מעקב עכבר מח עצם המונוציטים In vivo
27 בפברואר 2015
מונוציטים הם מווסתים מרכזיים של חסינות מולדת וממלאים תפקיד קריטי בחידוש המערכת הפגוציטית החד-גרעינית ההיקפית ובמקרה של דלקת. כתב יד זה מתאר את הליך ההדמיה בזמן אמת של מח העצם של קלווריה של העכבר כדי לחקור את מנגנון הגיוס של המונוציטים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין סחר מונוציטים במח עצם הגולגולת של עכבר חי באמצעות הדמיית שני פוטונים. ראשית, העכבר מורדם ומזריקים לו תמיסה של ריקבון, רומין דקסטרן כדי לסמן את כלי הדם. לאחר מכן מניחים את העכבר בתמיכת מתכת מותאמת אישית, והקרקפת מהחלק האחורי של העצם הקודקודית לעצם הקדמית מוסרת.
לאחר מכן מורחים טבעת גומי ישירות על הגולגולת בעזרת דבק כירורגי והמאגרים מלאים במי מלח נוזליים. לבסוף, מיקרוסקופיה מרובת פוטונים משמשת למעקב אחר התפתחות תאים פלואורסצנטיים לאורך זמן בתוך מח עצם הגולגולת. אני זה יכול לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום האימונוהמטולוגיה, כגון מנגנון ניוד מונוציטים במצב יציב או לאחר כימותרפיה.
כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההתנהגות של מונוציטים מודולריים. ניתן ליישם אותו גם לחקר תת-קבוצות אחרות של תאי מח עצם בהתאם לספציפיות של מדווח השפעת בו נעשה שימוש. הפרוטוקול הבא משתמש במיקרוסקופ רב פוטונים יחד עם לייזר גביש ספיר טיטניום, ומאפנן הפעלה לבקרת כוח לייזר.
כדי לאפשר הקלטה בו-זמנית של שלושה ערוצים פלואורסצנטיים, התצורה צריכה לכלול שלושה גלאי סריקה חיצוניים שאינם DS או nds עם שילוב של מראות דיכרואיות של 565 ננומטר ו-690 ננומטר, מסנני מעביר פס של 565, 610 ננומטר ו-500,550 ננומטר, ומסנן מעביר קצר של 485. שים לב שבהגדרה זו, דור הרמוני שני או SHG וחלבון פלואורסצנטי ציאן או CFP מזוהים על ידי ה-NDD לאחר מסנן המעבר הקצר 485. CFP מזוהה גם על ידי ה-NDD.
לאחר מסנן המעבר של 500 550 פס ורוד דומין, דקסטרן מזוהה על ידי ה-NDD. לאחר מסנן מעבר פס 565 610, מספר שעות לפני ההדמיה הגדירו את תא החימום ל-32 מעלות צלזיוס. טמפרטורה זו תשמור על העכבר בטמפרטורת גוף אופטימלית לאורך כל הניסוי.
שימו לב שתא החימום המשמש כאן חשוך ומכסה את המטרות והצלחת הממונעת של המערכת. זה עוזר למנוע זיהום אור חיצוני. כדי להפעיל את המערכת תחילה, הפעל את לייזר ספיר הטיטניום, ולאחר מכן הפעל את שאר מערכת המיקרוסקופ.
הפעל את תוכנת הרכישה. כאן נעשה שימוש בתוכנת Zeiss Zen. הגדר את טווח אורכי הגל של הלייזר ל-870 ננומטר.
לאחר מכן בחר את ה- NDD המתאים להקלטה. העכבר ששימש בניסוי זה הוא עכבר טרנסגני בשם Mac blue, המבטא חלבון פלואורסצנטי ציאן תחת שליטת מקדם הקולטן האחד CSF. שיטת ההרדמה המומלצת תלויה באורך ההדמיה, ולכן עדיף לעיין במסמך הנלווה לפרטים.
היבט קשה בהליך זה הוא הזרקת וריד T, מכיוון שקל למדי לפספס את הווריד. אם זה קורה, בצע במקום זאת הזרקה רטרואורביטלית. לאחר הרדמת העכבר, השתמש בציפורניים כדי לבדוק אם יש חוסר הכרה על ידי גירוי כרית כף הרגל. הבא.
כדי להכתים את כלי הדם יש להזריק 200 מיקרוליטר של מוט דומין דקסטרן לווריד הזנב, או לצביעה של נויטרופילים. הזרקו 100 מיקרוליטר מי מלח המכילים LY שישה GPE. לאחר ההזרקה, הניחו את ראש העכבר בין לוחות השמירה של מחזיק סטריאוטקטי בהתאמה אישית המותאם למיקרוסקופ ולמשאף גז ההרדמה.
זה מבטיח שתנועות הנשימה לא ישפיעו על ההדמיה. הדק את לוחות השמירה כדי למתוח את העור בין האוזניים לראש. בדוק את היציבות.
על ידי לחיצה עדינה על הראש עם ציפורניים, הראש לא אמור לזוז. לאחר מכן ודא שהחיה נושמת כרגיל. כדי להכין את העכבר להדמיית שני פוטונים, השתמש באצבע כדי למרוח 70% אתנול על שיער הקרקפת, תוך הקפדה להימנע מהעיניים.
לאחר מכן הניחו וילון עם גזרה כדי לחשוף את הקרקפת. לאחר מכן, בעזרת מספריים וציפורניים סטריליות, חותכים את העור ומסירים לחלוטין את הקרקפת מהחלק האחורי של העצם הקודקודית לעצם הקדמית. יש לשמור על מרחק של שלושה מילימטרים מהעיניים והאוזניים כדי למנוע דימום נרחב.
הסר את רקמת החיבור הרופפת או הפריאוסטאום המכסה את הגולגולת. לאחר מכן בעזרת מגבת נייר ספוגה PBS חמה, שטפו את השיער שנותר כפי שמוצג כאן. בעזרת מחט קטנה יש למרוח דבק כירורגי על כל ההיקף של טבעת גומי בקוטר 10 מילימטר.
לאחר מכן הניחו את טבעת הגומי ישירות על הגולגולת בעזרת מגבת נייר ספוגה PBS נוספת. נקה את החלק הפנימי של הטבעת בפעם האחרונה. הוסף PBS חם כדי לטבול לחלוטין את הגולגולת.
לאחר מכן הנח את המחזיק הסטריאוטקטי מתחת למטרה. לאחר שהעכבר נמצא במקומו, השתמש במיקרוסקופ העין עם שידור ישיר כדי לראות את הגולגולת ולמקם אותה בערך בשדה הראייה של המיקרוסקופ. בפינה השמאלית העליונה של חלון תוכנת ההדמיה, לחץ על רכישה חיה.
סריקה חיה של הרקמה תופיע באמצע החלון באמצעות בקרת כיוון המיקרוסקופ בתוכנה. אתר אזור עם אות CFP ומוט דומין כדי להתאים את המיקוד. לאחר מכן הגדר את עוצמת הלייזר למינימום כדי להשיג את יחס האות לרעש הטוב ביותר עם נזק צילום מינימלי
.לאחר מכן בתוכנה, לחץ על לשונית הערוץ והגדל את כוח הרווח על ה-PMTs עבור כל NDD כדי להפחית את הלבנת התמונות ונזקי הצילום, ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה המתאימה כדי להגדיר את הגדרות הרכישה לסריקה בודדת עם זמן שהיית פיקסלים של 1.58 מיקרו-שניות ורזולוציה של 512 על 512 פיקסלים עם הגדלה של 1.5. לאחר הגדרת פרמטרי ההקלטה, לחץ על פקודת הרכישה החיה וסקור את הרקמה כדי לבחור שדה x, y, Z רצוי לניטור בזמן אמת. כאן נבחר שדה הכולל גם אזורי כלי דם וגם פרנכימליים.
לאחר מכן כדי לשמור או לרשום את הקואורדינטות X, Y, Z של השדה המוצג בלשונית המיקומים. לחץ על הוסף. חזור על תהליך זה עם עד שלושה שדות נוספים כדי לרשום את כל הקואורדינטות המעניינות.
הקואורדינטות יופיעו בלשונית המיקומים שליד כדי להורות לתוכנה. כדי לצלם ערימה של שלוש תמונות DZ, לחץ על העבר ללשונית המיקומים בתוכנה כדי לעבור למיקום הרשום הראשון ובחר Zack בתיבה השמאלית העליונה של התוכנה. פעולה זו תפתח את לשונית ערימת Z, תעבור למצב Z הגבוה ביותר ותכוונן את עוצמת הלייזר בהתאם.
לחץ על הגדר אחרון ואז עבור למיקום העמוק ביותר. כוונן את עוצמת הלייזר. לאחר מכן לחץ על הגדר תחילה.
יש להתאים את עובי ניתוח הערימה לתא שנחקר במהירות. תאים נעים ייצאו מהצרפתית במהירות, כך שתצטרך לרכוש ערימה עבה יותר. ואז אתה רוכש עבור תאים הנעים לאט.
בתיבה הימנית העליונה, בחר את הפקודה סדרת זמנים כדי לפתוח את הכרטיסיה סדרות זמן. הגדר את מספר המחזורים ואת מרווח הזמן. כאן, כרך אחד יירכש כל 30 שניות למשך 60 מחזורים.
זה מייצג 30 דקות בזמן אמת. כדי להתחיל בהדמיית זמן-lapse בחלון הראשי, בחר התחל ניסוי לאורך כל ההליך, המשך לעקוב אחר החיה כדי לוודא שהיא מחוסרת הכרה. כמו כן, ודא שהמטרה שקועה כראוי.
לאחר לכידת הרצף, השתמש בפיפטה כדי להוסיף PBS חם. לאחר מכן התחל רכישה שנייה של 30 דקות. אם נראית היעלמות מתקדמת של האות במהלך הרכישה, בדוק אם יש דליפת PBS.
לאחר הקלטת כל הסרטונים הנדרשים, בוצע ניתוח נתונים כמתואר במסמך הנלווה כדי לחקור את הפיזיולוגיה של מח העצם על ידי הדמיה תוך-חיונית, הוזרק לעכבר טרנסגני כחול מק 2 מיליון דקסטרן דומין מוט דלטון, וצולם על ידי שני מיקרוסקופ סריקת לייזר פוטון. כפי שמודגם בסרטון זה, במיקרוגרף שנוצר, כלי הדם המוכתמים ב-2 מיליון דקסטרן דומין מוט דלטון מוצג בעצם אדומה, מוצג בכחול ומוצג על ידי דור הרמוני שני. מונוציטים חיוביים ECFP המוצגים בציאן ממוקמים בתוך נישות פרנכימליות, הנראות כאזורים כהים בין כלי הדם לעצם, ובתוך כלי הדם.
כדי לחשב את מסלול התא הבודד, בוצעה הדמיית זמן-lapse. סרטון זה מציג את התנהגות הנדידה של מונוציטים פרנכימליים. אות ECFP הוא בציאן ומסלולי נדידה עבור כל נקודה אדומה מופיעים בירוק.
כאן ניתן לראות את התנהגות הנדידה של מונוציטים וסקולריים. ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי לחשב הן את המהירות הממוצעת והן את התזוזה הריבועית הממוצעת של התאים. שימו לב שהמונוציטים של כלי הדם מציגים גם תזוזה מוגברת וגם מהירות מוגברת בהשוואה למונוציטים פרנכימליים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעקוב אחר מונוציטים של מח עצם עכבר in vivo באמצעות שתי הדמיות תמונות לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור נדידת תאים ואינטראקציה במח העצם, המייצגים אתר חשוב מאוד של המטופואיזה, אך גם פונקציות בסיסיות אחרות כגון תחול אנטיגן וזיכרון חיסוני.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בהדמיה של נדידת מונוציטים במחול השריג של עצם הגולגולת בעכבר חי באמצעות דימוי דו-פוטוני. הפרוצדורה נועדה להגיר את המכניזמים של גיוס מונוציטים במצב יציב ואחרי כימותרפיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של מחית השומח
- טכניקות דימות in vivo
רקע
- מונוציטים חיוניים עבור מערכת החיסון המולדת.
- הם ממלאים תפקיד משמעותי בחידוש המערכת הפגוציטית מונונוקליארית הפריפריאלית.
- הבנת הגיוס שלהם חיונית במהלך דלקת.
- דימיון בזמן אמת יכול לספק תובנות לגבי תהליכים אלה.
מטרת המחקר
- להדמיות של הגירה של מונוציטים במחית העצם של גולגולת העכבר.
- לחקר מנגנוני הגיוי (mobilization) של מונוציטים.
- לבחינת שינויים בהתנהגות מונוציטים לאחר כימותרפיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמת עכבר וסימון כלי דם באמצעות rot, rumine dextran.
- הסרת קרקפת מאזור העצם הפריאטלית עד העצם הפרונטלית.
- החלת טבעת גומי על הגולגולת באמצעות דבק כירורגי.
- מיקרוסקופיה רב-פוטונית למעקב אחר תאים פלואורסצנטיים לאורך זמן.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של תנועת מונוציטים בזמן אמת.
- תובנות לגבי מנגנוני הגיוס במצב בסיסי (steady state).
- השפעות פוטנציאליות של כימותרפיה על התנהגות המונוציטים.
- תרומה לתחום האימונוהמתולוגיה.
מסקנות
- הפרוצדורה מדגימה ביעילות את הדינמיקה של מונוציטים in vivo.
- הממצאים עשויים לשפר את ההבנה של תגובות חיסוניות.
- דימוי בזמן אמת הוא כלי בעל ערך למחקר עתידי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
דימות רב-פוטוני בזמן אמת של מונוציטים במח העצם מאפשר ויזואליזציה ישירה של תנועת תאי מערכת החיסון והאינטראקציות ביניהם בתוך סביבה תלת-ממדית רלוונטית פיזיולוגית. יכולת זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובביטחון ניבוי בשלב תיקוף המטרה, ומספקת מידע לקבלת החלטות מוקדמות לגבי תיקי פיתוח במחקרי אימונולוגיה ודלקת. מעקב כמותי אחר דינמיקת המונוציטים מספק תובנות שמישמות להמשכיות תרגומית, משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של מנגנוני הגירה של מונוציטים בתנאי מצב יציב (steady-state) ובתנאי דלקת.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות ספציפיות למערכת המיאלואידית באמצעות דימוג כמותי in vivo.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי הבהרת נתיבי הגירה ואינטראקציות של תאים.
- מספק ביטחון חזוי לבחירת מטרות בתוכניות של מודולציה חיסונית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מקיים מערכות דימוי in vivo מתוקפות להערכה של תרכובות בשלבים מאוחרים יותר.
- מספק תוצאות כמותיות הדירות של מדדי ניידות ותגשומות של תאים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה עבור מחקרים השוואתיים בין מודלים של מחלות.
- מאפשר זרימות עבודה של דימוי הניתנות להרחבה וניתנות להתאמה לסמנים פלואורסצנטיים נוספים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים לתנועת תאי חיסון וחדירתם הרלוונטיים למחלה.
- מספקת רצף מתובנות מכניסטיות בשלב הגילוי ועד לפיתוח סמנים ביולוגיים (biomarkers) פרה-קליניים.
- מסייעת בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים באמצעות כימות תגובות תאיות להפרעות.
- תומכת בזיהוי סמנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות תוצרי מעקב תאי בזמן אמת.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטת דימוי זו in vivo מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-היפותזה של דינמיקת תאי מערכת החיסון בסביבות רקמה טבעיות.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את נדירת המונוציטים ואת האינטראקציה ביניהם כדי להבהיר את תפקוד תאיים חיסוניים ונתיבי תנועה.
- סריקה: מספק פלטים של דימוי סטנדרטיים הניתנים לשחזור להערכת השפעות של תרכובות על ניידות תאים.
- אנליטיקה: מייצר מדדים כמותיים כגון מהירות ממוצעת והעתקה להשוואה סטטיסטית איתנה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים למודלים רלוונטיים למחלה ואסטרטגיות של סמני ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לתתי-אוכלוסיות אחרות של תאי מוח עצם ולדיווחים פלואורסצנטיים להשפעה רחבה יותר על פורטפוליו המחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תנועת תאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה של דימות סטנדרטיים וניתנים להרחבה, עם פלטים כמותיים הניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go ותיעדוף יעיל של משאבים בתוכניות למודולציה של מערכת החיסון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים ובהעברת ידע בין תוכניות שונות במחקר ופיתוח בתחום האימונולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה רב-פוטונית ובטכניקות דימות in vivo.
- דורש מיכשור מיוחד, כולל גלאים רב-ערוציים ובקרת טמפרטורה מדויקת.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי דימות ותהליכי ניתוח נתונים בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למסמנים פלואורסצנטיים שונים עבור תתי-אוכלוסיות של תאים, מה שמעניק גמישות לדגם.
- עומק הדימות ויציבות האות עלולים להגביל את התפוקה ולדרוש אופטימיזציה עבור יישומים ספציפיים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Imaging System Setup
3:24
Preparation of the Mouse
4:55
Immersion System Setup
6:22
Two-photon Imaging Acquisition Setup
9:09
Image Acquisition and Monitoring
9:56
Representative 2-photon Imaging of Parenchymal and Vascular Monocytes
11:27
Conclusion
