Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית
25 בפברואר 2015
keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להקים תרביות אקספלן של קרטוציטים של דג הזברה לשימוש בנדידת תאים קולקטיבית ובמחקרי ריפוי פצעי אפיתל. זה מושג על ידי הסרת קשקשים עם רקמת אפיתל מחוברת מדגי הזברה הבוגרים המורדמים. הקשקשים עם הרקמה המחוברת מונחים בצלחת תרבית כדי לאפשר לתאים להידבק.
לאחר מכן מתווסף מדיום התרבות יחד עם כל הטיפולים המצוינים על ידי התכנון הניסיוני. לבסוף, התאים מודגרים ונצפים על ידי מיקרוסקופ וידאו למסגרת הזמן הרצויה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במגוון בדיקות כדי להדגים שינויים בנדידה או במורפולוגיה תאית, כמו גם ביטוי של חלבונים או סמנים אחרים לאורך זמן.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת, כמו שיטת תרבית התאים הטרנספורמציה, הוא שתרבית אקספלנט היא ראשונית, אשר מתחברת באופן הדוק לתכונות התא in vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ריפוי פצעי האפיתל, כגון תפקיד ההגירה הקולקטיבית ומעבר אפיתל למזנכימלי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהקשקשים עשויים שלא להיצמד למשטח הגידול או לא לצמוח בכל צלחת תרבית נתונה.
מישידגים את ההליך הזה יהיו הסטודנטית לרפואה חוזה ראפ PanIN, חנה TI ואגנס פסקואלה, שתיהן עמיתות מחקר בכירות במעבדה שלי. כדי להתכונן לניסוי זה, יש לכלור כ-1.5 ליטר מי ברז באמצעות חומר הסרת כלור מסחרי או על ידי מתן אפשרות למים לעמוד במשך 24 שעות, ולאחר מכן להשתמש ב-500 מיליליטר כדי למלא כל אחת משלוש כוסות ליטר אחד. סמן אחת להחזקת דגים לפני כל הליך, ושנייה לשחזור לכוס השלישית.
הוסף 100 מיקרוגרם למיליליטר טריקה. להרדמת דגים ממלאים מגש רדוד בקרח. מחממים את התרבות בינונית לטמפרטורת החדר ואוספים פינצטה נקייה של תכשיטנים.
נקו את הפינצטה על ידי טבילת הקצוות באתנול 70% והעברתם דרך מבער בנסן, מה שמאפשר לאתנול להישרף. תפסו את המספר הרצוי של דגים והניחו בכוס אחיזה. מעבירים דג בודד לכוס ההרדמה.
לאחר הרדמת הדג לפי פרוטוקול הטקסט, העבירו אותו לקרח והניחו אותו אופקית כשהזנב פונה ליד האוחזת בפינצטה. כדי להסיר את הקשקשים מקם את הפינצטה במקביל לדג. כשהקצה בקצה הקשקש, לחץ מעט את הצד השטוח של הפינצטה לתוך צד הדג כדי לגרום לקשקשת להתרומם מגוף הדג.
השתמש בפינצטה כדי לתפוס את האבנית, ואז למרוט אותה ובלי להפוך אותה, הנח אותה בצלחת תרבית הרקמה. חזור על ההליך, הסר מקסימום 12 קשקשים ממבוגר גדול, הימנע מאזור הזימים, הקו הרוחבי והסנפירים. הנח את הדג בכוס ההתאוששות ופקח כדי לוודא שהוא מתאושש מהשפעות ההרדמה.
לאחר מכן העבירו את הדג למיכל בודד ואפשרו לדג להתאושש במשך 21 יום כדי לאפשר התחדשות מלאה של האבנית. בהתאם לניסוי, הניחו עד 20 קשקשים לפלסטיק. צלחת מטופלת בתרבית רקמה 35 מילימטר, או ארבעה עד שישה קשקשים לכוס.
מנה תחתונה, הניחו למאזניים להיצמד לתבשיל לפני שמוסיפים בעדינות 1.2 מיליליטר בינוני שלם לכל מנת תרבות. דגירה על תרביות ה-X explan ב-28 מעלות צלזיוס לפרק הזמן הרצוי עם או בלי טיפול לביצוע מיקרוסקופיה. לאחר הוצאת צלחת המכילה יריעות תאים מהחממה, מקם אותה בשלב המיקרוסקופ.
השתמש במטרה של פי ארבעה כדי להתמקד בהתחלה כדי להקל על צילום תמונות לאורך זמן. סמן את המיקום של כל גיליון תאים או את כיוון המנה על הבמה. צלמו את יריעות התא בנקודות זמן שונות בהתאם לפרוטוקול הניסוי, ואם יש צורך רק בתמונות סטילס לניסוי שהוחזרו לאינקובטור.
כדי לתקן דגימות למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, הכינו וחיממו מראש תמיסות בטמפרטורת החדר. כדי לצפות באתרי OSE תחת פלואורסצנטיות, השתמש בכלי תרבית צלחת 35 מילימטר תחתית זכוכית לגידול חצילים כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה, מבלי להסיר את מדיום התרבות, הוסף 0.8 מיליליטר של 4% פרלדהיד ב -1.1 XPBS לכל מנה. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
ואז שאפו את הפתרון. הוסף 0.8 מיליליטר נוסף של קיבוע לכל מנה, ולאחר דגירה שנייה של חמש דקות, שאב את התמיסה. אלא אם כן משתמשים בליגנדים או אפיטופים חיצוניים, חלחל לתאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 0.2% TRITTON X 100 בדגירה אחת של XPBS למשך חמש דקות.
לפני הסרת התמיסה, יש להוסיף 0.5 מיליליטר של 1% BSA ב-XPBS אחד, ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה לאחר הדגירה, לשאוב את התמיסה ולהמשיך בצביעת נוגדנים. לחלופין, הוסף אחד עד שניים מיליליטר של 1% BSA ב-XPBS אחד ואחסן בארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה שבועות. לבצע אימונופלואורסצנטיות.
על פי פרוטוקול הטקסט כפי שמוצג כאן, ניתן לראות יריעות של קרטוציטים נודדים מתחת לסולם תוך שעות מביסוס תרבות EXPLAN. מדי פעם, ניתן להבחין בקרטינוציט נודד בנפרד, שהתנתק מיריעת הנדידה הקולקטיבית. הקצב הראשוני של התקדמות הגיליונות הוא מהיר ביותר, אך קצב זה מואט במהירות ככל שהתאים מתפשטים במהלך 48 השעות הראשונות של התרבית.
העלייה המהירה אינה קשורה לשגשוג תאים מכיוון שלאחר תיוג במשך 24 שעות עם ה-EDU הפלואורסצנטי, כ-10% מהתאים מראים עדות לחלוקת תאים בקצב נמוך בהרבה ממה שנראה בשורות תאים שעברו טרנספורמציה. כאשר הטיפול מתווסף בזמן הקמת X explan, תרכובות מסוימות משנות את נדידת התאים הקולקטיבית. לדוגמה, כפי שמוצג כאן, מעכבי MMP מסוימים מקטינים את שטח גיליון התא לאחר 24 שעות.
בתרבית, כאשר מתווסף למדיום התרבות RGD מסיס המכיל פפטיד כדי לשבש את היווצרות ההדבקה, הצולע בקצה המוביל של היריעה מתכווץ במהירות ובהמשך הקצה הקדמי של היריעה מתנתק ונסוג ופחות משתי דקות כדי להעריך לוקליזציה של חלבונים בתוך היריעה או בתוך תאי ליטר ועוקבים, ניתן לתקן ולהכתים את הסדין כולו כפי שמוצג באיור זה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 10 עד 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להוסיף מצע תרבית חם מראש רק לאחר מתן זמן לצייטים להיצמד לצלחת התרבית בעקבות הליך זה.
ניתן לבצע שיטה אחרת כמו QPCR כדי לענות על כל שאלה נוספת, כגון שינויים בביטוי הגנים ביחס לזמן ו/או למצב הטיפול. לאחר צפייה בהליך זה, אמור להיות לך מושג הרבה יותר טוב כיצד להקים תרביות הסבר IDE לשימוש במגוון הליכים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להקמת תרביות אקספלנט של קרטוציטים מדגי zebrafish, המשמשות כמודל in vitro לחקר נדידה תאית קולקטיבית וריפוי פצעים אפיתליאליים. הפרוצדורה כוללת הסרת קשקשים עם רקמה אפיתליאלית צמודה מדגי zebrafish בוגרים ותרביות שלהם לצורך תצפית על התנהגות התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- נדידת תאים
- ריפוי פצעים אפיתליאלי
- מודלים של דגי זברה
רקע
- קרטוציטים של דגי זברה יכולים לנדוד באופן קולקטיבי.
- הבנת נדידה קולקטיבית היא חיונית למחקר בתחום ריפוי פצעים.
- מודלים בתרביות (in vitro) מספקים סביבות מבוקרות לביצוע ניסויים.
- מיקרוסקופיית וידאו מאפשרת תצפית מפורטת על התנהגות תאים.
מטרת המחקר
- להקמת תרביות ראשוניות של קרטוציטים (keratocytes) מפיסות רקמה של דגי זברה.
- לחקר מנגנונים של נדידה תאית קולקטיבית.
- להערכת מורפולוגיה תאית וביטוי חלבונים לאורך זמן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הסרה של קשקשים עם רקמה אפיתליאלית צמודה מדגי zebrafish.
- הנחת הקשקשים בתוך צלחות תרבית לצורך היצמדות תאים.
- הוספת מצע גידול וטיפולים ניסיוניים.
- אינקובציה ותצפית באמצעות מיקרוסקופיית וידאו.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של תרביות אקספלאנט (explant cultures).
- תצפית על דינמיקה של נדידה תאית קולקטיבית.
- הערכת שינויים במורפולוגיה התאית לאורך זמן.
- הערכת ביטוי חלבונים הקשורים לנדידה.
מסקנות
- שיטת תרביות האקספלנט (explant culture) יעילה לחקר התנהגות קרטוציטים.
- מודל זה יכול להעמיק את ההבנה של ריפוי פצעים אפיתליאליים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון יישומים טיפוליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שתלי קרטוציטים (keratocytes) של דגי זברה מספקים מודל ראשוני in vitro לחקר נדידה תאית קולקטיבית ומעבר אפיתלי-מזנכימלי (epithelial-to-mesenchymal transition), תהליכים הרלוונטיים ישירות לריפוי פצעים בעור ולשיקום רקמות. מערכת זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות טיפוליות על ידי קישור דינמיקת נדידת התאים לשינויים מוגדרים בביטוי גנים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי באימות המטרה. תאימות המודל לקווי דגי זברה מוטנטים וטרנסגניים מאפשרת בחינה מדויקת של תפקוד חלבונים במסלולי נדידה, ובכך מסייעת בקבלת החלטות בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת היפותזות טיפוליות על ידי קישור מנגנוני הידבקות בין תאים למעבר בין מצבי נדידה במערכת ניתנת לטיפול גנטי.
- ערך תפעולי: שימוש בתרביות של שתלי רקמה ראשוניים הדומות מאוד להתנהגות קרטוציטים in vivo, מה שמפחית עמימות תרגומית בתיקוף של מטרות.
- ערך מדעי: הערכה של האופן שבו הפרעות גנטיות משפיעות על נדידה קולקטיבית ועל מעבר אפיטליאלי-מזנכימלי, דבר התומך בהפחתת סיכונים של מטרות תפקודיות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: ביסוס תרביות אקספלנטים (explants) סטנדרטיות וניתנות לשחזור לצורך הערכה כמותית של דינמיקת נדידה ושינויים מורפולוגיים לאורך זמן.
- ערך תפעולי: מתן אפשרות לסריקה של תרכובות המודולות נדידה, כגון מעכבי MMP או פפטידים המשבשים היצמדות, עם השפעות ניתנות לצפייה על שלמות השכבה ודינמיקת הקצה המוביל.
- ערך מדעי: שימוש במיקרוסקופיית וידאו בשיטת time-lapse ובפלואורסצנציה עקיפה (immunofluorescence) ליצירת מדדים רב-פרמטריים לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
מחקרe תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מידול תהליכי רה-אפיתליזציה בריפוי פצעים עוריים, המספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך הערכה פרה-קלינית של מטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: ניטור ביטוי של גנים הקשורים לריפוי פצעים ולדלקת במהלך מעבר אפיתלי-מזנכימלי (EMT), לתמיכה בתיאום של ביומרקרים.
- ערך מדעי: חקר האופן שבו אקספלנטים מאבדים את יכולת הנדידה הקולקטיבית עם הזמן, באופן המשקף מעברים in vivo ומספק מידע לקבלת החלטות על התקדמות המותאמת לסיכון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ובמיוחד עבור אינדיקציות של ריפוי פצעים ופיברוזיס שבהן נדידה קולקטיבית מהווה מנגנון פתוגני מרכזי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על תפקיד ההיצמדות בין תאים בקביעת אופן הנדידה ומבהירה קשרים מולקולריים בין נדידה אינדיבידואלית לקולקטיבית.
- סריקה: מספקת תרביות ראשוניות מוכנות לבדיקה עם פלטיים כמותיים של מהירות נדידה, כיוון, שטח הגיליב ויציבות קדמת החזית תחת טיפולים שונים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים ושינויים בביטוי גנים לאורך זמן, ובכך תומכת בהשוואות תנאים מבוססות נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פנוטיפים של נדידה מוקדמת להמשכיות פרה-קלינית באמצעות ביטוי גנים הקשור לריפוי פצעים, ובכך מסייעת לאסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לחקירת מנגנוני נדידה על רקעים גנטיים שונים, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של מודלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת סיכונים הנובעים מעמימות מכניסטית במסלולי נדידה.
- ערך תפעולי: מציע מערכת תרבית ראשונית סטנדרטית וניתנת לשחזור, עם יישום ניתן להרחבה על פני קווי מוטציות וקווי טרנסגנים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של השפעות המטרה על נדידה קולקטיבית ועל פלסטיות אפיתליאלית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על תיקוף פונקציונלי במודל רלוונטי לריפוי פצעים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, השתלת קשקשים וטכניקות סטריליות לתרביות רקמה.
- תלוי בגישה למתקן zebrafish, אינקובטורים לתרביות, מיקרוסקופיית וידאו ותשתית לפלואורסצנציה עקיפה.
- נחוץ סטנדרטיזציה של תזמון היצמדות הקשקשים ותנאי התרבית בין משתמשים ומעבדות שונות כדי להבטיח תוצאות הדירות.
- שיקולי התאמה כוללים אופטימיזציה של צפיפות הקשקשים וסוג הצלחת (פלסטיק לעומת זכוכית) בהתבסס על דרישות בדיקת הנדידה.
- מגבלות מעשיות כוללות כישלון בהיפרדות הקשקש והצלחה משתנה של הצמיחה החוצה, התלויות במצב הבריאותי של הדג ובמיומנות הטכנית.
