Name: דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: למדו את שיטת תרבת התקרה לבידוד תאי שומן בוגרים והמרתם לתאי גזע רב-פוטנציאל. הפרוטוקול מייצר אוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי פיברובלסט לחקר פלסטיות תאי השומן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק דיסקברי של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (371697-2011, AT). המחברים רוצים להודות לעזרתם של המנתחים הבריאטריים ד"ר ס. בירון, F-S. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau וכן כריסטין רסין וקרוליין גניון מבנק הרקמות של IUCPQ. אנו מודים למר ז'אק קדורט מהשירותים האודיו-ויזואליים של מחב"א על צילום ועריכת וידאו.

הצהרת אתיקה: הפרויקט אושר על ידי ועדת האתיקה של מחקר IUCPQ לפני גיוס חולה. לצורך המאמר / הווידאו הזה, שהשגנו רקמות מ2 חולים: 1) מטופל זכר 62 שנים ישנות עם BMI של 50.7 קילוגרם / מ 2 ו- 2) מטופלת בת 35 עם BMI של 57 קילוגרם / M 2. ניתן לעשות ניסויים עם שני תאי השומן, אך היו מוגבלים לתא אחד שומן לצורך זה וידאו. היבטים טכניים של הווידאו בוצעו עם מטופל 1 וimmunofluorescence FABP4 בוצע בתאי dedifferentiated מחולה 2. עיבוד 1. לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאל מנתחים לאסוף רקמת שומן מתאי השומן תת עורי וomental בעת הניתוח בריאטרי לפרוסקופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להביא דוגמאות שומן למעבדה בRT ולעבד באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע עיכול במעבדה, באווירה שאינה סטרילי.תאי סופו של דבר הועברו לחדר התרבות וטיפחו בתנאים סטריליים. כדי למנוע זיהום, להכין חיץ KRH עם מים מזוקקים וfiltrated ומעקב על ידי סינון (מסנן 0.22μM) לפני העיכול. צינורות לנקות ביסודיות עם העברה לפני אתנול במכסת מנוע תרבית תאים לבקבוק והכנת צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח רקמת שומן במנה משוקללת מראש ומשקל שיא. תקן את חתיכה קטנה של כל דגימת רקמה (סנטימטר פחות מ 1 2) ב 10% חיץ פורמלין ב RT לפחות 24 שעות לפני הטבעת פרפין. השתמש בדוגמה זו הגלומה לניסויי אימונוהיסטוכימיה (טכניקה לא מוצגת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה בצינור 50 מ&quot;ל ובזק-הקפאה בחנקן נוזלי אחרת לפני האחסון ב -80 ° C למחקרים נוספים ברקמות שומן שלמות (למשל, ביטוי גנים - טכניקה לא מוצג). </li></ol> 2. Collagenase עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פיסת רקמת שומן שנותרה במיליליטר tu 50להיות לעיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מיליליטר של KRH-WB בתוספת collagenase (350 U / ml) לגרם של מדגם בצינור העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר ברקמת שומן במספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים השעיה רקמת שומן טחון שייקרה, 37 ° C, 90 מקסימום סל&quot;ד, לדגירה של 45 דקות (שעה 1 המרבית). </li></ol> 3. טיהור של תאי שומן וPreadipocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון השקוף עם כמה נתחי השומן באמצעות ניילון 400 מיקרומטר רשת לתוך כוס פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פינצטה, לשפשף את הכנת התא ברשת הניילון ולשטוף עם 5 מיליליטר של KRH-WB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את ההשעיה תא filtrated לתוך צינור 50 מיליליטר עם צינורות פלסטיק בזה ומזרק 60cc המצורף בקצה הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו ההשעיה עם adipocytes הבוגרת עומדת על כ 10 דקות, שמאפשרת לתאים כדי להגיע לחלק העליון של המאגר על ידי ציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לשאוב החיץ בחלק התחתון של הצינור באמצעות syrin 60ccיניקת ge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מיליליטר של KRH-WB לשטוף. חזור מצעד 3.4 ל -2 שוטף נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החיץ להביא את ההשעיה adipocyte לנפח סופי של 5 או 10 מיליליטר, בהתאם לכמות תאים. להמשיך עם שלבים בסעיף 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את חלק סטרומה וכלי דם למאגר שנאסף עם מזרק 60cc ידי צנטריפוגה (3,000 סל&quot;ד, RT, 5 דקות) לתרבית תאים עיקריות נוספת אם תרצה בכך (טכניקה לא מוצגת). </li></ol> ספירת תאים 4. למבוגרים adipocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 μl של ההשעיה adipocyte מזועזעת בעדינות בתא ספירה (haemocytometer). לבצע ספירת תאים ארבע פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב מספר התאים בוגרים מבודדים. </li></ol> 5. מבוגרים adipocyte Dedifferentiation לT-25 Flask <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא בקבוק תרבות 2 רקמה 25 סנטימטרים עד ¾ מההיקף עם / F12-20% בסרום עגל DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , על פי ספירת תאים לשפוך 500,000 תאים בוגרים לתוך הבקבוק. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את הבקבוק באמצעות צינור 50 מ&quot;ל עם מדיום לחלוטין ולהסיר בועות רבות ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדפוק את כובע unvented על הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הבקבוק עם אתנול לפני דגירה, כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הבקבוק הפוך במשך שבוע מבלי לגעת בו כדי למנוע תנועה בתרבות שעלולה לשבש את הדבקות סלולרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני היפוך הבקבוק ב 7 ימים של תרבות ההפוכה, בעדינות לתפעל את הבקבוק ולהסיר את כל המדיום בבקבוק על ידי שאיפה, הימנעות תנועות פתאומיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר של סרום עגל% DMEM-F12-20 ולטפח תאים עם טכניקות סטנדרטיים. כובע מסונן, פרק ניתן להוסיף לבקבוק. </li></ol> 6. למבוגרים adipocyte Dedifferentiation לתוך צלחת 6-גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip על החלק התחתון של כל טוב של 6-גם צלחת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף &quot;תותב פלסטיק ½ על גבי כל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא בארות עם 8 מיליליטר של 20% בינוניים עגל סרום-DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים coverslip על כל תותב פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה pipet בין השקופיות והצינור להזרמת תאים שמתחת לסליידר (50,000 תאים לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות בתרבית תאי חממה סטנדרטית על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip ההפוך עם תאים מצורפים לכל תרבות היטב המכיל 2 מיליליטר של תקשורת בתוספת 20% בסרום עגל ולהמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש coverslip עם התאים עוברים dedifferentiation למספר מטרות כוללים immunofluorescence (טכניקה לא מוצגת). </li></ol>

<ol><li>Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceiling+culture+of+mature+human+adipocytes%3A+use+in+studies+of+adipocyte+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions.</a> J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Poloni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dedifferentiated+adipocytes+show+similar+properties+to+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).</li>
<li>Perrini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+and+cytokine+release+profiles+highlight+the+heterogeneity+of+distinct+subsets+of+adipose+tissue-derived+stem+cells+in+the+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans.</a> PLoS One. 8 (3), e57892(2013).</li>
<li>Kishimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoblastic+differentiation+ability+of+human+dedifferentiated+fat+cells+is+higher+than+that+of+adipose+stem+cells+from+the+buccal+fat+pad%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Investig%22%5BJournal%5D)">The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad.</a> Clin Oral Investig. , (2013).</li>
<li>Kou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+and+tissue-specific+nature+of+multipotent+cells+derived+from+human+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+and+human+white+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).</li>
<li>Sugawara, A., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+dedifferentiated+fat+cells+for+periodontal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration.</a> Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).</li>
<li>Kikuta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+effects+of+dedifferentiated+fat+cell+transplantation+in+rabbit+models+of+bone+defect+and+ovariectomy-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis.</a> Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).</li>
<li>Obinata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+%28DFAT%29+cells+improves+urethral+sphincter+contractility+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model.</a> Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+fat+cells+convert+to+cardiomyocyte+phenotype+and+repair+infarcted+cardiac+tissue+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).</li>
<li>Ohta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+cells%2C+dedifferentiated+fat+cells+%28DFAT%29%2C+promoted+functional+recovery+from+spinal+cord+injury-induced+motor+dysfunction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats.</a> Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).</li>
<li>Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Navarrete%2C+JMF-r+%22Adipose+Tissue+Biology%22">Adipose Tissue Biology</a>. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).</li>
<li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+models+for+differentiation%3A+preadipocytes+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%22%5BJournal%5D)">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li>
<li>Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+an+adipose+tissue+depot+for+sampling%3A+factors+in+selection+and+depot+specificity%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity).</a> Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).</li>
<li>Tchernof, A., Despres, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+human+visceral+obesity%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of human visceral obesity: an update.</a> Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).</li>
<li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Watson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Markers+and+Functional+Attributes+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+and+Dedifferentiated+Adipocyte+Cells+from+Subcutaneous+Fat+of+an+Obese+Diabetic+Donor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor.</a> Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Dedifferentiation של תאי שומן בוגרים עם טכניקת תרבות התקרה היא גישה חדשה להשגת תאי גזע שומן ממדגם קטן של רקמת שומן מקומית. בהתבסס על הניסיון שלנו ושל אחרים 2, גרם אחד של רקמה מספיקה לצלחת בקבוק 2 25 סנטימטר ולהשיג אוכלוסייה של תאי DFAT שהומוגניות הודגמה על ידי Poloni ומשתפי פעולה 3. dedifferentiation adipocyte נראה אפשרי עם תאים מכל תורם, באופן בלתי תלוי בגיל, המין והמאפיינים אחרים שלהם. בקרב האוכלוסייה של DFAT הושג התוצאה, נותר כמה עגול תאים מוארכ...

דה-דיפרנציאציה במבחנה של אדיפוציטים בוגרים מושגת באמצעות טכניקה הנקראת תרבית תקרה1. בגלל נטייתם הטבעית לצוף בתמיסות מימיות, אדיפוציטים בוגרים מבודדים נצמדים לפני השטח של בקבוק הפוך מלא במדיום תרבית. במשך כמה ימים, תאים משנים את המורפולוגיה הכדורית שלהם והופכים לתאים דמויי פיברובלסטים. התאים המתקבלים, הנקראים תאי שומן לא מובחנים (DFAT), הם מולטיפוטנטיים2. מאמרי מחקר על דה-דיפרנציאציה של אדיפוציטים, במיוחד על תאים אנושיים, מוגבלים. עם זאת, הם כבר סיפקו מידע מעניין לגבי מולטיפוטנטיות, פנוטיפ תאים ויכולת שכפול של תאי DFAT2. אדיפוציטים בוגרים שמקורם בתאי שומן שונים הובחנו בהצלחה, כולל אלה שמקורם ברקמות שומן קרביות ותת עוריותאנושיות 2-4. בנוסף למחסנים אלה, קישימוטו ומשתפי הפעולה דגמו רקמת שומן מרפידות השומן הבוקאלי ופירקו את האדיפוציטים לתאי DFAT5. מצומוטו ועמיתיו יצרו בהצלחה תאי DFAT תת עוריים מחולים המכסים טווח רחב של גילאים, ולרוב התאים היה שיעור שגשוג גבוה ופחות מ-6% הזדקנות גם לאחר 10 מעברים בתרבית2.
תאי DFAT התמיינו מחדש בהצלחה למספר שושלות, כולל שושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות, כונדרוגניות ונוירוגניות2,3,6. תאים אלה מבטאים מספר סמנים של תאי גזע עובריים כגון Nanog וארבעת הגורמים הפלוריפוטנטיים שזוהו Oct4, c-myc, Klf4 ו-Sox23. הם גם מבטאים סמנים ספציפיים לכל אחת משלוש שכבות הנבט7. בנוסף, תאי DFAT דומים לתאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (MSC שמקורו ב-BM) בהתבסס על החתימה האפיגנטית שלהם3. תוך ניצול קיבולת תאי הגזע של תאי DFAT, קבוצות רבות חקרו את הפוטנציאל שלהם לטפל או לשפר מחלות שונות8,9. שיפורים במצבים פתולוגיים, כגון רקמת לב שבורה, פגיעה בחוט השדרה ותפקוד לקוי של סוגר השופכה, נצפו עם הזרקות תאי DFAT במודלים של חולדות של מחלה10-12. 
בנוסף לתכונות תאי הגזע של תאי DFAT, הם עשויים לייצג מודל תאי חדש למחקרי פיזיולוגיה של אדיפוציטים. קו התאים 3T3-L1 משמש לעתים קרובות למטרה זו מכיוון שתאים אלה מתמיינים לאדיפוציטים דבקים ואוגני שומנים תחת גירוי אדיפוגני13. עם זאת, תאים אלה מקורם ברקמת עובר עכבר13. כמו כן, לא ניתן לחקור את הספציפיות של הדפו באמצעות מודל זה וייתכן שהוא אינו משקף באופן מלא את הפיזיולוגיה של השומן האנושי14. מעבדות אחרות עובדות עם תאי שומן מבודדים ממאגרי שומן עכברים, אך פיזור השומן אינו דימורפי בעכברים והתצורה האנטומית של חלל הבטן של המכרסם מונעת אקסטרפולציה ישירות לבני אדם15. על מנת לחקור אדיפוציטים בהקשר של הפיזיופתולוגיה של השמנת יתר אנושית, התחשבות בחלוקת השומן בגוף והבדלים ספציפיים למאגר השומן הפכה חיונית16. מגבלות מסוימות של תרביות קדם-אדיפוציטים ראשוניות, כולל כמויות תאים המתקבלות מדגימות ביופסיה של רקמת שומן והזדקנותן לאחר מספר מעברים בתרבית, יצרו את הצורך במודלים חלופיים. פריני ועמיתיו חקרו את הספציפיות של מחסן בביטוי גנים של תאי DFAT שמקורם בשומן קרביים ותת-עורי והשוו אותם לתאי גזע שמקורם בשומן (ASC) מאותו מצבור שומן. הם הראו כי הבדלים בביטוי הגנים ובתפקודם נמצאו בעיקר בין מחסנים מאשר בין סוגי תאים, מה שמרמז על כך שתאי DFAT קרובים מבחינה פיזיולוגית ל-ASC מאותו מחסן. תאי DFAT עשויים להוות אלטרנטיבה מעניינת למודלים זמינים למחקרים על התפלגות שומן בפתופיזיולוגיה של השמנת יתר אנושית. יתרה מכך, תרבית תקרה היא שיטה מבטיחה להשגת תאי גזע בוגרים למטרות הנדסת רקמות. 
כאן, אנו מתארים את עיכול הקולגנאז, טכניקה בשימוש נרחב לבידוד אדיפוציטים בוגרים מדגימות השומן התת-עוריות ו/או הקרביים17, ואת השלבים הבאים לביצוע תרבית תקרה ודה-דימינציה של תאים אלה לתאים רב-פוטנטיים, דמויי פיברובלסטים.

<table><tbody><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין</td><td>סיגמא</td><td>A4036</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td>ניתן <td>להשתמש</td></tr> <tr><td>בכל מותגניתן להשתמש בכל מותג MgCl2</td><td></td><td></td>ניתן <td>להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td>ניתן <td>להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr> מסוג <tr><td>I קולגנאז</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS-004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, ללא פנול אדום</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>הוסף לבינוני: 20% סרום עגלים, גנטמיצין (50 ומיקרו; גרם/מ"ל) ו-Fungizone (2.5 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td></tr><tr><td>סרום עגלים, תוסף ברזל, מעגלים שניזונו בפורמולה</td><td>Sigma</td><td>C8056-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>1/2 בתותב פלסטיק</td><td>Iberville</td><td>2704-CP</td><td>מק"ט:1000120918 (הום דיפו)</td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פורמלין סולוטון, ניטרלי חומצי, 10%</td> <td>SIGMA</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה סטרילית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td>סטריליים</tr><tr><td>60 סמ"ק מזרקים</td><td>BD מזרק</td><td></td><td></td>צינורות</tr><tr><td>פלסטיק</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Ringer-Henseleit מאגר מלאי (KRH)</td><td></td><td></td> <td>הכן מאגר מלאי כדלקמן: 25 מ"מ HEPES pH 7.6, 125 מ"מ NaCl, 3.73 מ"מ KCl, 5 מ"מ CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 מ"מ K<תת>2HPO4. התאם את ה-pH ל-7.4.</td></tr><tr><td>Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)</td><td></td><td></td><td>הוסף את הרכיבים הבאים טריים למאגר KRH: 4% אלבומין בסרום בקר, 5 מ"מ גלוקוז, 0.1 ומיקרו; M אדנוזין, 560 ומיקרו; חומצה אסקורבית</td></tr><tr><td>M KRH-WB בתוספת קולגנאז</td><td></td><td></td> מסוג I <td>הוסף 350 U/ml של קולגנאז מסוג I</td></tr><tr><td>T25 בקבוק תרבית רקמות כובע לא מאוורר</td><td>Sarsted או מותג</td><td></td><td></td>אחר</tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 6 בארות</td><td>BD Falcon או מותג</td><td></td><td></td>אחר</tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 22x22</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>כוסות סטריליות</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דור של תאי גזע שומן האדם דרך dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

הוכח כי אדיפוציטים בוגרים הופכים את הפנוטיפ שלהם לתאים דמויי פיברובלסטים במבחנה באמצעות טכניקה הנקראת תרבית תקרה. ניתן לבודד אדיפוציטים בוגרים גם מרקמת שומן טרייה לצורך אפיון ספציפי למחסן של תפקודם ותכונותיהם המטבוליות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס היטב לבידוד אדיפוציטים בוגרים מרקמות שומן באמצעות עיכול קולגנאז, והשלבים הבאים לביצוע תרביות תקרה. בקצרה, רקמות השומן מודגרות במאגר קרבס-רינגר-הנסלייט המכיל קולגנאז כדי לשבש את מטריצת הרקמות. אדיפוציטים בוגרים צפים נאספים על המשטח העליון של המאגר. תאים בוגרים מצופים בבקבוק T25 מלא כולו במדיה ומודגרים הפוך למשך שבוע. גישה חלופית לתרבית צלחות של 6 בארות מאפשרת אפיון של אדיפוציטים העוברים דה-דיפרנציאציה. מורפולוגיה של אדיפוציטים משתנה באופן דרסטי עם הזמן של התרבות. ניתן לבצע אימונופלואורסצנציה בקלות על שקופיות המעובדות בצלחות של 6 בארות כפי שמודגם על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה FABP4. חלבון FABP4 קיים באדיפוציטים בוגרים אך מווסת באמצעות דה-דיפרנציאציה של תאי שומן. דה-דיפרנציאציה בוגרת של אדיפוציטים עשויה לייצג דרך חדשה לטיפול בתאים והנדסת רקמות.

שינויים מורפולוגיים גדולים נוצרים להתבגר adipocytes במהלך dedifferentiation (איור 1). כפי שניתן לראות באיור 2, תאים עוברים dedifferentiation הוכתמו נוגדן אנטי FABP4 לניתוח הקרינה. תאים עם מורפולוגיה עגולה הביעו חלבון FABP4 בעוד רוב התאים כמו פיברובלסטים-לא. לאחר dedifferentiation, יכולים להיות מעובד תאי DFAT עם נהלים סטנדרטיים לכמה קטעים. אנחנו כבר יכולים להגיע ליותר מ -15 קטעים לomental אדם ושורות תאי DFAT תת-עורי (מידע לא מוצג). <p class="jo...

אדיפוציטים בוגרים עשויים להוות מקור שופע לתאי גזע באמצעות דה-דיפרנציאציה, מה שמוביל לאוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי פיברובלסטים. עיכול קולגנאז משמש לבידוד אדיפוציטים בוגרים משומן אנושי. מטרת הפרוטוקול שלנו היא להשיג תאי שומן רב-עוצמתיים ומפורקים מתאי שומן בוגרים אנושיים.

דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

לתאי שומן בוגרים יש את היכולת להפוך לתאים מקדימים in vitro. דבר זה מושג באמצעות תרבית חתומה, טכניקה שבה מתרבים תאים בוגרים בבקבוע הממולא לחלוטין במצע גידול ומגודל כשהוא הפוך. התאים הצפים נצמדים לבקבוע ומשנים את המורפולוגיה שלהם, מתא עגול מלא בליפידים לתא מוארך דמוי פיברובלסט. הומוגני.ניתן להשיג ולטהר אוכלוסיות של תאים מוארכים עם קבלת דגימות הרקמה במעבדה. שקלו רקמות שומן, ובהתאם למספר האדיפוציטים הדרוש, העבירו נפח מתאים של דגימה למבנה של 50 ml לצורך עיכול; ניתן לצפות להשיג כמיליון תאים לגרם רקמה.תרביות תקרה מבוצעות עם 500,000 תאים לכל בקבוקון (flask) של 25 סנטימטר ו-50,000 תאים לכל באר בלוח של שישה בארות. הוסיפו KRH working Buffer מועשר בקוﻻגנאז, קצצו את הרקמה בעזרת מספריים והדגרימו את התכשיר בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות. במהלך הדגירה, הכינו את מערך הצינוריות והמזרק. שפכו את התמיסה השקופה דרך רשת ניילון לתוך כלי זכוכית פלסטיקי בעזרת פינצטה.שפשפו את תכשיר התאים דרך הרשת ושטפו בעדינות עם 5 ml של KRH working Buffer. העבירו את תרחיף התאים המסונן למבחנה של 50 ml באמצעות מזרק. הניחו לאדיפוציטים בוגרים לעמוד למשך כ-10 דקות.התאים יגיעו לחלק העליון של התמיסון באמצעות ציפה. שאבו את התמיסון באיטיות מהחלק התחתון. בעזרת מזרק ופחית, הוסיפו 20 mls של תמיסון עבודה KRH לשטיפה.חזור על שלבי השטיפה פעמיים. אסוף את התמיכה (buffer) כדי להביא את תרחיף האדיפוקיטים לנפח סופי של 5 ml והמשך לספירת התאים באמצעות המוסימטר (hemo cytometer). מלא בקבוק T 25 עד לשלושה רבעים מנפחו ב-D-M-E-M-F 12 מועשר ב-20% calf Serum והעבר 500,000 אדיפוקיטים בוגרים לבקבוק. מלא את הבקבוק במצע גידול עד לסוף והסר בועות אוויר מהמשטח העליון.הברגים פקק המיועד לכך על הבקבוק. הדגר את הבקבוק כשהוא הפוך למשך שבוע אחד באינקובטור לתרביות תאים עם 5% carbon dioxide. הימנע מהזזת הבקבוק, שכן בועות שנותרו עלולות לפגוע בהצמדות התאים.הניחו כיסית זכוכית (cover slip) בתחתית הבארות. הכניסו את התושבת הפלסטית לבארה ומלאו את הבארה ב-8 ml של מצע גידול. ודאו שאין בועות אוויר.הניחו זכוכית כיסוי על גבי התושבת, והשאירו מרווח להחדרת קצה הפיפטה. דגמו 50,000 תאים והזריקו אותם על ידי הנחת קצה הפיפטה בין זכוכית הכיסוי לתושבת. דגרו את הפלטה באינקובטור לתרביות תאים עם 5% carbon dioxide למשך שבוע או פחות.בהתאם לתכנון הניסוי, נדרשים לפחות שלושה ימים כדי שהתאים ייצמדו לכיסוי הזכוכית (cover slip) בתוך פלטה נפרדת. הפכו את כיסויי הזכוכית ב-2 ml של מצע גידול. בתרבית רציפה, ניתן לאחר מכן לקבע את כיסויי הזכוכית בפורמלין לצורך ניסויי אימונופלורסנציה או לצורך מיצוי DNA, RNA וחלבונים.דה-דיפרנציאציה (De-differentiation) של אדיפוציטים בוגרים גורמת לשינויים משמעותיים במורפולוגיה של התא. במהלך תהליך זה, האדיפוציטים מאבדים את הפנוטיפ שלהם ומפגינים ירידה בביטוי של תמלילי RNA הקשורים בדרך כלל לתפקיד אגירת השומן שלהם. תמונת אימונופלואורסצנציה זו מציגה תאי שומן במצבים שונים של דה-דיפרנציאציה.התאים בעלי המורפולוגיה העגולה עדיין מבטאים FABP4, סמן של אדיפוציט בוגר, בעוד שהתאים המוארכים אינם מבטאים אותו עוד, בהסתמך על הספרות המקצועית. ניתן להשיג תאי שומן מבדלים, המכונים לעיתים תאי שומן D, ממטופלים צעירים, מבוגרים, רזים או בעלי השמנה (OB). קיים להם פוטנציאל גידול ארוך טווח ויכולת רב-פוטנציאלית מוכחת.אני מעריך גם את הפוטנציאל שלהם להנדסת רקמות ולתרפיה תאית. הן עשויות להוות מודל חדש לחקירה ספציפית של פיזיולוגיית האדיפוציטים.

generation-human-adipose-stem-cells-through-dedifferentiation-mature

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של שומן הנגזר מתאי סטרומה lipoaspirate ויצירת 4 calvarial פגם קריטי בגודל מ"מ להעריך התחדשות שלד.

תיקון של דגם פגם Calvarial הקריטי בגודל תאי שומן באמצעות נגזרת סטרומה נקטפו מן Lipoaspirate

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי גזע שמקורם בשומן חזיר (pADSC) מרקמות שומן תת עוריות עם בחינת מולטיפוטנטיות. ה-pADSC הרב-פוטנטי משמש לתיחום תהליכים של התמיינות אדיפוציטים ולחקר טרנסדיפרנציאציה לשושלות תאים מרובות של מזנכימה מזודרמית או שושלות נוספות של אקטודרם ואנדודרם למחקרים רגנרטיביים.

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

שינינו את התנאים ליצירת תאי DFAT ומספקים כאן מידע לגבי השימוש במצע גידול משופר לייצור תאים אלה.

שיטה יעילה להשיג תאי Dedifferentiated שומן

הבידול של adipocytes לבן ובייז של רקמת שומן אבות כלי הדם נושא פוטנציאל שיפור חילוף החומרים ההשמנה. נתאר פרוטוקולים של CD34 + CD31 + בידוד תאי אנדותל של שומן אנושי ואת הבאים במבחנה הרחבה, בידול לתוך לבן ובייז adipocytes. הם דנו מספר יישומים במורד הזרם.

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

המטרה של פרוטוקול זה היא לבחון את היכולת של ובתאים נגזר רקמת שומן perivascular האדם להתמיין שושלות תאים מרובים. בידול היה לעומת גזע mesenchymal הנגזרות מח אנושי, אשר ידועה להבדיל לתוך adipocyte, osteocyte ו- chondrocyte שושלות.

בידול קיבולת של האדם-אבי העורקים Perivascular שומן ובתאים

התרבות צבירה בוגרת של הממברנה (MAAC) היא שיטה חדשה לתרבות adipocytes האדם בוגרת. כאן אנו מפרטים כיצד לבודד adipocytes מן האדיפוז האנושית וכיצד להגדיר MAAC.

בידוד ותרבות של האדם Adipocytes בוגרים באמצעות ממברנה מבוגרים תרבויות הצבירה (MAAC)

אנו מתארים האדם 3D מטריקס-adipocyte מערכת תרבות מבחנה המאפשרת ניתוח של התפקידים של מטריקס ואדיפוציטים בתרומה לפנוטיפ רקמה מטבולית של רקמת השומן.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד, התרבות, והאינדוקציה האדיגנית של הרכס העצבי (NCADSCs) מתוך רקמת השומן של ה-Wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים. NCADSCs יכול להיות מקור נגיש בקלות של ADSCs עבור מידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה.

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

הפרוטוקול מאפשר יצירת אוכלוסיית אדיפוציט טהורה מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). חומצה רטינואית משמשת להתמיינות iPSCs לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) המשמשים לייצור אדיפוציטים. לאחר מכן, גישת מיון המבוססת על צביעה אדומה של הנילוס משמשת להשגת אדיפוציטים טהורים.

התמיינות איתנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים לאוכלוסייה טהורה של אדיפוציטים כדי לחקור הפרעות הקשורות לאדיפוציטים

מוצרים קסנוגניים (כימיים או מן החי) שהוכנסו בשלבי ההכנה/מניפולציה של הטיפול התא קשורים לסיכון מוגבר לתגובתיות חיסונית ולהעברה פתוגנית בחולים מארחים. כאן מתוארת שיטה שלמה נטולת קסנוגנים לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי.

בידוד ותרבית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי בשיטה חדשנית נטולת קסנוגניות לטיפול בבני אדם

למדו את שיטת תרבת התקרה לבידוד תאי שומן בוגרים והמרתם לתאי גזע רב-פוטנציאל. הפרוטוקול מייצר אוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי פיברובלסט לחקר פלסטיות תאי השומן.

דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

גלה סרטונים נוספים