הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה
6 במרץ 2015
אנו מתארים שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות מעי דק וקולונואידים מקריפטות המעי הגס שנאספו הן מרקמות כירורגיות והן מביופסיות. במאמר מתודולוגי זה, אנו מציגים את אופני התרבות החיוניים לצמיחה ותחזוקה מוצלחת של אנטרואידים וקולונואידים אנושיים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק אנטרוציטים אנושיים מרקמות מעי. הדבר מתבצע תחילה על ידי הפרדה כירורגית של רירית המעי מרקמת הסב-רירית שמתחתיה. השלב השני הוא דגירה של הרירית עם EDTA כדי לעודד את הדיסוציאציה של האפיתל מרקמת החיבור.
בשלב הבא, הקריפטות של המעי מופרדות מהאפיתל המפוהם. לבסוף, הקריפטות של המעי מגדלנן במטריצת ממבנה בסיס (basement membrane matrix). בסופו של דבר, נעשה שימוש בטכניקות של אימונוהיסטוכימיה כדי להראות את הארגון האפיתלי וכן סממנים אפיתליים ספציפיים של ה-OIDs שגודלו.
המשמעות של שיטה זו היא שביכולתנו כעת להפיק OID-ים מביופסיות ספציפיות למטופל, מה שאומר שניתן להשתמש ברקמה זו במעבדה כדי לבחון מחלות ואבחנות של המעי, דבר שלא היה אפשרי עד כה. לאחר הכנת התמיסות והריאגנטים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הפשיר את קרום הבסיס על קרח והקדמ את דגירת פלטה בעלת 24 בארות באינקובטור פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 °C עם קבלת הרקמה. השתמש ב-PBS של KO ללא סידן ומגנזיום או ב-DPBS כדי לשטוף את הרקמה עד שנוזל ה-DPBS יהיה צלול.
הניחו את הרקמה בתוך צלחת פטרי מזכוכית מצופה סיליקון ומלאה ב-DPBS קר מאוד, כאשר הצד הרירי פונה כלפי מעלה, והדביקו את הרקמה בעזרת סיכות מינוכין (minuchin pins) על ידי מתיחה וקיבוע. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיססקציה, השתמשו במספרי מיקרו-דיסקציה ובפינצטה עגולה בעלת חוד דק כדי להסיר את הרירית התחתית מהסוב-מוקוזה (submucosa) ומרקמת החיבור. לבסוף, כאשר הצד הרירי פונה כלפי מעלה, מתחו וקבעו את הרירית המופרדת בצורה שטוחה על צלחת הפטרי מזכוכית מצופה סיליקון.
בעזרת פינצטה מעוקלת, גרדו בעדינות את פני השטח של הרירית. שלב זה נחוץ כדי לשפר את איכות ההכנה. כסו את הרירית בתמיפת קישור (chelation buffer) של EDTA בריכוז 2 mM שהוכנה טרי.
לאחר שטיפת הרקמה על קרח, שלוש עד ארבע פעמים בהתאם לפרוטוקול הכתוב תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטה קמורה כדי לגרד בעדינות את הרירית ולהוציא את הקריפטות המעיים בעזרת פיפטה. הוציאו בעדינות את תמיסת הקריפטות מבתרי dish והעבירו אותה למבחנה קונית של 50 מיליליטר. לאחר מכן, בדקו את הרקמה כדי לוודא שמרבית הקריפטות הוסרו מהרירית.
סננו את תרחיף הקריפטים דרך מסנן של 150 מיקרומטר פעמיים והשתמשו במיקרוסקופ כדי לבדוק את זרימת הנוזל. לאחר שטיפת תרחיף הקריפטים והעברת מספר הקריפטים הדרוש לפסולת מבחנה בעלת תחתית עגולה בנפח של 5 מיליליטר, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, סנטריגו את פראקציית הקריפטים למשך 10 דקות ב-150 Gs ובטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסירו את עליון הנוזל באמצעות טיפים של פיפטה שקולאו מראש, והשביו את משקע הקריפטים בתוך basement membrane matrix.
הוסיפו 50 µL של תרחיף קריפט במטריצת קרום בסיס לכל באר בלוח שחומם מראש, על ידי הזרקה איטית של מטריצת קרום הבסיס למרכז הבאר. הדגרירו את הלוח באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז 5% carbon dioxide למשך 30 דקות כדי לאפשר פולימריזציה מלאה של מטריצת קרום הבסיס. לאחר מכן, כסו את מטריצת קרום הבסיס ב-500 µL של מצע מעי אנושי מיני (complete human mini gut medium), המועשר ב-2.5 µM של CHIR 9 0 2 2 1.
ואת Thien מדגירים את הרקמה תוך החלפת המצע לאחר יומיים, ולאחר מכן מדי יומיים. איור זה מציג דוגמה טיפוסית לקריפטות שבודדו באחרונה מרקמה שלמה. מספר הקריפטות שבודדו ביופסיה קטן יותר מאשר ברקמה שלמה.
בדרך כלל מבוצעות שתי דגימות ביופסיה במעבר בודד. כל דגימה ביופסיה מניבה שטח של 10 מילימטרים רבועים עם ממוצע של 50 עד 100 קריפטים (crypted) לביופסיה. לאחר תרבית ומטריצת קרומי בסיס למשך חמישה עד שישה ימים, הקריפטים מתעגלים ליצירת entero spheres עבור המעי הדק ו-colono spheres עבור המעי הגס, ומועברים למצע חדש לאחר שבעה ימים.
האוורגנואידים או ה-OIDs שהוקמו מביופסיות כפי שמוצג כאן, עוברים את אותו תהליך התפתחות בצפיפות נמוכה יותר בעת הזריעה. לכן, האריזה מבוצעת בדרך כלל לאחר 10 עד 12 ימים בתרבית. כפי שמוצג כאן, הן ה-OIDs והן ה-OIDs מציגים צד לומינלי ומרופדים באפיתל.
ניתן להבחין בתאים בשלב התחלקות (proliferative cells) בתוך ה-OIDs, והם ממוקמים בקצות הניצבים. הדמיה קונפוקאלית של OIDs שצבעו e catrin (כאן בירוק) מראה את התאים האפיтелиאליים. דמות זו מציגה enterocytes הגדלים ממטופל עם סיסטיק פיברוזיס ואנטרופתיה של תסריגים (tufting enteropathy) עקב מוטציה מולדת בגן של מולקולת ההדבקה של התאים האפיтелиאליים.
ניתן להשתמש בפרוצדורה זו או בשיטות כגון real time PCR או Western blot כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע לגן או לחלבון ממסרק שלב. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעמדה המאפשרת הבנה טובה של האופן שבו ניתן לבודד באופן עקבי תאי CRISPR אנושיים, על מנת שתוכלו לייצר ביעילות מערכות במעבדתכם למענה על שאלות ספציפיות למטופלים שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות של המעי הדק וקולונואידים מקריפטות של המעי הגס. הפרוטוקול מפרט את אופני התרבית החיוניים לצמיחה ולתחזוקה מוצלחת של אורגנואידים אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גסטרואנטרולוגיה
רקע
- אנטרואידים וקולוניאידים אנושיים מופקים מרקמות מעי.
- השיטה מאפשרת מחקרים של מחלות מעי המותאמים למטופל ספציפי.
- בטכניקות קודמות חסרה היכולת לנצל ביופסיות של מטופלים באופן יעיל.
- אימונוהיסטוכימיה משמשת לניתוח הארגון האפיתליאלי.
מטרת המחקר
- ליצירת אורגנואידים אנושיים מרקמות מעי.
- לקידום המחקר על מחלות מעי ואבחון רפואי.
- לשיפור ההבנה של התנהגות תאים אפיתליאליים בתרבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפרדה של הרירית המעיית מהרקמה התת-רירית.
- אינקובציה עם EDTA לצורך דיסוציאציה של התאים האפיтелиאליים.
- תרבית של קריפטות מעי בתוך מטריקס של קרום הבסיס.
- שימוש בדימות קונפוקלי ובאימונוהיסטוכימיה לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של קריפטות מעי מביופסיות.
- יצירת אורגנואידים המדמים את מבנה המעי.
- תצפית על תאים פרוליפרטיביים בתוך אורגנואידים.
- הדגמה של פיתוח אורגנואידים ספציפיים לחולה.
מסקנות
- השיטה מאפשרת יצירה יעילה של אנטרואידים אנושיים.
- היא פותחת נתיבים לחקר מצבים מעיים ספציפיים למטופל.
- יישומים עתידיים כוללים ניתוח ביטוי גנים ומידול של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של אנטרואידים וקולוניאידים אנושיים מספקים מערכת רלוונטית פיזיולוגית לחקר הביולוגיה של אפיתל המעי ומנגנוני מחלה. גישה זו מאפשרת מידול מחלות ספציפי למטופל, ובכך תומכת בתיקוף מטרות (target validation) והפחתת סיכונים בשלבים הפרה-קליניים בתוכניות לגילוי תרופות המתמקדות בגסטרואנטרולוגיה. השיטה מגשרת בין ביולוגיה של גילוי למחקר תרגומי באמצעות יצירת מודלים של רקמות ממקור אנושי, הניתנים לשכפול ולהרחבה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות תאי אפיתל של המעי המופקים ממטופלים, השומרים על הגמישות התאית המקורית ועל הפולריות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מידול פנוטיפים אפיתליים רלוונטיים למחלה מחומר ביופסיה.
- ערך תרגומי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי שימור רקעים גנטיים ספציפיים למטופל במערכת תרבית תלת-ממדית (3D) ניתנת להרחבה.
סקר ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת שכבות מונואלית אפיתליאליות וספרואידים סטנדרטיים המתאימים לתהליכי דימוי בתוכן גבוה (high-content imaging) וסריקת תרכובות.
- פלט כמותי: מאפשרת מדידה של ארגון אפיתליאלי, פרוליפרציה ודיפרנציאציה באמצעות אימונוהיסטוכימיה ודימוי קונפוקאלי.
- שחזוריות: קובעת תנאי בידוד וטיפוח עקביים של קריפטות, שהם קריטיים לסטנדרטיזציה של הבדיקה בין מעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מידול מחלות: מקל על חקר מצבים מעיים ספציפיים למטופלים, כגון סיסטיק פיברוזיס ו-tufting enteropathy, באמצעות אורגנואידים המופקים מביופסיה.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך במעבר משלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על מבנה האפיתל ופעילות תאי הגזע לאורך זמן.
- סנכרון עם סממנים ביולוגיים: מאפשר ביסוס קורלציה בין פנוטיפים של אורגנואידים לבין סממנים ביולוגיים קליניים לצורך קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי אספקת מודלים של אפיתל אנושי למחקרי מעורבות מטרה (target engagement), בדיקות של מושגלי מסלולים ובדיקות רעילות לפני אופטימיזציית המועמד המוביל.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים באמצעות מניפולציה מבוקרת של אפיתל מעי המופק מחולים.
- סריקה: מספק תוצאים כמותיים וניתנים לשחזור לסריקת תרכובות באמצעות זריעה סטנדרטית של קריפטות והטמעה במטריצה.
- אנליטיקה: מספק תוצאים מבוססי דימיון (למשל, קוטביות אפיתליאלית, סממני התרבות) המאפשרים ניתוח השוואתי בין תנאים גנטיים או תנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי שימור מוטציות ספציפיות למטופל ופנוטיפים אפיתליאליים הרלוונטיים להפרעות במערכת העיכול.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה מתחדשת לשימוש במספר פרויקטים לצורך תיקוף מטרות, מחקרי מנגנון פעולה ואפיון בטיחות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי בתיקוף המטרה באמצעות מודלים של אפיתל אנושי רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: פרוטוקולים סטנדרטיים של דיסוציאציה ותרבית מבטיחים הדירות בין אתרים ומבצעים שונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת אי-ודאות ביולוגית בהערכה פריקלינית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם-סיכון על בסיס יעילות ורעילות במערכות מעי ממקור אנושי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של רקמות, בידוד קריפטות וטכניקות של תרבית בתלת-ממד להפקה מוצלחת של אורגנואידים.
- גישה למטריצת קרומי בסיס, מצעי תרבית מוגדרים ואינקובטורים עם בקרת CO2 חיונית ליצירה עקבית של אורגנואידים.
- סטנדרטיזציה של עיבוד הביופסיה וכמות הקריפטות נחוצה לשיתוף פעולה רב-תחומי ולהשוואתיות של הנתונים.
- התאמה לאזורים שונים של המעי (למשל, אילאום לעומת מעי הגס) דורשת אופטימיזציה של תנאי הדיסוציאציה והתרבית.
- תחזוקה לטווח ארוך מחייבת מעברים (passaging) והחלפות מצע קבועות כדי למנוע אובדן דיפרנציאציה וצמיחת יתר.
