מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור אינטראקציות תאיות בין תאי סרטן ריאות ופיברובלסטים הקשורים לסרטן בשיטת תרבית משותפת תלת מימדית. זה מושג באמצעות תרבית ראשונית של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ריאות אנושי מרקמת ריאה שנאספה שנטחנת לחתיכות בגודל מילימטר אחד. השלב השני הוא הכנת ג'ל קולגן משובץ בפיברובלסטים על ידי ערבוב תמיסת קולגן באמצעות תאי העיניים של טריפסין, והעברתו לצלחת של שש בארות לג'לטין.

לאחר מכן, תאי אדנוקרצינומה של הריאות מצופים על פני כל ג'ל כדי להכין תרבית משותפת ממדית של תאים סרטניים ופיברובלסטים, והג'ל מופרד מקצה הבאר ליצירת תרבית צפה. השלב האחרון הוא לבצע את תרבית ממשק נוזל האוויר ובדיקת הפלישה באמצעות חשיפה של הג'לים המכווצים לאוויר על ידי הנחתם על רשת הממוקמת בצלחת שש בארות. בסופו של דבר, בדיקות היסטולוגיות משמשות להערכת פלישת תאים סרטניים ושינויים מורפולוגיים.

היתרון העיקרי של הליך זה על פני שיטות קיימות כמו תרבית חד-שכבתית דו-ממדית, הוא שניתן לחקור אינטראקציות רב-תאיות בתרבית תלת מימדית של מצב. הליך זה מתחיל בתרבית ראשונית של פיברובלסטים מרקמת ריאה שנאספה כמתואר ומוזכר בפרוטוקול הטקסט. בסרטון זה משתמשים בריאות עכבר במקום ברקמת סרטן ריאות אנושיות.

הנח את דגימת רקמת הריאה על צלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ ללא מדיום תרבית. חותכים את הרקמה לחלקים קטנים בגודל של כמילימטר אחד באמצעות מלקחיים סטריליים ואזמל במהלך תהליך זה, הימנע מייבוש הקטע, אחרת יעילות צמיחת התאים נפגעת. הניחו קטעי רקמת ריאה קטנים זה מזה כדי לשמור על אזור ריק המקיף כל חתיכה.

ערוך שריטות על פני צלחת תרבית הרקמות בעזרת להב אזמל. לחלופין, כיסוי של חלקי רקמה משפר את היעילות של צמיחת תאים והתפשטות תאים לאחר מספר מעברים. תחילה מניחים שומן סיליקון בשתי נקודות, במרחק של 1.5 סנטימטר זה מזה בכל באר.

לאחר מכן, הניחו חתיכות רקמה טחון בנפרד במרכז כל אחת. ובכן, חבר את החלקת הכיסוי למשטח הצלחת באמצעות שומן סיליקון. מוסיפים בעדינות מדיום תרבית לתבשיל, או צלחת שש בארות לפני שחלקי הרקמה מתייבשים.

צמיחת תאים יעילה הולכת לאיבוד לרוב. אם הדגימות מתייבשות, אין לשפוך את המדיום מהר מדי כדי למנוע ניתוק של חלקי הרקמה ליצירת ג'ל קולגן. שטפו פיברובלסטים עם תמיסת מלח אחת עם פוספט או PBS והוסיפו טריין אחד כדי לנתק את התאים הגדלים לאחר איזציה של טריפסין למשך כחמש דקות.

בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, נתקו את התאים באמצעות תשעה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS, אספו את התאים התלויים בתווך בצינור של 10 מיליליטר וצנטריפוגות אותם ב-200 עד 300 פעמים G ליצירת כדורי תאים. החייאה. השעו את הכדורים המתקבלים ב-100% FBS בצפיפות של חצי מיליון תאים למיליליטר. יש לקרר את הריאגנטים, הפיפטות והשפופרות להכנת ג'ל קולגן במקרר לפני הכנת ג'ל קולגן.

לאחר מכן, הכינו את ג'ל הקולגן על ידי ערבוב תרחיף הפיברובלסטים בקולגן FBS סוג אחד A חמש X-D-M-E-M והרכיבו מחדש את הפיפטה במרץ כדי להבטיח תערובת הומוגנית הימנעות מיצירת בועות במהלך תהליך הפיפטינג. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר מהתערובת לכל באר של צלחת שש בארות והניחו לג'לטין בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא הפרעה למשך 30 עד 60 דקות לתרבית תאים סרטניים על ג'ל הקולגן Resus. השעו את התאים הסרטניים במדיום התרבות המשותפת התלת-ממדית בצפיפות של אחד כפול 10 עד חמישי תאים למיליליטר.

שני מיליליטר גרועים של תמיסת תאי אדנוקרצינומה ריאתית 5 49 על פני כל ג'ל. שנה את מספר התאים של תאים סרטניים או פיברובלסטים בתרבית משותפת בהתאם לתנאי הניסוי לביצוע התכווצות ג'ל. דגרו על ג'לים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי שתאי הסרטן יוכלו להיצמד לג'ל הקולגן.

לאחר מכן נתק כל אחד וצור תרבות צפה בכל באר. מבין שש הבארות, צלחת עם מחט זוויתית בגודל 21 או מרית קטנה כדי להפריד כל ג'ל מקצה הבאר כל יומיים-שלושה. רענן את הבארות עם שני מיליליטר של מדיום תלת מימד של תרבות משותפת.

מדוד את הגודל של כל ג'ל כל יום במשך חמישה ימים. לבסוף, עיין בפרוטוקול הטקסט לניתוח ג'ל קולגן. לאחר תרבית ג'ל הקולגן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים.

חשוף את הג'לים המכווצים לאוויר על ידי הנחתם על רשת. בלוחות שש בארות חדשים מייצרים את הרשת ממסננות תאים זמינות מסחרית המשמשות לציטומטריית זרימה. מלאו בעדינות כל באר ב-11 מיליליטר של תרבית משותפת תלת מימדית. בינוני.

מקם את הג'לים על הרשת בעזרת כף סטרילית והסר את כל המדיום שנותר מהג'לים במצב זה. ג'לים שקועים במדיום ואילו המשטח העליון של הג'ל חשוף לאוויר. הגדר מצב תרבית זה כממשק נוזל אוויר.

שיטת תרבית משותפת זו המחקה את המיקרו-סביבה של הגידול היא כלי שימושי לחקירת האינטראקציות בין תאים סרטניים ופיברובלסטים המוטמעים בג'ל קולגן. 5,49 תאים היו תרבית משותפת על ג'ל קולגן משובץ בפיברובלסטים ושכבה של 5,49 תאים נחשפה לאוויר על ידי הנחת הג'ל על רשת במדיום. מוצגת כאן תמונה מייצגת של הג'ל המונח על הרשת בבאר של ניתוחים היסטולוגיים של צלחת שש בארות עם המט, טואין ואואין.

צביעה של חתכים של ג'ל מתורבת תלת מימדי חשפה פלישה של 5 49 תאים לג'ל הקולגן המוטבע בפיברובלסטים הקשורים לסרטן הריאות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ביטוי גנים או נוקדאון על מנת לענות על שאלות נוספות כמו תפקוד גן ספציפי באינטראקציה של סערת גידול.