בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם
19 בפברואר 2015
הגורמים לניוון של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון במהלך מחלת פרקינסון אינם מובנים במלואם. מערכות תרבית תאיות מספקות כלי חיוני לחקר התכונות הנוירופיזיולוגיות של נוירונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי, שניתן להשתמש בו למודלים במבחנה של ניוון עצבי.
מטרת פרוצדורה זו היא לבודד ולתרבת ביעילות נוירונים ראשוניים מהחלק הוונטרלי של האותג המרוקז (ventral midbrain) של מכרסמים. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה של האותג המרוקז מעוברים של מכרסמים. השלב השני הוא בידוד זהיר של החלק הוונטרלי של האותג המרוקז.
בשלב הבא, יש לדייסס את הרקמה הנוירונלית כדי להפיק תרחיף של תאים בודדים. השלב הסופי הוא זריעה של הנוירונים הראשוניים בנפח קטן על לביבות זכוכית (cover slips), לפני העברת התאים שנצמדו לתוך פלטת 24 בארות בשלב מאוחר יותר. לבסוף, נעשה שימוש בנוגדן ובמיקרוסקופיית אימונופלורסנציה כדי לזהות את הנוירונים הדופמינרגים בתוך התרבית.
הנוירונים הדופמינרגיים במח המרכזי מעורבים במספר פונקציות, כולל בקרה על תנועה ורגש בקוגניציה ומערכת התגמול של המוח. הם מעורבים גם במצבים נוירולוגיים ונוירופסיכיאטריים, כולל מחלת פרקינסון, התמכרות וסכיזופרניה. שיטה לשיקום של המוח המרכזי הוונטרלי.
ניתן להשתמש בתרביות נוירונליות לחקר הפיזיולוגיה והתכונות התאיות של נוירונים דופמינרגיים, כמו גם להבנת הסיבה לניוון שלהם במהלך הפרעות כגון מחלת פרקינסון. ראשית, הכין את למיקי הכיסוי.
הרתיחו אותם ב-70% ethanol למשך 30 דקות לפחות כדי להסיר שאריות שומן. לאחר מכן, עקרו את זכוכיות הכיסוי באוטוקלאב. העבירו את זכוכיות הכיסוי לפלטות של 24 בארות והוסיפו חצי מיליליטר של polyol all athene לכל אחת.
הניחו לצלחות לדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר. שימו לב שחיי המדף של תמיסת polyol או Athene לעבודה הם חודש אחד. לאחר מכן, שטפו את לוחות הכיסוי שלוש פעמים בחצי מיליליטר של מים בכל שטיפה.
ללא שלושת השטיפות, התאים בתרבית לא היו שורדים 24 שעות. לאחר מכן, יש להכין את תמיסת הלמינין. ודאו תחילה להפשיר אותה באיטיות על קרח.
לאחר מכן, המיסו את הלמינין ב-D-M-E-M-F 12 קר, והשתמשו בו באופן מיידי. כעת, הוסיפו חצי מיליליטר של תמיסת עבודה של למינין שהוכנה טרי לכל באר והדריכו את הפלטות להתרבות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C. לבסוף, בעת הכנת הפ pipette מזכוכית, אני מלטש את קצותיה עד למחצית מגודלן הרגיל.
בצעו חתך בבטן כדי לחשוף את שקי הרחם, ובאמצעות פינצטה, חתכו ושחררו את הרחם. העבירו את הרחם ל-HBSS קר מאוד בצלחת של 100 מילימטר, והתחילו להוציא את העוברים באמצעות פינצטה. העבירו את העוברים המבודדים לצלחת חדשה של HBSS קר.
כעת, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, התכוננו לגשת למיקום זה של האותן המידבריין (ventral midbrain) תחת הגדלה של 10x. בצעו דיסקציה של ה-meas והקשת הצפלית (cephalic arch) על ידי חיתוך המוח באיסמוס (isthmus) ובאזור הגבול שבין ה-meas ל-cephalic, באמצעות מספרי ביולוגיה או פינצטה. לאחר הוצאת המידבריין כולו, בצעו חתך במדורסאל המדיאלי של המידבריין.
הסר את הקרומים בעזרת פינצטה. שלב זה הוא קריטי להצלחת תרבית הנוירונים. תאים שאינם נוירונים ימותו בתנאי התרבית וישפיעו לרעה על הנוירונים השכנים באמצעות איתות.
כעת יש להשטח את רקמת הגב המרכזי (midbrain) לצורת פרפר. חתכו כחצי מכל כנף בעזרת להב סטרילי, כך שיישאר רק הגב המרכזי הוונטרלי (ventral midbrain). העבירו את הגב המרכזי הוונטרלי לתוך HBSS קר בקרח בתוך מבחנה קונית של 15 milliliter.
לאחר מכן, המשיכו לבצע דיסקציה של העוברים הבאים, תוך עיבוד של כמה שיותר עוברים בתוך שעה אחת. לעוברים שנשמרו על קרח למשך יותר משעה יש חיוניות תאית נמוכה. כדי להבטיח חיוניות גבוהה של הנוירונים הדופמינרגיים, הזמן מרגע הדיסקציה ועד לזריעה לא יעלה על שעה אחת.
בנוסף, הסרת הקרומים חיונית להישרדות הנוירונים תחת כיסוי. הסר את ה-HBSS מאספוף של המוח האמצעי הגבאי (ventral midbrain). לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 0.05% tripsin A DTA חם, כמות מספיקה של תמיסה עבור 12 חתיכות רקמה.
דגרו את הרקמה בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש עד 10 דקות. תחת מטא הלמינאר, החליפו את ה-tripsin A DTA ב-1 mL של תווך דה-אקטיבציה. ערבבו בעדינות על ידי תנועות סיבוביות, ולאחר מכן הסירו את תווך הדה-אקטיבציה, אך השאירו מספיק תווך כדי שבתאים המופרדים לא ייזרקו.
בשלב הבא, שטפו את הרקמות עם מצע מלא פעמיים, תוך הקפדה לא לאבד תאים. כעת הוסיפו 1 mL של מצע מלא. לאחר מכן, בצעו טריטורציה לרקמה באמצעות פיפטה שעברה ליטוש באש, ללא יצירת בועות, עד לקבלת תרחיף של תאים בודדים.
כ-8 עד 10 מעברים אמורים להספיק. לאחר פרק זה, סבב את התאים בצנטריפוגה ב-400 Gs למשך חמש דקות. הסר את המצע והשעה את התאים מחדש במיליליטר אחד של מצע מלא.
בצעו פיפטור של התאים עד ארבע פעמים כדי להשיג סספנזיה. התחילו בספירה ובהערכת בריאות התאים בסספנזיה, באמצעות שיטת הדירה של trypan blue עם המוציטומטר.
כעת התאימו את תרחיף התאים ל-1500 תאים למיקרוליטר. לאחר מכן, העבירו את מכסי מבחנות המיקרו-צנטריפוגה שעברו עיקור לצלחות בקוטר 100 מילימטר. הניחו את לביבות הכיסוי שהוכנו על המכסים באמצעות פינצטה.
אין לשטוף את לביבות הכיסוי ויש להשתדל שלא לתת להן להתייבש. העמסו 100 µL של תרחיף על כל לביבת כיסוי. שיטה יוצאת דופן זו זו מספקת 90% חיות לתרבית ומהווה שלב קריטי להצלחה.
לאחר מכן סגרו את צלחת הפטרי והעבירו אותה לאנקובטור למשך שעה. לאחר הדגירה, העבירו בזהירות את לביבות הזכוכית (cover slips) עם המצע ללוחיות 24 בארות המכילות 400 µL של מצע מלא המחומם ל-37 °C בכל בארה, ולאחר מכן דגרו את התאים למשך לילה. השעות הראשונות הן הקריטיות ביותר להישרדות התאים בתוך 24 שעות. הוסיפו בעדינות 0.5 mL של מצע מלא לכל בארה.
בכל שבועיים. יש להחליף מחצית מהמדיום. אם התרבית הופכת לצהובה, ניתן לבצע את החלפת מחצית המדיום מוקדם יותר, אך עדיין יש לבצע את ההחלפה בתדירות נמוכה.
נוירונים דופמינרגיים ישרדו במשך יותר משישה שבועות בתנאים אלה. לאחר שבועיים של תרבית, אימונוהיסטוכימיה נגד tyrosine, hydroxylase וסמנים נוירונליים מראים כי 1% מהתאים הם דופמינרגיים. שלוחות נוירונליות מופיעות בתוך שעתיים מהזריעה.
עד לסוף היום הראשון בתרבית, ניתן להבחין בין האקסונים לדנדריטים. בסופו של דבר, הנוירונים שורדים למשך יותר משישה שבועות ומראים צמיחה נרחבת לאחר ביצוע פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טרנסדוקציה ויראלית, פלואורסצנציה אימונית או אלקטרופיזיולוגיה, כדי לענות על שאלות מכניסטיות בנוירונים דופמינרגיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד ולתרבית של נוירונים ראשוניים מהמידבריין הוונטרלי (ventral midbrain) של מכרסמים, דבר החיוני לחקר דגנרציה של נוירונים דופמינרגים במחלת פרקינסון. השיטה כוללת דיסקציה, דיסוציאציה של רקמה והזריעה של נוירונים, ולאחריהן מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה לצורך זיהוי הנוירונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ניורודגנרציה
רקע
- מחלת פרקינסון כוללת ניוון של נוירונים דופמינרגיים בגוף הביניים של המוח.
- המנגנונים העומדים מאחורי ניוון זה אינם מובנים במלואם.
- מודלים in vitro חיוניים לחקר תכונות נוירופיזיולוגיות.
- תרביות של נוירונים ראשוניים יכולות לספק תובנות לגבי ניוון עצבי.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול אופטימלי לגידול נוירונים דופמינרגיים.
- סיוע במחקר של התכונות הנוירופיזיולוגיות של נוירונים אלו.
- שיפור ההבנה של מנגנוני מחלת הפרקינסון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של גבעול המוח העוברי במכרסקים.
- בידוד של הגבעול המוחהוון הגחוני (ventral midbrain).
- דיסוציאציה של רקמה עצבית ליצירת תגליsuspended של תאים בודדים.
- זריעה של נוירונים ראשוניים על כיסויי זכוכית (coverslips) והעברה לפלטה בעלת 24 בארות.
תוצאות עיקריות
- בידוד ותרבית מוצלחים של נוירונים דופמינרגיים ראשוניים.
- יישום מיקרוסקופיית אימונופלורסנציה לזיהוי נוירונים.
- הקמה של מודל in vitro מהימן לחקר ניוון עצבי.
- יישומים פוטנציאליים במחקר של מחלת פרקינסון.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק כלי בעל ערך לחקר נוירונים דופמינרגיים במוח האמצעי.
- הוא משפר את ההבנה של המנגנונים התאיים המעורבים בניוון עצבי.
- שיטה זו עשויה לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למחלת פרקינסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
בידוד מהימן ותרבית לטווח ארוך של נוירונים דופמינרגיים ראשוניים מהמזנצפלון מאפשרים חקירה מכניסטית של ניוון עצבי הרלוונטי למחלת הפרקינסון ולהפרעות קשורות. מערכת זו מספקת פלטפורמה רלוונטית פיזיולוגית לתיקוף מטרות, ניתוח מסלולים והפחתת סיכונים חזויה בתיקי גילוי מוקדם ומחקרים פרה-קליניים במדעי העצבים. תחזוקה יציבה של נוירונים אלו in vitro תומכת ברציפות תרגומית ובקידום מותאם סיכונים של תוכניות לטיפול נוירו-תרפויטי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של היפותזות טיפוליות בנוירונים דופמינרגיים הרלוונטיים למחלה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכנית על ידי מתן אפשרות למניפולציה ותצפית על הישרדות ודגנרציה של נוירונים.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדדים כמותיים ומורפולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת עצבית מתוקפת לסריקת תרכובות ולפיתוח בדיקות פנוטיפיות.
- מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה באמצעות פרוטוקולי תרבית וזיהוי מותאמים.
- מספק פלטים כמותיים, כגון חיוניות תאים וצמיחת נוריטים, להערכה מהימנה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם ביולוגיה רלוונטית למחלה לצורך חקירה של ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי תמיכה בתחזוקה עצבית ארוכת טווח.
- מפחית סיכון תרגומי על ידי מידול היבטים מרכזיים של פגיעות והישרדות של נוירונים דופמינרגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו לתרבית נוירונים ראשוניים משתלבת ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קלני, ותומכת בתיקוף מטרות, זיהוי מועמדים תרופתיים ומחקרי מנגנונים במחקר על ניוון עצבי.
- ביולוגיה של גילוי: מסייע בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים בניוון של נוירונים דופמינרגיים.
- סריקה: מספק תרביות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה עבור מחקרי תרכובות והפרעות גנטיות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה כמותית של הישרדות נוירונים, מורפולוגיה וביטוי של סמנים.
- מחקר תרגומי: תומך בהלימה למנגנוני מחלה ובפיתוח סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור פרויקטים מגוונים בביולוגיה של מערכת העצבים ובניוון עצבי.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תרביות נוירונליות וזיהוין עבור תהליכי עבודה ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי אפשור תיקוף חסון בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעוד עדיפויות מותאם סיכון ובקידום נכסים של טיפולים עצביים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של דיסקציה עוברית ותרבית נוירונלית.
- נדרשת גישה למתקני תרבית רקמה סטריליים ולמיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין הצוותים לגבי פרוטוקולי הדיסקציה, הזריעה והזיהוי.
- התאמה לסוגי תאי עצב אחרים או למינים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- חיוניות התאים והצלחת התרבית תלויות מאוד בתזמון ובטיפול מדויק.
