מצופה ג'לטין 24 בארות ובצעו ניתוח של תאים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

באמצעות הפרוטוקול המודגם בסרטון זה, ניתן לייצר isab S מתאי גזע פלוריפוטנטיים עם תדירות פעימות של כ-450 פעימות לדקה כפי שניתן לראות כאן לאחר דיסוציאציה של isab S.התאים הבודדים שנצפו מראים את הצורות האופייניות של תאים של צומת הסינוס הכוללים תאי ציר ועכביש. תאים אלה מראים רמות ביטוי גבוהות של חלבונים החיוניים לתפקוד צומת הסינוס כמו קטיון מגודר נוקלאוטיד מחזורי המופעל על ידי היפרפולריזציה. ערוץ ארבע HCN ארבע, חיבור ארבע חמש קונקסיון 30.2 ו-MYH שש.

כאשר מטפלים בחוסם התעלות ZD 7 2 88, או בקרקול אגוניסט הקולטן המוסקריני, התאים הנגזרים מ-ISAB מציגים תדירות פעימות מופחתת משמעותית. לעומת זאת, איזופרן אגוניסט קולטן בטא יותרת הכליה מוביל לתדירות פעימות מוגברת. בסך הכל, הטכניקה שלנו תסלול את הדרך להבנה טובה יותר של תפקוד קוצב לב ומחלות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור תאי קשרית סינוסים מתפקדים לחלוטין מתאי גזע חזקים של PLU.