דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה
7 במרץ 2015
אדיפוציטים בוגרים עשויים להוות מקור שופע לתאי גזע באמצעות דה-דיפרנציאציה, מה שמוביל לאוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי פיברובלסטים. עיכול קולגנאז משמש לבידוד אדיפוציטים בוגרים משומן אנושי. מטרת הפרוטוקול שלנו היא להשיג תאי שומן רב-עוצמתיים ומפורקים מתאי שומן בוגרים אנושיים.
לתאי שומן בוגרים יש את היכולת להפוך לתאים מקדימים in vitro. דבר זה מושג באמצעות תרבית חתומה, טכניקה שבה מתרבים תאים בוגרים בבקבוע הממולא לחלוטין במצע גידול ומגודל כשהוא הפוך. התאים הצפים נצמדים לבקבוע ומשנים את המורפולוגיה שלהם, מתא עגול מלא בליפידים לתא מוארך דמוי פיברובלסט. הומוגני.
ניתן להשיג ולטהר אוכלוסיות של תאים מוארכים עם קבלת דגימות הרקמה במעבדה. שקלו רקמות שומן, ובהתאם למספר האדיפוציטים הדרוש, העבירו נפח מתאים של דגימה למבנה של 50 ml לצורך עיכול; ניתן לצפות להשיג כמיליון תאים לגרם רקמה.
תרביות תקרה מבוצעות עם 500,000 תאים לכל בקבוקון (flask) של 25 סנטימטר ו-50,000 תאים לכל באר בלוח של שישה בארות. הוסיפו KRH working Buffer מועשר בקוﻻגנאז, קצצו את הרקמה בעזרת מספריים והדגרימו את התכשיר בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות. במהלך הדגירה, הכינו את מערך הצינוריות והמזרק. שפכו את התמיסה השקופה דרך רשת ניילון לתוך כלי זכוכית פלסטיקי בעזרת פינצטה.
שפשפו את תכשיר התאים דרך הרשת ושטפו בעדינות עם 5 ml של KRH working Buffer. העבירו את תרחיף התאים המסונן למבחנה של 50 ml באמצעות מזרק. הניחו לאדיפוציטים בוגרים לעמוד למשך כ-10 דקות.
התאים יגיעו לחלק העליון של התמיסון באמצעות ציפה. שאבו את התמיסון באיטיות מהחלק התחתון. בעזרת מזרק ופחית, הוסיפו 20 mls של תמיסון עבודה KRH לשטיפה.
חזור על שלבי השטיפה פעמיים. אסוף את התמיכה (buffer) כדי להביא את תרחיף האדיפוקיטים לנפח סופי של 5 ml והמשך לספירת התאים באמצעות המוסימטר (hemo cytometer). מלא בקבוק T 25 עד לשלושה רבעים מנפחו ב-D-M-E-M-F 12 מועשר ב-20% calf Serum והעבר 500,000 אדיפוקיטים בוגרים לבקבוק. מלא את הבקבוק במצע גידול עד לסוף והסר בועות אוויר מהמשטח העליון.
הברגים פקק המיועד לכך על הבקבוק. הדגר את הבקבוק כשהוא הפוך למשך שבוע אחד באינקובטור לתרביות תאים עם 5% carbon dioxide. הימנע מהזזת הבקבוק, שכן בועות שנותרו עלולות לפגוע בהצמדות התאים.
הניחו כיסית זכוכית (cover slip) בתחתית הבארות. הכניסו את התושבת הפלסטית לבארה ומלאו את הבארה ב-8 ml של מצע גידול. ודאו שאין בועות אוויר.
הניחו זכוכית כיסוי על גבי התושבת, והשאירו מרווח להחדרת קצה הפיפטה. דגמו 50,000 תאים והזריקו אותם על ידי הנחת קצה הפיפטה בין זכוכית הכיסוי לתושבת. דגרו את הפלטה באינקובטור לתרביות תאים עם 5% carbon dioxide למשך שבוע או פחות.
בהתאם לתכנון הניסוי, נדרשים לפחות שלושה ימים כדי שהתאים ייצמדו לכיסוי הזכוכית (cover slip) בתוך פלטה נפרדת. הפכו את כיסויי הזכוכית ב-2 ml של מצע גידול. בתרבית רציפה, ניתן לאחר מכן לקבע את כיסויי הזכוכית בפורמלין לצורך ניסויי אימונופלורסנציה או לצורך מיצוי DNA, RNA וחלבונים.
דה-דיפרנציאציה (De-differentiation) של אדיפוציטים בוגרים גורמת לשינויים משמעותיים במורפולוגיה של התא. במהלך תהליך זה, האדיפוציטים מאבדים את הפנוטיפ שלהם ומפגינים ירידה בביטוי של תמלילי RNA הקשורים בדרך כלל לתפקיד אגירת השומן שלהם. תמונת אימונופלואורסצנציה זו מציגה תאי שומן במצבים שונים של דה-דיפרנציאציה.
התאים בעלי המורפולוגיה העגולה עדיין מבטאים FABP4, סמן של אדיפוציט בוגר, בעוד שהתאים המוארכים אינם מבטאים אותו עוד, בהסתמך על הספרות המקצועית. ניתן להשיג תאי שומן מבדלים, המכונים לעיתים תאי שומן D, ממטופלים צעירים, מבוגרים, רזים או בעלי השמנה (OB). קיים להם פוטנציאל גידול ארוך טווח ויכולת רב-פוטנציאלית מוכחת.
אני מעריך גם את הפוטנציאל שלהם להנדסת רקמות ולתרפיה תאית. הן עשויות להוות מודל חדש לחקירה ספציפית של פיזיולוגיית האדיפוציטים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את דה-דיפרנציאציה (dedifferentiation) של אדיפוציטים בוגרים לתאים גזעיים רב-פוטנציאליים. באמצעות שימוש בעיכול בקולגנאז ובטכניקות של תרבית איטום (seal culture), חוקרים יכולים לבודד ולתרבת תאים אלה כדי להשיג אוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי פיברובלסט.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מחקר תאי גזע
- ביולוגיה של אדיפוציטים
- טכניקות לתרבית תאים
רקע
- אדיפוקיטים בוגרים יכולים לעבור דדפרנציאציה לתאי מוצא.
- ניתן לבצע תהליך זה in vitro באמצעות שיטות תרבית ספציפיות.
- בידוד של אדיפוציטים הוא קריטי להשגת תאי גזע.
- עיכול באמצעות קולגנאז הוא שיטה סטנדרטית לבידוד תאים.
מטרת המחקר
- השגת תאי שומן רב-פוטנציאליים שעברו דה-דיפרנציאציה (dedifferentiation) מאדיפוציטים בוגרים של בני אדם.
- ביסוס פרוטוקול לבידוד וגידול של תאים אלו.
- בחינת השינויים המורפולוגיים במהלך תהליך הדה-דיפרנציאציה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- עיכול באמצעות קולגנאז (Collagenase) לבידוד של אדיפוציטים בוגרים.
- טכניקת תרבית חתומה לעידוד דדפרנציאציה.
- הערכת מורפולוגיה של התאים לאישור הדדפרנציאציה.
- כימות של תנובת התאים על בסיס משקל הרקמה.
תוצאים עיקריים
- בידוד מוצלח של כ-1 מיליון תאים לגרם של רקמה שומנית.
- תאים שעברו דה-דיפרנציאציה הראו מורפולוגיה מוארכת דמוית פיברובלאסט.
- אוכלוסיות תאים הומוגניות התקבלו באמצעות השיטות המתוארות.
- הוכח הפוטנציאל של אדיפוציטים בוגרים כמקור לתאי גזע.
מסקנות
- ניתן להמיר ביעילות אדיפוקיטים בוגרים לתאי גזע רב-עוצמה.
- השיטות המפורטות מספקות גישה מהימנה למחקר בתאי גזע.
- מחקר זה תורם להבנת הפלסטיות של האדיפוקיטים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דה-דיפרנציאציה (Dedifferentiation) של אדיפוציטים בוגרים לתאי גזע רב-פוטנציאליים מהווה מקור חדש ליישומים ברפואה רגנרטיבית ובהנדסת רקמות. גישה זו מאפשרת אפיון ספציפי למאגר (depot-specific) של תפקוד האדיפוציטים ותכונותיהם המטבוליות, ובכך תומכת בתיקוף מטרות (target validation) במחקר של מחלות מטבוליות. השיטה מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה ליצירת תאים דמויי פיברובלסטים בעלי רב-פוטנציאליות מוכחת, מה שמקל על פיתוח מודלים פרה-קליניים והפחתת סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופתי ממוקד-אדיפוציטים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של פלסטיות תאי שומן (אדיפוציטים) ובדיקת השערות טיפוליות במסלולי מחלות מטבוליות.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הניתנת לשחזור לצורך תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות בידוד של תאי שומן ממאגרים ספציפיים.
- ערך מדעי: תומך בביטחון חיזוי על ידי יצירת אוכלוסיות הומוגניות של תאים שעברו דה-דיפרנציאציה לצורך הבהרת מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך תהליכי עבודה המשכיים, באמצעות עיכול קולגנאז סטנדרטי וטכניקות של תרבית תאים צפה (ceiling culture).
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה והשחזור של הבדיקה באמצעות תנובאת אדיפוציטים מבוקרת (כמיליון תאים לגרם רקמה).
- ערך מדעי: מתאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות באמצעות תאים דמויי פיברובלסטים עם דה-רגולציה מאושרת של FABP4 כסמן לדדפרנציאציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בפיתוח מערכות רלוונטיות למחלה עבור חקירה ספציפית למסלולים של פיזיולוגיית האדיפוציטים.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות תרגומית משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות יכולת תרבית ארוכת טווח של תאי שומן שעברו דה-דיפרנציאציה.
- ערך מדעי: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון על ידי הדגמת רב-פוטנציאליות ופוטנציאל להנדסת רקמות של תאי D-fat.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד למחקרים פרה-קליניים, במיוחד עבור תוכניות למחלות מטבוליות ורפואה רגנרטיבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מידול של דה-דיפרנציאציה (dedifferentiation) של אדיפוציטים in vitro.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה (assay) ותוצרי מדידה כמותיים באמצעות בידוד תאים סטנדרטי והערכת מורפולוגיה.
- אנליטיקה: מספקת מדדים מדידים, כגון שינויים בביטוי FABP4, להשוואת מצבי דה-דיפרנציאציה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות הדגמה של תרבית לטווח ארוך ומולטי-פוטנציאליות של אדיפוציטים שעברו דה-דיפרנציאציה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת הניתנת לשימוש חוזר ליצירת תאי גזע ממקור אדיפוציטי במגוון חקרים ספציפיים למאגרי שומן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון במיקום החזוי באמצעות הפחתת עמימות מכניסטית במעבר פנוטיפי של אדיפוציטים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של עיכול בקולגנאז ותרבית הפוכה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לאפיון תכונות מטבוליות ספציפיות למאגר לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization).
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים באמצעות הערכה מאומתת של תנובת תאי גזע ופוטנציאל דיפרנציאציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד אדיפוציטים ראשוניים ובטכניקות עיכול באמצעות קולגנאז.
- מחייב תשתית לתרביות תאים המסוגלת לתמוך בתרביות תקרה בבקבוקים הפוכים או בצלחות 6-בארים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית להשגת תנובת אדיפוציטים עקבית והערכה אחידה של דה-דיפרנציאציה בין מעבדות שונות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול על רקמת שומן ממקורות (depots) שונים או מאפייני תורמים שונים.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון הצורך במילוי מדויק של המדיום למניעת הפרעה על ידי בועות במהלך תרבית הפוכה.
