Name: מעקב עכבר מח עצם המונוציטים In vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: למדו לעקוב אחר תנועת מונוציטים במוח העצם של עכברים חיים באמצעות דימות שני-פוטוני. שיטה זו חושפת מנגנוני מוביליזציה במצב יציב ולאחר כימותרפיה, ומסייעת להבנת תגובות חיסוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות אן Daron ופייר לואי Loyher עבור עריכה סיוע, Plateforme Imagerie Pitié-סלפטרייר (PICPS) לקבלת סיוע במיקרוסקופ שני הפוטונים ומתקן בעלי החיים &quot;NAC&quot; וקמיל Baudesson לעכברי רביית סיוע. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7 / 2007-2013) תחת הסכם מענק n ° 304,810 - פשיטות, וn ° 241,440-Endostem, מINSERM, מהאוניברסיטה לפירית et מארי קירי &quot;צמיחה &quot;, מla&quot; ליגת העל contre le סרטן &quot;, מתוך&quot; אגודת pour la משוכלל ונדיר sur le סרטן &quot;ומ-&quot; סוכנות הידיעות הלאומית דה לה משוכלל ונדיר &quot;צמיחת תכנית 2012 (ANR-אמה-050). PH נתמכה על ידי la &quot;ליגת העל contre le סרטן&quot;.

הערה: כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לניסויים בבע&quot;ח והאתיקה הצרפתית ומאומתים על ידי &quot;הגנת שירות et סנטה Animales, Environnement&quot; עם מספר-75-2065. גודל מדגם נבחרים כדי להבטיח שחזור של הניסויים, ובהתאם ל3R של רגולציה אתיקה של בעלי החיים. 1. הכנת העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלחוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקופה קצרה של הדמיה (שעות פחות מ 1), לטשטש את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 200 μl של תמיסת מלח המכילה קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) וXylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לתקופה ארוכה יותר של הדמיה (עד 4 שעות), לטשטש את העכבר עם שאיפה של 2.5% isoflurane מתאדה בתערובת 70/30 של O 2 / N 2 O, דרך מסכה מותאמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: בדרך זו מספקת לחוסר הכרה יציבה יותר ותמנע זריקת intraperitoneal סדרתי של תרופות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא הרדים, לבדוק חוסר הכרה באמצעות גירוי של כרית כף הרגל עם מצבטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת כלי דם / כתמים נוספים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים כלי דם: להזריק לוריד בוריד הזנב, 200 μl של Rhodamin-Dextran (2 מד&quot;א, 10 מ&quot;ג / מיליליטר במאגר מלוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים נויטרופילים: להזריק 2 מיקרוגרם של Ly6G-PE (שיבוט 1A8) בתמיסת מלח לוריד בוריד הזנב 100 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקיבוע, השתמש בעל stereotactic מותאמת אישית המותאם למיקרוסקופ ולמכשיר אינהלציה גז ההרדמה. הערה: בעל sterotactic היא תמיכת מתכת עם שני סוגריים לוחית מתכת, אחד להיות קבוע ונשלפים וישימה אחרים, להדק את ראשו של בעל החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את הראש של העכבר בין לוחות התמך כדי להבטיח בידוד מתנועות נשימה. הדק את האוזניים בין צלחות וראש למתוח את sk שמירהב. בדקו יציבות ורווחה נשימה של בעלי החיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרקפת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בזהירות אתנול 70% להרטיב את השיער של הקרקפת עם המוליך סטרילי, הימנעות ממגע עם העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור עם מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר באופן מלא את הקרקפת מאחורה של העצם הקודקודית לעצם הקדמי. הרחק עד 3 מ&quot;מ מעיניים ואוזניים למניעת דימום נרחב. הסר את רקמת חיבור הרופפת המכסה את הגולגולת (קרום עצם). לשטוף את השיער שנשאר עם מגבת נייר ספוג-PBS חם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת טבילה להגדיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבק טבעת גומי בקוטר 18 מ&quot;מ עם דבק כירורגים ישירות על הגולגולת באמצעות מחט מד קטנה לשלוט הפצה. מדביק את כל הפריפריה של טבעת הגומי כדי למנוע דליפה (30 μl צריך להיות מספיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הגולגולת מתחת לזירה בפעם האחרונה עם מגבת נייר ספוג-PBS ולאחר מכן להוסיף 37 ° C PBS לטבילה של שלמהגולגולת. הוסף ירידה של 0.9% NaCl פתרון או משחת עיניים ספציפי בכל עין של העכבר, כדי למנוע יובש בעיניים. גרור את בעל stereotactic תחת המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ למקם את השדה באמצעות עינית המיקרוסקופ באמצעות העברת ישירה. </li></ol></li></ol> 2. רכישת הדמיה שני פוטונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ multiphoton יחד עם Ti: לייזר גביש ספיר, המספק פולסים 140fs של אור NIR, באופן סלקטיבי מתכונן מ -680, ל- 1,080 ננומטר, ומאפנן acousto אופטי לבקרת כוח הלייזר. השתמש בתצורה כולל 3 גלאים חיצוניים-descanned שאינו (NDD) (המאפשרים הקלטה בו זמנית של 3 ערוצי ניאון) עם שילוב של 2 מראות dichroic (565 ננומטר ו690 ננומטר), 565/610 500/550 ומסנני bandpass, ו 485 מסנן קצר לעבור, עם Apochromat תכנית × 20 (NA = 1) מטרת טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תא החימום כדי לאפשר homeothermy הטוב של anaesעכבר thetized., הערה: טמפרטורה עשויה להיות מוגדרת 1 שעה לפני פגישת ההדמיה ליציבות טובה יותר. במקרה שלנו, 32 ° C נבחר כדי לקבל את טמפרטורת גוף אופטימלית של העכבר המורדם (36-37 ° C) ומתוחזק עד 4 שעות. טמפרטורה זו עשויה להיות מותאמת למערכת בשימוש (בדיקה דיגיטלית יכולה לשמש כדי לבדוק נקודה זו). בנוסף, תא החימום משמש הוא כהה / שחור ומכסה חלק מהמערכת (היעדים וצלחת ממונעת), כדי למנוע זיהום אור חיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את טי: ספיר הלייזר, ולאחר מכן מערכת מיקרוסקופ כולה. הפעל את תוכנת הרכישה. הגדר את טווח אורך גל לייזר 870 ננומטר. בחר NDD המתאים להקלטה. הערה: במקרה שלנו, דור שני הרמוני (SHG) 19 וחלבון ציאן ניאון (ECFP) מזוהים על ידי NDD לאחר לעבור סינון קצר 485. ECFP גם זוהה על ידי NDD לאחר מסנן 500/550 bandpass וrhodamin-dextran הוא זוהה על ידי tהוא NDD לאחר מסנן 565/610 bandpass. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקודת ההדמיה &quot;רכישה חי&quot; של התוכנה והשימוש בשליטה כיוונית מיקרוסקופ, לשנות את הפוקוס על אזור עם אות ECFP וRhodamine. הגדר את כוח הלייזר עד למינימום כדי להשיג יחס אות לרעש הטוב ביותר עם תמונה-נזק מינימאלי. הערה: הגדרת ההספק משמשת משתנה בהתאם לעומק של האזור של עניין. בדרך כלל הגדרות AOM מוגדרות כ -20%, המייצג את כוח לייזר מעבר למטרה כ -15 מילי-ואט. עדיף להגדיל את הכח הרווח על PMTs לכל NDD להפחית צילום הלבנה וצילום נזק. הגדרות רכישה אופייניות הן סריקה יחידה עם פיקסל להתעכב זמן של 1.58 מייקרו-שני, ורזולוציה של 512 x 512 פיקסלים עם הגדלה של 1.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורים נבחרים של ריבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פרמטרים הקלטה נקבעים, להשתמש בו שוב את פקודת הרכישה &quot;חי&quot;,ותסקור את הרקמה לבחור (x, y, z) שדה רצוי להיות במעקב בזמן אמת. הערה: בדרך כלל, בחרנו שדה כולל שני כלי דם ובאזורי parenchymal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשם השדה עם פקודת התוכנה &quot;עמדה&quot;. הערה: פקודה זו משננת x, y, z קואורדינטות של שדות רחוקים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהירשם תחומים נוספים של ריבית (עד 3) באותו האופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר Z- מחסנית 3D עם פקודת התוכנה &quot;Z- המחסנית&quot; על העמדה שיננה הראשונה בהתאם להיקף הנדרש עם הגדלה בחרה. לשנן עמדה עמוקה ראשונה, ולאחר מכן המיקום הגבוה ביותר. לנרמל כוח לייזר עם העומק. הערה: להדמית שדה הנלווה מרובה, אנו רוכשים 5 פרוסות מופרדות על ידי z-שלבי 3 מיקרומטר עבור כל שדה לרכישה בהיקף של 12 מיקרומטר עובי. הגדרות אלה עשויות להיות מותאמות לסוג של תא למד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת השקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר220; זמן סדרה &quot;פקודת התוכנה ולבחור את משך הזמן של מרווח זמן ומספר המחזורים. בגין הזמן לשגות הדמיה לפי הזמן לשגות ומשך הזמן הנדרש על ידי בחירת &quot;להתחיל ניסוי&quot; פקודת התוכנה. הערה: במקרה שלנו, אנו רוכשים כרך אחד כל שנייה 30 במהלך 60 מחזורים מייצגים בזמן אמת 30 דקות. זמן לשגות קטן יותר ניתן לבצע כדי לעקוב אחר גלגול תא מהיר בכלי הדם. במקרה זה-ערימת z דקה יותר ולא יותר מ -2 תחומים שונים ניתן להקליט באותו הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב שוטף אחר להגדיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לפקח על בעלי החיים כדי לוודא שהוא מחוסר הכרה. הערה: טלטול של שפם או רגליו של בעל החיים הן אינדיקטורים של תחייה. במקרה הנשימה של בעלי החיים היא קופצנית, כמות isoflurane יכולה להיות מופחתת במקצת. להיסחף רקמה חזקה במהלך הרכישה הוא אינדיקטור של תחיית עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא המטרה הוא שקוע כראוי. לחדש 37 ° C betwee PBSn שתי רכישות (30 דקות). הערה: היעלמות מתקדמת של אות במהלך הרכישה היא אינדיקטור של דליפת PBS. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיומו של הליך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שקטעי הווידאו הנדרש נרשמים, להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם במהירות לפני ההחייאה. הערה: ריפוי פצעים מוביל להיווצרות של גלד ב -24 עד 48 שעות המגבילה את האפשרות לבצע הדמיה אורך. </li></ol></li></ol> ניתוח 3. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון דריפט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת Imaris Bitplane למעקב אוטומטי 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה ברצף 3D על Imaris. בחר &quot;נקודה&quot; הפקודה, וליצור מעקב ידני (לחיצת עכבר + shift) לכל נקודות הזמן למינימום של 4 נקודות עיגון שונות, במידת האפשר מופץ בצורה הומוגנית בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל התיקון להיסחף באמצעות הפקודה &quot;להיסחף נכון&quot; בכרטיסייה &quot;מסלול עריכה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק עבור tהוא האיכות של התיקון בx, y ובמיוחד בz כדי למנוע התלבטויות artefactual. הערה: אם התיקון אינו משביע רצון, לנסות נקודות עיגון אחרות או להוציא וידאו מהניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;להוסיף כתמים חדשים&quot; הפקודה ובחר &quot;כתמי מסלול לאורך הזמן&quot; הגדרת אלגוריתם. עבור לצעד הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הליך מעקב תא אוטומטי או על כל הערוץ של עניין באמצעות פקודת &quot;ערוץ המקור&quot;. קוטר אובייקטי סט (כלומר, תאים) עד 10 מיקרומטר. עבור לצעד הבא. הערה: הבחירה תהיה תלויה בהבחנה בין אובייקטים וספציפיות של האות הנמדדת. בקיצור, מעקב אוטומטי על כל הערוץ אפשרי רק אם האות זוהתה היא ספציפית לאובייקט של עניין. מכיוון שגם SHG וECFP מזוהים על ידי NDD לאחר מסנן 485 לעבור קצר, מעקב יהיה יותר ספציפי ויעיל באמצעות אות ECFP נרשמה על ידי NDD לאחר 500/550 מסנני bandpass. אשכול או אובייקטים צפופים, ידרשו בחירה ידנית של אובייקטים בודדים דומים לצעד 3.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג מסנן &quot;איכות&quot;, לקבוע את הסף להוציא מעקב של אובייקטים נוקבים. עבור לצעד הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;בראונית האלגוריתם Motion&quot; עם פרמטרים מדויקים של &quot;מרחק מקס&quot; ו- &quot;גודל פער&quot; בין שתי נקודות. לאמת דור מסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמסלולים מחושבים באופן אוטומטי, בחר סוג המסנן &quot;משך מסלול&quot;, לקבוע את הסף לחסל מסלולים קצרים יותר מ -120 שניות (המייצגות את 4 נקודות זמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חובה: אחרי מעקב אוטומטי, לבדוק את האיכות של השירים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוש על סרגל הזמן כדי לבדוק שחפצי מעקב נתיבי המסלול. אם לא, השתמש באפשרויות של תיקון נקודת מסלול הזמינות בכרטיסייה &quot;ערוך&quot;: מחיקת שירים כוזבים או לא תקינים עם &quot;למחוק&quot; הפקודה (למחוק את כל p מסלולoint בנפרד באמצעות פקודת &quot;ניתוק&quot;). אם נתיב מסלול הוא רציף, להוסיף נקודות חסרות זמן (לחיצת עכבר + shift), לבחור את כל הנקודות במסלול מסוים, ולהשתמש &quot;להתחבר&quot; הפקודה בכרטיסייה &quot;מסלול עריכה&quot;. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;הסטטיסטיקה&quot; בפקודה &quot;העדפות&quot;, לבחור את הפרמטרים הדינמיים של עניין ברשימה. בחר &quot;לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים לקובץ&quot; הפקודה ולשמור את קובץ Excel שנוצר. הערה: פרמטרים דינמיים כמה ישירות מתקבלים מהתוכנה כגון אורכי מסלול, מהירות רגעית, מהירות ממוצעת, ולעקוב אחר יושר. מקדם תנועתיות 6, 20 ניתן לקבוע אך אינו מסופקים ישירות על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תא, לחשב את הממוצע של ההתקות לכל תקופת זמן (אורך יממה) (לסרט הזמן לשגות 30 שניות, אורך היממה תהיה 30, 60, 90 שניות, וכו &#39;).עלילה המרושעת של העקירה רבועה כפונקציה של מרווח הזמן. להשיג מקדם תנועתיות ידי חישוב השיפוע של חלק הליניארי של העקומה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).</li>
<li>Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages+regulate+immunity+through+dynamic+networks+of+survival+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death.</a> J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19, 71-82 (2003).</li>
<li>Robbins, C. S., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+roles+of+monocyte+subsets+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+and+progenitor+cells+induce+monocyte+emigration+in+response+to+circulating+toll-like+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands.</a> Immunity. 34, 590-601 (2011).</li>
<li>Jacquelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+reduces+Ly6Chigh-monocyte+motility+within+and+release+from+the+bone+marrow+after+chemotherapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice.</a> Blood. 122, 674-683 (2013).</li>
<li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
<li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).</li>
<li>Milo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+reveals+promiscuous+crosspresentation+of+blood-borne+antigens+to+naive+CD8%2B+T+cells+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow.</a> 122, 193-208 (2013).</li>
<li>Cavanagh, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+bone+marrow-resident+memory+T+cells+by+circulating%2C+antigen-bearing+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells.</a> Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J Exp Med. 188, 465-474 (1998).</li>
<li>Rashidi, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+mouse+bone+marrow+reveals+differential+niche+engagement+by+quiescent+and+naturally+activated+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells.</a> Blood. , (2014).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Yost, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+neutrophil+extracellular+trap+%28NET%29+formation%3A+a+novel+innate+immune+deficiency+of+human+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates.</a> Blood. 113, 6419-6427 (2009).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nat Med. 19, 107-112 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

נקודות הקריטיות של in vivo מתודולוגיה ההדמיה הן להבטיח את היציבות של המיקוד במטרה למקסם את משך הזמן של הדמיה וכדי למזער את סיכון לזיהום חיידקים ודלקות, אשר עשוי להשפיע על הדינמיקה של תאי הדלקת. הדמיה של מוח עצם גולגולת כדלקמן מטרות אלה כניתוח שבוצע כדי לקבל גישה למח העצם הוא מינימאלי. השימוש בחומר החיטוי וסטרילי הוא חיוני כדי להגביל את הסיכון לזיהום שעלול לגרום להפרעות בהומאוסטזיס תא. <p class="jove_content" style=";text-...

מח העצם ממלא תפקיד מרכזי בהמטופואיזיס ומייצג את המאגר העיקרי של מונוציטים המסתובבים מחדש באופן מכונן בין הדם לפרנכימה המדולרית, מחדשים את מאגר המונוציטים במחזור עם תוחלת חיים קצרה 2,3 ומשתתפים בבנייה מחדש של רקמות המצב היציב - מקרופאגים ותאים דנדריטיים 4. במהלך דלקת או לאחר אפלזיה חולפת, מונוציטים מגויסים באופן פעיל ממח העצם או מהטחול 5, 6, 7 ומתיישבים באיברים דלקתיים. מספר צירים כימואטרקטיביים היו מעורבים בתהליך גיוס תאים מיאלואידים ממח העצם 8, 5, 6,9. מעבר לתא המיאלואידי, מח העצם הוא גם אתר חשוב של תחול לימפוציטים מסוג T 10 ונישה של זיכרון חיסוני 11,12. לפיכך, רקמה זו מרכזית למחקרים רבים בתחום ההמטולוגיה והאימונולוגיה. הידע שלנו על הארגון המבני של תאים מיאלואידים מדולריים נובע בעיקר מניתוח חתך היסטולוגי של רקמות קבועות 13. מבט סטטי זה אינו מאפשר לחקור את דינמיקת חילופי התאים בין המדורים השונים של מח העצם, שהיא הבסיס לפעילותו התפקודית.
הדמיה תוך-חיונית מהווה קלט ביולוגי חשוב בחקר ניידות התאים, היצמדות התאים ואינטראקציות בין תאים, שתוארו בעבר רק ממערכות מבחנה. האתגרים הטכניים להדמיה תוך-חיונית נכונה כוללים את היכולת להגיע לרקמה המעניינת מנקודת מבט אופטית, ולמקסם את בידודה מסחיפה פיזיולוגית (נשימה, שרירים או התכווצויות פריסטלטיות) או מכניות (שיבוש והארכת רקמות לאחר ניתוח, וחשיפה למיקרוסקופ כמו גם הפרעות טמפרטורה וכלי דם/חמצון). סחיפות מיקרוסקופיות עשויות להגביל את היכולת לשמור על המיקוד לאורך זמן ועלולות להכניס ארטיפקטים לכימות תנועתיות התאים. חלופה אחת, שתוקפה עבור מספר רקמות כדי להפחית את הקשיים הטכניים הללו, היא לעבוד על רקמה מושתלת שהודגרה בתווך תרמוסט ומחומצן; עם זאת, הפרעה מוחלטת של זרימת הלימפה וכלי הדם עלולה להיות בעייתית. להדמיה תוך-חיונית של מח עצם הגולגולת יש מספר יתרונות בנושאים אלה. ראשית, זה דורש פעולה כירורגית מינימלית. שנית, עובי העצם באזור זה מאפשר הדמיה ישירה של נישות מח עצם ללא שחיקה, ובכך מפחית הפרעות פיזיולוגיות. ניתן לדמות את הרשת המדולרית באזור הפרסגיטלי של העצם; עם זאת, הסינוסואידים נראים יותר באזור הפרונטו-פריאטלי שבו מטריצת העצם דקה יותר12,14. 
הדמיה תוך-חיונית מסתמכת על הזמינות של המדווח הפלואורסצנטי המדויק ביותר המתייג את האוכלוסייה המעניינת. תיוג במבחנה של אוכלוסיית תאים מטוהרים לפני העברה מאמצת הוביל לאפיון חשוב של נישות תאי גזע המטופויאטיות 15 או מיקרו-דומיינים אנדותליים של מח עצם המעדיפים השתלת גידול 16, וסיפק מספר תשומות בסיסיות על מושגי מפתח באימונולוגיה 17. עם זאת, גישה זו דורשת בדרך כלל מאות אלפי תאים כדי לקבל הזדמנות לזהות אותם לאחר מכן in vivo. ניתן להסביר זאת על ידי שיעור התמותה הגבוה לאחר הצביעה, הדילול בכל הגוף והשינוי במצב ההפעלה, מה שעלול להוביל לביות מוטה. תיוג אנדוגני ממערכת עכברים טרנסגנית מתגבר במידה רבה על מגבלות אלה ואיפשר לדמות את ההתנהגות של אוסטאובלסטים אנדוגניים 8, מגקריוציטים 18 או תת-קבוצות שושלת מיאלואיד 6. עם זאת, יש להיות זהירים כאשר בוחנים את הספציפיות של המדווח הפלואורסצנטי בקרב תת-הקבוצה הנחקרת. 
ה-Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, הנקרא עכבר MacBlue 1, הוא מערכת טרנסגנית רבת ערך לחקר מונוציטים מדולריים עם הדמיה בזמן אמת 6. הזרקה תוך ורידית של רודמין-דקסטרן במשקל מולקולרי גבוה מבדילה את הפרנכימה המדולרית מרשת הסינוסואידים של כלי הדם של מח העצם. באמצעות גישה זו, ניתן לעקוב אחר התנהגות המונוציטים בתאים המדולריים השונים בהקשר פיזיופתולוגי ספציפי של עניין. יתר על כן, אנו מציעים אסטרטגיה נוספת להשוואת דינמיקת מונוציטים לזו של נויטרופילים באמצעות תיוג in vivo באמצעות נוגדן ספציפי.

<table><tbody><tr><td>קטמין</td><td>מריאל</td><td></td><td>100 מ"ג/מ"ל, חומר הרדמה</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>Bayer HealthCare</td><td></td><td>10 מ"ג/מ"ל, חומר הרדמה</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>בקסטר</td><td></td><td>2.5%, חומר הרדמה</td></tr><tr><td>O2/NO2</td><td></td><td></td><td>70/30, חומר הרדמה</td></tr><tr><td>רודמין-דקסטרן</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2 MDa, 10 מ"ג/מ"ל, צביעת כלי דם</td></tr><tr><td>Ly6G-PE</td> שיבוט <td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>1A8, מכתים נויטרופילים</td></tr><tr><td>מחזיק סטריאוטקטי ניתוח</td><td>ביתי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול 70%</td><td></td><td></td> <td>ניתוח</td></tr><tr><td>מספריים וציפורניים</td><td></td><td></td> סטריליות <td>טבעת</td></tr><tr><td></td><td></td><td>גומי</td><td>בקוטר 18 מ"מ, ניתוח</td></tr><tr><td>Glubran 2</td><td>Queryo דבק כירורגי רפואי</td><td></td><td>, קיבוע טבעת גומי</td></tr><tr><td>מחטי מד קטן</td><td>ניתוח</td><td>טרומו</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 NLO מיקרוסקופ מולטיפוטון&nbsp;</td><td>מיקרוסקופ</td> <td>קרל זייס</td><td></td></tr><tr><td>Ti:לייזר קריסטל ספיר&nbsp;</td><td>קוהרנטי זיקית אולטרה</td><td></td><td>140 fsec פולסים של אור NIR</td></tr><tr><td>זן 2010</td><td>קרל זייס</td><td></td><td>תוכנת רכישה</td></tr><tr><td>Imaris Bitplane&nbsp;</td>תוכנת ניתוח <td>מטוסי</td><td></td><td>סיביות, מעקב אוטומטי תלת מימדי</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>D. ניתוח דוצ'ר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא תרמוסט</td><td>הדמיה תוך-חיונית</td> <td>של קרל זייס</td><td></td></tr></tbody></table>

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; in vivo</em

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

הדמיה מולטי-פוטונית בזמן אמת מספקת הזדמנות מצוינת לחקור סחר בתאים ואינטראקציות בין תאים בסביבתם התלת-ממדית הפיזיולוגית. הפעילות הביולוגית של תאי החיסון תלויה בעיקר ביכולות התנועתיות שלהם. למונוציטים בדם יש זמן מחצית חיים קצר בזרם הדם; מקורם במח העצם ומשתחררים ממנו באופן מכונן. במצב דלקתי, תהליך זה משופר, מה שמוביל למונוציטוזיס בדם ולחדירה לאחר מכן לרקמות הדלקתיות ההיקפיות. זיהוי האירועים הביומכניים השולטים בסחר מונוציטים ממח העצם לעבר רשת כלי הדם הוא צעד חשוב להבנת הרלוונטיות הפיזיופתולוגית של מונוציטים. ביצענו הדמיה ב-time-lapse in vivo על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני של מח עצם הגולגולת של עכבר Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). עכבר ה-MacBlue מבטא את החלבון הפלואורסצנטי המשופר של ציאן (ECFP) תחת שליטת מקדם ספציפי למיאלואיד 1, בשילוב עם תיוג רשת כלי הדם. אנו מתארים כיצד גישה זו מאפשרת מעקב אחר מונוציטים מדולריים בודדים בזמן אמת כדי לכמת עוד יותר את התנהגות הנדידה בתוך פרנכימת מח העצם וכלי הדם, כמו גם אינטראקציות בין תאים. גישה זו מספקת תובנות חדשות לגבי הביולוגיה של תת-קבוצות מונוציטים של מח העצם ומאפשרת לטפל עוד יותר כיצד ניתן להשפיע על תאים אלה במצבים פתולוגיים ספציפיים.

מבנה גולגולת עכבר מציע הזדמנות טובה ללמוד את הפיסיולוגיה מח עצם על ידי ההדמיה intravital. להיות רזה באזור הקדמי הקודקודית העצם, ניתן לקבל גישה לנישות medullar ללא שחיקה של העצם. איור 1 מייצג שדה 2D רחב של הגולגולת של עכבר מהונדס MacBlue. מטריצת העצם מורכבת בעיקר של קולגן אני בקלות לזיהוי על ידי SHG 19. הזרקה של rhodamin-dextran מכתימה את רשת כלי הדם של מח העצם ומאפשרת לזיהוי נישות מח עצם parenchymal בין מטריצת העצם וכלי 14. תאי ECFP מופצים בש...

מונוציטים הם מווסתים מרכזיים של חסינות מולדת וממלאים תפקיד קריטי בחידוש המערכת הפגוציטית החד-גרעינית ההיקפית ובמקרה של דלקת. כתב יד זה מתאר את הליך ההדמיה בזמן אמת של מח העצם של קלווריה של העכבר כדי לחקור את מנגנון הגיוס של המונוציטים.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדמיות של תנועת מונוציטים במח העצם של עצם הגולגולת בעכבר חי באמצעות דימות דו-פוטוני. ראשית, העכבר מורדם ומזוריק בתמיסה של rot, rumine dextran כדי לסמן את כלי הדם. לאחר מכן, העכבר ממוקם בתומך מתכת בהתאמה אישית, והקרקפת מאזורB החלק האחורי של העצם הפריאטלית ועד העצם הפרונטלית מוסרת.לאחר מכן, טבעת גומי מודבקת ישירות לגולגולת באמצעות דבק כירורגי, והמאגרים ממולאים בתמיסת סליין נוזלית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיית פוטונים רב-פוטונית כדי לעקוב אחר התפתחות תאים פלואורסצנטיים לאורך זמן בתוך מח העצם של הגולגולת. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה מרכזית בתחום האימונוהמתולוגיה, כגון מנגנון הגיוס של מונוציטים במצב בסיסי או לאחר כימותרפיה.לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התנהגותם של מונוציטים מודולריים. ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור תתי-אוכלוסיות אחרות של תאי מח עצם, בהתאם לספציפיות של הדיווחן הפלואורסצנטי שבו נעשה שימוש. הפרוטוקול הבא עושה שימוש במיקרוסקופ רב-פוטוני המחובר ללייזר קריסטל טיטניום-ספיר, ומתאם אופטי לבקרת הספק הלייזר.כדי לאפשר הקלטה סימולטנית של שלושה ערוצים פלואורסצנטיים, התצורה צריכה לכלול שלושה גלאי סריקה חיצוניים שאינם DS או nds עם שילוב של מראות דיכרואיות 565 nanometers ו-690 nanometers, מסנני band pass של 565, 610 nanometers, ו-500 550 nanometer, ומסנן short pass של 485. שימו לב שבמערך זה, יצירת הרמוניה שנייה או SHG וחלבון פלואורסצנטי ציאני או CFP מזוהים על ידי ה-NDD לאחר מסנן ה-short pass של 485. CFP מזוהה גם על ידי ה-NDD.לאחר מסנן הפס תעבור 500 550, ה-Rod Domine Dextran מזוהה על ידי ה-NDD. לאחר מסנן הפס תעבור 565 610, מספר שעות לפני הדמיה, כוון את תא החימום ל-32 degrees Celsius. טמפרטורה זו תשמור על העכבר בטמפרטורת גוף אופטימלית לאורך כל הניסוי.שימו לב שתא החימום המשמש כאן הוא כהה ומכסה את העדשות ואת הפלטה הממוטרת של המערכת. הדבר מסייע במניעת זיהום מאור חיצוני. כדי להפעיל את המערכת, הדליקו תחילה את לייזר הטיטניום-ספיר, ולאחר מכן הדליקו את שאר מערכת המיקרוסקופ.הפעילו את תוכנת הרכישה. במקרה זה, נעשה שימוש בתוכנת Zeiss Zen. הגדירו את טווח אורך הגל של הלייזר ל-870 nanometers.לאחר מכן, בחרו את ה-NDD המתאים להקלטה. העכבר ששימש בניסוי זה הוא עכבר טרנסגני הנקרא Mac blue, המבטא חלבון פלואורסצנטי ציאני (cyan fluorescent protein) תחת שליטתו של הפרומוטור של CSF1R. שיטת ההרדמה המומלצת תלויה במשך הדמיון, ולכן מומלץ לעיין במסמך המצורף לקבלת פרטים נוספים.היבט קשה של הליך זה הוא ההזרקה לווריד ה-T, שכן קל למדי להחמיץ את הווריד. אם הדבר קורה, בצעו במקום זאת הזרקה רטרו-אורביטלית. לאחר שהעכבר הורדם, השתמשו בקוצץ כדי לבדוק את חסר ההכרה על ידי גירוי כרית כף הרגל.הבא.כדי לצבוע את כלי הדם, הזרקו 200 µL של rhodamine dextran לווריד הזנב, או לצביעת נויטרופילים, הזרקו 100 µL של תמיסת סליין המכילה LY6G PE. לאחר ההזרקה, מקמו את ראשו של העכבר בין לוחיות הקיבוע של מחזיק סטראאוטקטי בהתאמה אישית, המותאם למיקרוסקופ ולשואף גז ההרדמה.דבר זה מבטיח שתנועות הנשימה לא ישפיעו על הדימות. הדק את לוחות הקיבוע כדי למתוח את העור בין האוזניים לראש. בדוק את היציבות.בלחיצה עדינה על הראש באמצעות פינצטה, הראש לא אמור לזוז. לאחר מכן, ודאו שהבעל חיים נושם באופן תקין. כדי להכין את העכבר לדימוי דו-פוטוני, השתמשו באצבע למריחת 70%ethanol על שיער הקרקפת, תוך הקפדה להימנע ממגע בעיניים.לאחר מכן, הנח סדין עם פתח לחשיפת הקרקפת. בשלב הבא, באמצעות מספריים וקוצץ סטריליים, חתוך את העור והסר לחלוטין את הקרקפת מאחורי עצם הפריאטלית (עצם הרקה) ועד לעצם הפרונטלית (עצם המצח). שמור על מרחק של שלושה מילימטרים מהעיניים והאוזניים כדי למנוע דימום נרחב.הסיר את רקמת החיבור הרפויה או את הפריאוסטאום (periosteum) המכסים את הגולגולת. לאחר מכן, באמצעות נייר סופג ספוג ב-PBS חמים, שטוף את שאריות השיער כפי שמוצג כאן. באמצעות מחט בעלת קוטר קטן, מרח דבק כירורגי על פני כל ההיקף של טבעת גומי בקוטר 10 מילימטר.לאחר מכן, הניחו את טבעת הגומי ישירות על הגולגולת באמצעות נייר סופג נוסף הספוג ב-PBS. נקו את פנים הטבעת פעם אחרונה. הוסיפו PBS חמים כדי להטביע את הגולגולת לחלוטין.לאחר מכן, הניחו את המחזיק הסטריאוטקטי תחת העדשה. ברגע שהעכבר ממוקם, השתמשו בעינית המיקרוסקופ עם תמסירה ישירה כדי לצפות בגולגולת ולמצב אותה באופן גס בשדה הראייה של המיקרוסקופ. בחלק השמאלי העליון של חלון תוכנת ההדמיה, לחצו על רכישה חיה (live acquisition).סריקה חיה של הרקמה תופיע במרכז החלון באמצעות בקרת הכיוון של המיקרוסקופ בתוכנה. אתר אזור עם אות CFP ואות rod דומיננטי כדי לכוון את הפוקוס. לאחר מכן, הגדר את עוצמת הלייזר למינימום כדי להשיג את יחס אות לרעש הטוב ביותר עם נזק פוטו-כימי מינימלי.בשלב הבא בתוכנה, לחצו על לשונית הערוצים (channel) והגדילו את עוצמת הגבירה (gain power) ב-PMTs עבור כל NDD כדי להפחית פוטובליצ'ינג (photo bleaching) ונזק פוטוני, ולאחר מכן לחצו על הלשונית המתאימה כדי להגדיר את הגדרות הרכישה לסריקה בודדת עם זמן שהייה של פיקסל של 1.58 microseconds ורזולוציה של 512 על 512 pixels עם הגדלה של 1.5. לאחר הגדרת פרמטרי ההקלטה, לחצו על פקודת הרכישה בזמן אמת (live acquisition) וסרקו את הרקמה כדי לבחור שדה x, y, Z רצוי למעקב בזמן אמת. כאן, נבחר שדה הכולל אזורים וסקולריים ופארנכימתיים כאחד.כדי לשמור או לרשום את קואורדינטות ה-X, Y, Z של השדה המוצג בלשונית המיקומים (positions), לחצו על add. חזרו על תהליך זה עבור עד שלושה שדות נוספים כדי לרשום את כל הקואורדינטות הרלוונטיות.הקואורדינאטות יופיעו בלשונית המיקומים (positions) לצד הוראות התוכנה. כדי ללכוד סדרת תמונות (stack) של שלושה DZ, לחצו על move to בלשונית המיקומים בתוכנה כדי לעבור למיקום הרשום הראשון, ובחרו ב-Zack בתיבה השמאלית העליונה של התוכנה. פעולה זו תפתח את לשונית ה-Z stack, תעביר את המערכת למיקום ה-Z הגבוה ביותר ותכוון את עוצמת הלייזר בהתאם.לחצו על set last, ולאחר מכן עברו לעמדה העמוקה ביותר. כווננו את עוצמת הלייזר. לאחר מכן לחצו על set first.יש להתאים את עובי ערימת התמונות לניתוח למהירות התאים הנחקרים. תאים נעים יעזבו את המישור המוקד במהירות, ולכן יהיה צורך ברכישת ערימה עבה יותר. עבור תאים הנעים לאט, ניתן לרכוש ערימה דקה יותר.בתיבה השמאלית העליונה, בחרו בפקודת סדרת הזמנים (time series) כדי לפתוח את לשונית סדרת הזמנים. הגדירו את מספר המחזורים ואת מרווח הזמן. במקרה זה, נפח אחד ייס scanning מדי 30 seconds למשך 60 מחזורים.זה מייצג 30 דקות בזמן אמת. כדי להתחיל את דימוי ה-time lapse בחלון הראשי, בחרו ב-start experiment; לאורך הפרוצדורה, המשיכו לנטר את בעל החיים כדי לוודא שהוא מחוסר הכרה. כמו כן, ודאו שהעדשה טבולה כראוי.לאחר לכידת הרצף, השתמשו בפיפט להוספת PBS חם. לאחר מכן, התחילו רכישה שנייה למשך 30 דקות. אם נצפית היעלמות הדרגתית של האות במהלך הרכישה, בדקו אם יש דליפה של PBS.לאחר הקלטת כל הסרטונים הנדרשים, בצעו ניתוח נתונים כפי שמתואר במסמך המצורף לבחינת פיזיולוגיית מח עצם באמצעות דימות intravital; עכבר טרנסגני Mac blue הוזרק ב-2 million Dalton rhodamine dextran, ודומם באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר דו-פוטונית. כפי שמוצג בסרטון זה, במיקרוגרף המתקבל, כלי הדם הצבועים ב-2 million Dalton rhodamine dextran מופיעים באדום, והעצם, המופיעה בכחול, מוצגת באמצעות second harmonic generation. מונוציטים חיוביים ל-ECFP, המופיעים בצבע ציאן, ממוקמים בתוך נישות פנרנכימליות, הנראות כאזורים כהים בין כלי הדם לעצם, ובתוך כלי הדם.כדי לחשב את מסלול התנועה של תאים בודדים, בוצע דימוי בשיטת time-lapse. סרטון זה מציג את התנהגות הנדידה של מונוציטים פהנכימליים. אות ה-ECFP מופיע בצבע ציאן ומסלולי הנדידה עבור כל נקודה אדומה מופיעים בירוק.כאן ניתן לראות את התנהגות הנדידה של מונוציטים וסקולריים. ניתן להשתמש בנתונים אלו כדי לחשב הן את המהירות הממוצעת והן את ההעתק הריבועי הממוצע של התאים. שימו לב כי המונוציטים הוסקולריים מראים הן הגדלה בהעתק והן הגדלה במהירות בהשוואה למונוציטים פראנכימליים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן מעקב אחר מונוציטים ממח העצם של עכברים in vivo באמצעות שני סוגי דימות פוטוני לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור נדידה של תאים ואינטראקציות במח העצם, המהווה אתר חשוב מאוד של hematopoiesis, אך גם תפקודי יסוד אחרים כגון antigen priming וזיכרון אימונולוגי.

tracking-mouse-bone-marrow-monocytes-in-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד מח עצם שלם טרי מגפיו האחוריות של העכבר כדי לחקור פגמים שלמים ב- BM עבור חולים עם הפרעות דם כגון לוקמיה.

קציר מח עצם מגפה אחורית של עכבר

פרוטוקול זה מתאר הליך לדגימה סדרתית של מח עצם הירך (BM) מבלי לדרוש הקרבה של עכברים. הליך זה מקל על מחקרי אורך של הרכב ה-BM של עכברים לאורך זמן ומספק גישה סדרתית לתאים בתוך ה-BM למחקרי ex vivo והשתלות.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

אנו מפרטים פרוטוקול לניטור התנהגותם של נויטרופילים ומונוציטים בוורידים מזנטריים במצב יציב ובתנאים דלקתיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית בעכברים מורדמים.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

הפרוטוקול מתאר מודל חדש של תא חלון עצם הירך של עכברים שניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תנועת תאים במח עצם הירך in vivo. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב-פוטונית תוך-חיונית משמשת להדמיית שלושה מרכיבים של מח עצם הירך (כלי דם, מטריצת קולגן ונויטרופילים) לאורך זמן.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לעבד מח עצם טרי (BM) מבודד מעכבר או בן אדם עבור cy, מימדי המונית ההמוני (Cy, Try על ידי זמן הטיסה, Cy,) ניתוח של תאי השושלת של נויטרופילים.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח אולטרה מבנה של megakaryocytes במקום באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM). מח עצם מורין נאספים, קבועים, מוטבעים בשרף אפוקסי וחתוכים בחלקים אולטרה-דקים. לאחר כתמי ניגודיות, מוח העצם נצפה תחת מיקרוסקופ TEM ב 120 kV.

בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-פמורלית של כמה תאי גזע המטופויטיים או לוקמיים, כולל תאים ערוכים גנטית, במודלים של קסנוגרפט מורין, אשר לא רק יאפשרו השתלה מהירה ובטוחה של תאים אלא גם ניתוחים סדרתיים של מח העצם.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא אנזימטית ופשוטה לבידוד תאי מח עצם של עכבר יילודים בני 7-9 ימים ויצירת מקרופאגים ממוינים באמצעות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור לגורם מגרה מושבת גרנולוציטים (M-CSF). המקרופאגים שמקורם במח עצם נותחו עוד יותר עבור אנטיגנים פני השטח F4/80, CD206, CD11b וכשירות תפקודית.

עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

למדו לעקוב אחר תנועת מונוציטים במוח העצם של עכברים חיים באמצעות דימות שני-פוטוני. שיטה זו חושפת מנגנוני מוביליזציה במצב יציב ולאחר כימותרפיה, ומסייעת להבנת תגובות חיסוניות.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים

גלה סרטונים נוספים