מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור אינטראקציות תאיות בין תאי סרטן ריאה לבין פיברובלסטים הקשורים לסרטן בשיטת תרבית משותפת תלת-ממדית. דבר זה מושג באמצעות תרבית ראשונית של פיברובלסטים אנושיים הקשורים לסרטן ריאה מרקמת ריאה שנאספה וקצצה לחתיכות בגודל של 1 mm. השלב השני הוא הכנת ג'לי קולגן המכילים פיברובלסטים על ידי ערבוב תמיסת קולגן עם תאי trypsinisized, והעברה לפלטה של 6 בארות לצורך ג'לטיניזציה.

בשלב הבא, תאי אדנוקרצינומה של הריאה נזרעים על פני השטח של כל ג'ל כדי להכין תרבית משותפת תלת-ממדית של תאי סרטן ופיברובלסטים, והג'ל מופרד מקצה הבאר כדי ליצור תרבית צפה. השלב האחרון הוא ביצוע תרבית בממשק אוויר-נוזל ובדיקת פלישה (invasion assay) באמצעות חשיפת הג'לים המכווצים לאוויר, על ידי הנחתם על רשת הממוקמת בתוך פלטה של שש בארות. לבסוף, נעשה שימוש בבדיקות היסטולוגיות כדי להעריך את הפלישה של תאי הסרטן ואת השינויים המורפולוגיים.

היתרון המרכזי של הליך זה על פני שיטות קיימות, כגון תרביות מונו-שכבה דו-ממדיות, הוא שניתן לחקור אינטראקציות רב-תאיות בתרבית תלת-ממדית. הליך זה מתחיל בתרבית ראשונית של פיברובלסטים מרקמת ריאה שנאספה, כפי שמתואר ומצוין בפרוטוקול הטקסט. בסרטון זה, נעשה שימוש בריאות של עכבר במקום ברקמת סרטן ריאה אנושית.

הניחו את דגימת רקמת הריאה על צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 סנטימטר ללא תוצר תרבית. חתכו את הרקמה למקטעים קטנים בגודל של כ-1 מילימטר באמצעות פינצטה סטרילית וסכין מנתחים. במהלך תהליך זה, הימנעו מייבוש המקטע, אחרת יעילות צמיחת התאים תיפגע. הניחו את מקטעי רקמת הריאה הקטנים במרחק זה מאלו כדי לשמור על שטח פנוי מסביב לכל חלק.

צור שריטות על פני השטח של צלחת תרבית הרקמה באמצעות להב סקלפל. לחלופין, כיסוי של חתיכות רקמה משפר את יעילות צמיחת התאים והנשגיהם לאחר מספר מעברים. ראשית, הנח גריז סיליקון בשתי נקודות, במרחק של 1.5 centimeter אחת מהשנייה, בכל באר.

לאחר מכן, הניחו באופן פרטני חתיכות רקמה קצוצות במרכז כל באר. לאחר מכן, הצמידו את לבידה המכסה לפני השטח של הפלטה באמצעות גריס סיליקון. הוסיפו בעדינות תוצר תרבית לצלח, או לפלטת 6 בארות, לפני שפרוסות הרקמה יתייבשו.

צמיחת התאים היעילה אובדת ברובה. אם הדגימות התייבשו, אין למזוג את המצע במהירות רבה מדי כדי למנוע התנתקות של חתכי הרקמה לצורך יצירת ג'ל קולגן. שטפו את הפיברובלסטים עם phosphate buffered saline בריכוז 1x או PBS והוסיפו tryin one כדי לנתק את התאים הצומחים לאחר trypsinization למשך כחמש דקות.

בטמפרטורה של 37 °C,נתקו את התאים באמצעות תשעה מיליליטר של DMEM מועשר ב-10% FBS. אספו את התאים התלויים במצע לתוך מבחנה של 10 מיליליטר וסבבו אותם בצנטריפוגה במהירות של 200 עד 300 ×g כדי להוות משקעי תאים. השביו את המשקעים שנוצרו ב-100% FBS בריכוז של חצי מיליון תאים למיליליטר. קררו את הרכיבים, הפיפטות והמבחנות להכנת ג'ל קולגן במקרר לפני תחילת הכנת הג'ל.

בשלב הבא, הכינו את ג'ל הקולגן על ידי ערבוב תמיחת הפיברובלסטים ב-FBS Type one A collagen five X-D-M-E-M ובבופר רקונסטיטוציה (reconstitution buffer); בצעו פיפוט נמרץ כדי להבטיח תערובת הומוגנית, תוך הימנעות מיצירת בועות במהלך תהליך הפיפוט. לאחר מכן, הוסיפו 3 mL מהתערובת לכל באער של פלטת 6 באערים והניחו לה להפוך לג'ל (gelatinize) באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ללא הפרעה למשך 30 עד 60 דקות. עבור תרבית תאי סרטן על ג'ל הקולגן, השהו (resuspend) את תאי הסרטן במצע קו-קלטור תלת-ממדי (3D co-culture medium) בריכוז של 1×10⁵ תאים ל-mL.

צקו שני מיליליטר (2 mL) של תמיסת תאי אדנוקרצינומה של הריאה A 549 שהושעו מחדש על פני השטח של כל ג'ל. שנו את מספר תאי הסרטן או הפיברובלסטים בתרבית משותפת (co-culture) בהתאם לתנאי הניסוי לביצוע התכווצות הג'ל. דגרו את הג'לים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C כדי שתוכל תאי הסרטן להיצמד לג'ל הקולגן.

לאחר מכן,נתקו כל אחד מהם וצרו תרבית צפה בכל באער. בלוח שש-בארות, השתמשו במחט במידה 21 בעלת זווית או במרית קטנה כדי להפריד כל ג'ל מדופן הבאר מדי יומיים עד שלושה ימים. רעננו את הבארות באמצעות 2 milliliters של מצע לתרבית שיתוף (co-culture) תלת-ממדית.

מדדו את גודלו של כל ג'ל מדי יום במשך חמישה ימים. לבסוף, עיינו בפרוטוקול הטקסט לניתוח ג'ל קולגן. לאחר גידול ג'לי הקולגן ב-37 °C למשך חמישה ימים.

חשפו את הג'לים המכווצים לאוויר על ידי הנחתם על רשת. בלוחיות שש-בארות חדשות, הכינו את הרשת ממסנני תאים הזמינים מסחרית המשמשים לציטומטריה של זרימה. מלאו בעדינות כל באר ב-11 milliliters של 3D co-culture.Medium.

הניחו את הג'לים על הרשת באמצעות כף סטרילית והסירו כל שארית של מצע מהג'לים בתנאי זה. הג'לים טבולים במצע בעוד שהשטח העליון של הג'ל חשוף לאוויר. הגדירו תנאי תרבית זה כממשק אוויר-נוזל (air liquid interface).

שיטת תרבית-משותפת זו, המדמה את הסביבה המיקרוסקופית של הגידול, היא כלי שימושי לחקירת האינטראקציות בין תאי סרטן לפיברובלסטים המוטמעים בג'לי קולגן. תאי 5 49 גודלו בתרבית-משותפת על ג'ל קולגן שבו הוטמעו הפיברובלסטים, ושכבת תאי 5 49 נחשפה לאוויר על ידי הנחת הג'ל על רשת בתוך מדיום. מוצגת כאן תמונה מייצגת של הג'ל המונח על הרשת בתוך באר של פלטת שש בארות, כולל ניתוחים היסטולוגיים עם hemat, toin ו-eoin.

צביעה של חתכים רוחביים של ג'ל שגודל בתרבית תלת-ממדית חשפה פלישה של 5 49 תאים אל תוך ג'ל הקולגן שבו הוטמעו פיברובלסטים הקשורים לסרטן ריאה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ביטוי גנים או knockdown כדי לענות על שאלות נוספות, כגון תפקוד של גן ספציפי באינטראקציה של סביבת הגידול (tumor stroma).