ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון כיצד תאים השוכנים ברקמה משפיעים על יכולתן של תאי אנדותל וסקולריים לתמוך בגיוס לוקוציטים במהלך דלקת. דבר זה מושג תחילה על ידי הקמת תרביות משותפות (co cultures) של תאי אנדותל עם תאי גזע מזנכימליים באמצעות אחד משני מודלים וסקולריים למעבדה (in vitro), מודל המיקרו-שקופית (micro slide) ומודל המסנן. תרביות אלו מטופלות לאחר מכן בציטוקין לפני ביצוע בדיקת הזרימה.

מערכת ה-aian מבוססת הזרימה מורכבת לאחר מכן באופן מדורג, עם התאמות המבוצעות בהתאם למודל המערכת שבו נעשה שימוש. השלב הסופי הוא ביצוע פרפוזיה של לוקוציטים על התאים האנדותליאליים ותצפית על גיוסם מהזרימה וכן על התנהגותם לאחר מכן. בסופו של דבר, בדיקות היצמדות רב-תאיות מבוססות זרימה אלו הראו כי תקשורת בין תאי גזע מזנכימליים לתאים אנדותליאליים מדכאת גיוס נויטרופילים במהלך דלקת.

שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום תנועת הלוקוציטים (leukocyte trafficking), כגון כיצד תאים השוכנים ברקמה, למשל תאי גזע מזנכימליים, משנים תהליך זה? האם שינוי זה מתרחש במחלות כגון דלקת כרונית או סרטן? האם ניתן להשתמש בידע זה כדי לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות? כדי להתחיל, הקימו תרביות משותפות (co-cultures) של תאי אנדותל עם תאי גזע מזנכימליים באמצעות מודל המיקרו-שקופית או מודל המסנן, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, להרכבת מערכת הזרימה.

ראשית, הפעילו את המחמם וכוון אותו ל-37 °C. לאחר מכן, חברו מזרק של 20 mL ללא הבוכנה, וכן מזרק של 5 mL, לברז תלת-דרכי. לאחר מכן, מדדו וגזרו קטע ארוך של צינור בקוטר 2.4 mm, באורך השווה בקירוב למרחק שבין השסתום לברז התלת-דרכי.

חתוך קטע באורך 8 עד 10 מילימטרים של צינור בקוטר 1.3 מילימטר והכנס אותו לאחד הקצוות של הצינור העבה. חבר את צד הצינור העבה לברז התלת-כיווני וחבר את קצה הצינור הדק ליציאה של השסתום המיקרו-אלקטרוני התלת-כיווני כדי ליצור את מאגר השטיפה.

לאחר מכן, הצמידו את הברז לתא הפרספקס באמצעות סרט מיקרופור. לאחר מכן, חתכו חתיכה באורך של שש עד שמונה מילימטרים של צינור עבה וצינור דק, והחדירו את הצינור הדק לתוך קצה אחד של הצינור העבה. חברו את קצה הצינור העבה למזרק של 2 mL שהסיר ממנו את הבוכנה.

כעת חברו את קצה הפיתול הדק של מזרק ה-2 mL לאחד הפתחים בשסתום המיקרו-אלקטרוני כדי ליצור את מאגר הדגימה. לאחר מכן, מדדו וגזרו קטע ארוך של פיתול דק באורך המרחק שבין שסתום המיקרו למרכז של במה המיקרוסקופ. עבור דגם למשטח מיקרוסקופיה, חברו קטע של 8 עד 10 mm של פיתול עבה לקצה הפיתול הדק.

לאחר מכן, מקמו מחבר בצורת L בקצה הפיתול העבה. זה יחבר את המיקרו-שקופית או את דגם המסנן. חברו קטע של 8 עד 10 מילימטר של צינור חיבור למד-לחץ (manometer) מסוג portex blue line לקצה הפיתול הדק.

כעת הנחו את קצה הפיתול הדק על השסתום המיקרוסקופי. הפיתול משמש כפתח יציאה משותף למאגרי השטיפה והדגימות. מלאו את המאגרים בתמיסת סליין עם בופר פוספט המכילה bovine serum albumin.

הזרמו PBSA בתוך הפיתול כדי להכין אותו ולהוציא בועות אוויר, ולאחר מכן חברו את פיתול המנומטר למזרק זכוכית של 50 milliliters. עבור מודל המיקרו-שקופית, חברו רק קטע של 10 עד 12 millimeters של פיתול עבה לקצה פיתול המנומטר המוביל למזרק הזכוכית. מקמו מחבר בצורת L בקצה הפיתול העבה.

הכינו את המזרק על ידי מילוי ב-10 milliliters של PBSA. הפכו את המזרק כך שהקצה המחובר לצינור יפנה כלפי מעלה, ודחפו החוצה את כל בועות האוויר לפני מילוי חוזר של חמישה milliliters של PBSA. לבסוף, הכניסו את מזרק הזכוכית למשאבת מזרקים לצורך עירוי ושאיבה.

הגדירו את קצב המילוי ואת קוטרה של מזרקת הזכוכית כדי להכין את השקפים המיקרוסקופיים לזרימה. הניחו את השקף המיקרוסקופי על השולחן של מיקרוסקופ הפוך בעל ניגודיות פאזה. סובבו את הברז התלת-כיווני כדי לאפשר ל-PBSA לזרום דרך צינור הכניסה.

חברו את המחבר בצורת L לפתח הכניסה של תעלת שקופית מיקרופלואידית. לאחר מכן, מקמו את המחבר בצורת L של משאבת המזרק בפתח היציאה של התעלה. נקו כל שארית של PBSA שנטפטפה על שקופית המיקרו.

לחלופין, עבור דגם המסנן, גזרו תחילה חתיכת פארה-פילם (para film) בגודל זהה לכיסוי הזכוכית באמצעות תבנית מתכת. לאחר מכן, גזרו בתוך הפארה-פילם חריץ של 20 על 4 מילימטר באמצעות תבנית מתכת כדי ליצור את תעלת הזרימה. השתמשו באטם הפארה-פילם כדי לסמן את תעלת הזרימה על כיסוי הזכוכית.

יישרו את קצוות המסנן בעל שישה בארות על גבי כיסוי הזכוכית. ודאו שהמסנן מכסה את סימוני תעלת הזרימה. גזרו בזהירות את המסנן באמצעות סכין מנתח מסוג 10.

כעת כסו בזהירות את המסנן בעזרת אטם פאראפורם (paraform), תוך וידוא שחריץ תעלת הזרימה נמצא במרכז המסנן. השתמשו בחתיכת נייר סופג נקייה כדי לדחוף החוצה בועות אוויר. כעת הניחו את לוחית הכיסוי בשקע של הלוח התחתון של תא הזרימה העשוי פרספקס (Perspex).

מקם את לוח הפרספקס העליון מעל האטם והברג את הלוחות זה לזה. סובב את הברז התלת-כיווני כדי לאפשר לתמיסת השטיפה PBSA לזרום דרך השסתום. לאחר מכן, חבר את צינור המנומטר לפתח הכניסה של לוח הפרספקס העליון.

העבירו PBSA דרך תעלת הזרימה כדי לאפשר לבועות לצאת. לאחר מכן, חברו את צינור המנומטר ממשאבת המזרקים אל פתח היציאה של לוח הפרספקס. נגבו PBSA שנטף על הלוח העליון של התא.

לבסוף, הניחו את התא על המשטח של מיקרוסקופ פאזה הפוך וכוונו את הפוקוס כדי להדמות את התאי האנדותלליים מעל המסננים, במטרה לבצע פרפוזיה של לוקוציטים מעל התאים האנדותלליים. הגדירו את משאבת המזרק למילוי מחדש ולחצו על run לאחר כיוון הפוקוס. כדי להדמות את השכבה החד-שכבתית של התאים האנדותלליים, העבירו שני מיליליטרים של נויטרופילים מטוהרים למאגר הדגימה והמתינו שתי דקות לחימום.

לאחר מכן, שטפו את האנדותל באמצעות PBSA למשך שתי דקות. פתחו את השסתום כדי לבצע פרפוזיה של נויטרופילים על גבי האנדותל. העבירו את בולוס הנויטרופילים למשך ארבע דקות.

סגרו את השסתום ובצעו פרפוזיה של PBSA ממכל השטיפה למשך שאר הניסוי. בעת ביצוע הניסוי, ודאו שבועות אוויר אינם חולפים בשום נקודה במהלך הבדיקה, שכן הדבר ישבש את השכבה החד-שכבתיות של תאי האנדותל ויגרום להיפרדות של נויטרופילים דבקים. תיעו את גיוס הנויטרופילים במהלך זרימת הנויטרופילים או לאחר הפרפוזיה באמצעות תוכנה ללכידת תמונות דיגיטליות.

זהו את מרכז התעלה על ידי הזזת העדשה לקצה התעלה בפתח הכניסה וזיהוי מרכז הפתח. בצעו את כל ההקלטות הדיגיטליות של לפחות חמישה עד 10 שדות במרכז תעלת הזרימה או הקליטו במהלך זרימת נויטרופילים. צלמו תמונות של שדה בודד מדי 10 שניות למשך דקה אחת, התקדמו לאורך התעלה והקליטו שדה נוסף למשך דקה אחת.

חזרו על תהליך זה לאורך משך מתן הבולוס להקלטת השלב שלאחר הפרופוזיה. בצעו הקלטה של עשר שניות של חמישה עד 10 שדות לאורך מרכז תעלת הזרימה להערכת התנהגות הלוקוציטים. צלמו תמונות בכל שנייה בתוך פרק הזמן של עשר השניות.

דבר זה מאפשר זמן מספיק לניתוח הלכידה מהזרימה וההתנהגות של נויטרופילים דבקים. הקליטו שדה בודד המכיל לפחות 10 נויטרופילים שעברו נדידה טרנס-מיגרטיבית למשך חמש דקות, תוך צילום תמונות בכל 30 שניות. ניתן להשתמש בכך כדי לחשב את מהירות התאים הנדדים; הקליטו סדרה נוספת של שדות בני עשר שניות.

שלב זה מאפשר לנייטרופילים זמן להגרה דרך השכבה האנדותליאלית החד-שכבתית. לבסוף, עצור את משאבת המזרק והסר את צינור היציאה, ולאחר מכן את צינור הכניסה; פרק את תא הזרימה ושטוף את מאגר הדגימה ב-PBSA; חזור על הפעולה עבור מסננים וערוצי מיקרו-שקופיות נוספים לפני המעבר לניתוח של גיוס והתנהגות לוקוציטים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. במודל המיקרו-שקופיות, גרייה של ציטוקינים באמצעות גורם נמק גידול אלפא (TNF-α) הגבירה באופן משמעותי את היצמדות הנייטרופילים לאנדותל באופן תלוי מינון.

בנוסף, נצפתה ירידה תלוית-מינון של TNF alpha באחוז הנויטרופילים המתגלגלים על פני השטח האנדותליאליים. הדבר בא לידי ביטוי בעלייה תלוית-מינון של A-T-N-F-L ובאחוז הנויטרופילים הנודדים דרך השכבה האנדותליאלית האحادית, ובכך עוברים נדידה טראנס-אנדותליאלית. תוצאות דומות נצפו בבדיקת הזרימה מבוססת המסנן.

לדוגמה, גרייה ב-TNF alpha הגבירה את היצמדות הנויטרופילים באופן תלוי מינון. תרבית משותפת של תאים אנדותליאליים עם תאי גזע מזנקים ממקור של מחול השלד הפחיתה באופן משמעותי את היצמדות הנויטרופילים בהשוואה לתאים אנדותליאליים. תאים שגודלו לבדם, כפי שצפוי עבור מודל המיקרו-סלייד.

שוב, השפעות דומות נצפו כאשר נעשה שימוש במודל המבוסס על מסנן, כאשר נראתה היצמדות פחותה בקו-קולטורה (co-culture) בהשוואה למונו-קולטורה (monoculture). לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו בוחנים כיצד תאי סטרומה מתקשרים עם תאי אנדותל כדי להשפיע על גיוס לוקוציטים במהלך דלקת.