Name: Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: חקור תרביות אקספלנט של קרטינוציטים מדג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית של תאים וריפוי פצעים אפיתליאליים. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה בהתנהגות התאים ומספקת מודל ראשוני הדומה לתנאים פיזיולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמערב התיכונה אוניברסיטת קולג &#39;למדעי בריאות מחקר הנחיית גרנט זכה לEEH ומשרד אוניברסיטת המערב התיכון של מחקר ותוכניות ממומנים ביצוע העצמי גרנט זכה לKJL.

פרוטוקול זה תואם את עקרונות הרווחה AVMA בעלי החיים לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה ואושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה במערב התיכון. 1. הכנת ההרדמה, הציוד, ומדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechlorinate כ -1.5 ליטר של מים ברז או באמצעות סוכן מסחרי dechlorinating (זמין בחנויות לחיות מחמד) או על ידי ומאפשר עמדת מים למשך 24 שעות. להשיג שלוש 1 כוסות L ולמלא כל אחד עם 500 מיליליטר מים dechlorinated. תווית אחת להחזקת דגים לפני כל הליך ואחד להתאוששות. לכוס השלישית, להוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר של methanesulfonate tricaine; זה הופך את הכוס שבדגים יהיו בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מגש רדוד עם קרח, לחמם את מדיום התרבות (1640 RPMI, 10% FBS (בסרום שור עוברי), 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 25 מ&quot;מ HEPES) לRT, ולאסוף פינצטה של ​​צורף נקי. פינצטה נקייה על ידי immerלשיר הטיפים באתנול 70% ועוברים דרך מבער בונזן, המאפשר אתנול לשרוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט אם ההליך יבוצע ללא הגדלה, עם זכוכית מגדלת מסחרית, טבלה עליונה מואר עם 2 - 10X הגדלה, או לנתח מיקרוסקופ (תלוי לחלוטין בהעדפה אישית). </li></ol> 2. הקמת תרבויות explant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את המספר הרצוי של דגים ומקום בכוס אחזקה. העבר את דג בודד לכוס ההרדמה; עדיף להרדים דגים בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקוב אחר ההשפעות של הרדמה על ידי התבוננות תנועת שחייה וזימים של הדג. כהרדמה מתקדמת, תנועת זימים מאטה והדגים ישחו בצורה לא יציב ולעתים קרובות במהופך; לשקול דגים הרדימו בהקדם תנועת זימים מפסיקה. אל תשאירו את הדגים לתקופות ארוכות יותר באמבטיה ההרדמה כמו זה עלול לגרום למותם של הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגים מכוס ההרדמה וההעברהלקרח, הצבת הדגים אופקי עם הזנב מול מחזיקה פינצטה ביד. אם חווה עם הטכניקה ואם דגים מרובים לשמש כדי להפוך את explants, לשקול הצבת הדגים הבאים בכוס ההרדמה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר קשקשים, פינצטה עמדה במקביל לדג עם קצה בקצה קנה המידה. לדכא צד שטוח של פינצטה מעט לצדו של הדג כדי לגרום לקנה המידה לרומם מהגוף של הדג. אחוז בקנה מידה עם פינצטה, למרוט, ומקום (ללא היפוך) בצלחת תרבית רקמה. חזור על התהליך, הסרת מקסימום של 12 קשקשים ממבוגרים גדולים (6 מכל צד), הימנעות אזור הזימים, קו הרוחב, וסנפירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגים לתוך כוס ההתאוששות ולפקח כדי להבטיח שהיא מתאוששת מההשפעות של הרדמה. בשלב זה, ניתן להעביר בחזרה לדגי טנק בודד. לאפשר לדגים להתאושש במשך לפחות 21 ימים כדי לאפשר להתחדשות בקנה מידה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לעיצוב ניסיוני, למקם עד 20 סולמות לכל צלחת שטופלה תרבות פלסטיק 35 מ&quot;מ רקמה או 4-6 קשקשים לכל צלחת זכוכית תחתונה. לאפשר קשקשים לדבוק בצלחת לפני הוספה בעדינות תקשורת כדי לא לנתק את הקשקשים מהצלחת. הערה: עם ניסיון, יכולים להיות מעובד דגים מרובים לפני התקשורת מתווספת למנה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.2 מיליליטר של מדיה מלאה (ראה 1.2 לעיל) לכל מנה 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצוי דגירה תרבויות explant על ​​28 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 לתקופה הרצויה של זמן, עם או בלי טיפול נוסף. לחלופין, דגירה תרבויות על במה מיקרוסקופ מחוממת או בתוך חדר תרבות תא חי למיקרוסקופיה וידאו. </li></ol> 3. Brightfield ומיקרוסקופי וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות עמדה המכילות גיליונות תא לבמה מיקרוסקופ ותחילה להתמקד באמצעות העדשה האובייקטיבית 4X. ניתן להשתמש בהגדלות גדולות יותר, תלוי בניסוי: הערה. סימון המיקום שלכל גיליון תא ו / או נטייה של המנה על הבמה יקל לקחת תמונות לאורך זמן עם הגיליונות בערך באותו הכיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מנות מהחממה ולצלם בנקודות זמן שונות, על פי כל פרוטוקול ניסוי ואת המקום בחזרה לתוך החממה ולו רק תמונות סטילס נדרשות על מסגרת זמן הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת ביצוע מיקרוסקופיה וידאו, לשים לב לדברים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קנה המידה / גיליון התא מתפתח בתוך שדה הראייה כך שגיליון התא הנודד נשאר בשדה הראייה למשך הווידאו. הערה: זה עשוי לקחת קצת ניסיון בהתבוננות כיצד תאים להעביר מתחת לקנה המידה. לקטעי וידאו קצרים, זה פחות דאגה מאשר לקטעי וידאו ארוכים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למסגרות זמן קצרות יותר, דגירה על RT. למסגרות זמן ארוכות יותר (18 + שעות), להשתמש בבמה מחוממת או תא דגירה כדי לשמור על טמפרטורה, איזון pH, וכדי למזער את האידוי של התרבות מ &#39;edium. </li></ol></li></ol> 4. קיבוע לImmunofluorescence מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מראש חמים כל הפתרונות לC ° 28. על מנת לצפות בkeratocytes תחת הקרינה, לגדול תרבויות explant כפי שתואר לעיל באמצעות כלים תרבית רקמת 35 מ&quot;מ זכוכית תחתונה. לחלופין, להשתמש בשקופיות קאמריות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.8 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב1.1x PBS לכל מנה. אל תסיר את התקשורת והתרבות ראשונה. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.8 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב1.1x PBS לכל מנה. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלא אם כן משתמש בligands החיצוני או epitopes החיצונית, תאי Permeabilize על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 0.2% Triton X-100 ב 1X PBS. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר BSA של 1% ב1x PBS ו דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C). הערה: בהתאם לתנאי ניסוי, PHAlloidin ניתן להוסיף בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשאוב כדי להסיר את הפתרון ולהמשיך במכתים נוגדן. לחלופין, לאחסן את הכלים התרבות על ידי הוספה לפחות 1-2 מיליליטר של BSA 1% ב1x PBS ל3-4 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> פרוטוקול 5. Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות נוגדן ראשוניים ומשניים לפי המלצות היצרן. הערה: אם המלצות יצרן אינן זמינות, דילול טוב התחלה של נוגדנים ראשוניים (בBSA 1% ב 1x PBS) היא 1: 500 לpolyclonal ו1: 1,000 לנוגדנים חד-שבטיים; דילול התחלה טוב לנוגדנים משני הוא 1: 1,000. התאם דילולים של המניה המקורית שהתקבלה מהיצרן גבוה יותר אלה אם האות חלש, נמוך יותר אם האות חזק ורקע הוא בעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב BSA 1% בפתרון 1x PBS. הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת נוגדן ראשונית דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הנוגדן הראשוני, מקום לתוך נקי ושכותרתו 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge, ולהקפיא ב -20 ° C. הערה: זה מאפשר לשימוש החוזר של הנוגדן הראשוני, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 - 5 פעמים עם PBS 1x, הסרת ושלכת PBS לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון נוגדנים משני. אם תרצה, להוסיף phalloidin fluorescently שכותרת (להלן הריכוז המומלץ של כל יצרן) בשלב זה. דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C). הערה: שימוש בfluorescently שכותרתו phalloidin מאפשרת הדמיה של סיביים אקטין; מצאנו כי phalloidin 488 שכותרתו עובד הכי טוב בkeratocytes דג הזברה שלנו, אבל יכולה לשמש fluorophores אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורקים את פתרון נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 - 5 פעמים עם PBS 1x, הסרת ושלכת PBS לאחר כל שטיפה. הערה: המנה יכולה להיות מאוחסנת, מכוסה מהאור, ב 4 ° C אם אין אפשרות להתחרותw באופן מיידי; ודא 1x PBS מתווסף לתוך הצלחת לפני האחסון על מנת להבטיח את התאים לא יתייבשו אבל חם לRT (20 - 30 דקות), ולאחר מכן להסיר PBS רק לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן להתבונן, להוסיף 2-3 טיפות של הרכבה בינונית, עם או בלי DAPI, בהתאם לצרכים הניסיוניים, לתוך הצלחת ולתת לשבת במשך 10 דקות ב RT. הערה: אנו משתמשים במדיום זמין מסחרי, המבוסס על גליצרול הרכבה עם DAPI, אך ניתן להשתמש בי תקשורת הרכבה אחרת. המאפשר 10 דקות להרכבה בינונית לשבת בצלחת מאפשר הסרה קלה של coverslip הזכוכית מתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, ללחוץ בעדינות על צידי הצלחת כדי לשחרר ולהסיר את coverslip. להוסיף טיפה נוספת של תקשורת הרכבה על גבי זכוכית ולמקם את coverslip, תאים למטה, לשקופית. הערה: שקול איטום coverslip לשקופית באמצעות ציפורניים ברורות אם השקופית צריכה להיות כל הזמן ליותר מ1-2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לשקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: רוב התמונות שלנו נלקחו באמצעות עדשה אובייקטיבית 40X או 63X תחת טבילת שמן, אבל העדשה האובייקטיבית הספציפית המשמשת יהיו תלויה בפרוטוקול הניסוי. </li></ol>

<ol><li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li>
<li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li>
<li>Lacayo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+large-scale+cell+morphology+and+movement+from+local+actin+filament+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics.</a> PLOS Biology. 5, 233(2007).</li>
<li>Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+locomotion+for+simple-shaped+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of locomotion for simple-shaped cells.</a> Nature. 362, 167-171 (1993).</li>
<li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Movement+of+Cell+Clusters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Movement of Cell Clusters.</a> J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).</li>
<li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+tension+on+protrusive+activity+and+microfilament+and+intermediate+filament+organization+in+an+epidermal+epithelium+moving+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture.</a> The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).</li>
<li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+of+primary+zebrafish+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes.</a> Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).</li>
<li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Zebrafish+as+a+Model+System+for+Cutaneous+Wound-Healing+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).</li>
<li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+pro-inflammatory+cytokines+and+metalloproteinase-1+by+TGF-b1+in+synovial+fibroblasts+from+rheumatoid+arthritis+and+normal+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica.%2C+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals.</a> Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).</li>
<li>Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+MMP-2+expression+and+secretion+change+with+increasing+serial+passage+of+keratocytes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).</li>
<li>Schnaper, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+extracellular+matrix+proteins+and+decreased+expression+of+matrix+proteases+after+serial+passage+of+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells.</a> Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).</li>
<li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+matrix+metalloproteinase%2Ftissue+inhibitor+of+metalloproteinase+production+by+mesenchymal+stromal+cells+in+response+to+inflammatory+cytokines%3A+the+role+of+their+migration+in+injured+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues.</a> Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).</li>
<li>Zimmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts+from+primary+culture+-+primary+culture+cells+markedly+differ+from+fourth-passage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells.</a> Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).</li>
<li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system%3A+differential+gene+expressio.%2C+%26+morphological+changes+support+epithelial%E2%80%93mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li>
<li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFb+%28transforming+growth+factor+b%29+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li>
<li>Barut, B. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease.</a> Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEtchin%2C+J+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).</li>
<li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+P+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).</li>
<li>Yen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+heterogeneity+and+mutational+burden+of+engineered+melanomas+in+zebrafish+models%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models.</a> Genome Biology. 14, R113(2013).</li>
<li>Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+and+Sdf-1+Pathways+Interact+during+Zebrafish+Fin+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration.</a> PLoS One. 4, e5824(2009).</li>
<li>Dufourcq, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+SDF-1+regulates+blastema+formation+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).</li>
<li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632(2012).</li>
<li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415(2013).</li>
<li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Morpholino+Approach+Using+Cardiac+Ventricular+Injection+to+Transfect+Multiple+Difficult-to-target+Tissues+in+the+Zebrafish+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 88, e51595(2014).</li>
<li>Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+expression+of+transgenes+in+adult+zebrafish+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation.</a> BMC Biotechnology. 5, 29(2005).</li>
<li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+collective+migration%2C+leader+keratocytes+generate+tension+in+sheet+and+may+become+follower+or+individually+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells.</a> Experimental Cell Research. In press, (2014).</li>
<li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+revised%3A+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models).</a> The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).</li>
<li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures%3A+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li>
<li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li>
<li>Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marking+zebrafish%2C+Danio+rerio+%28cyprinidae%29%2C+using+scale+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+skin%2C+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li>
<li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li>
<li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li>
<li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellula.%2C+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li>
<li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

השלב הקריטי ביותר להצלחה של תרבות explant keratocyte מאפשר קנה המידה לדבוק בתרבות הצלחת כ 2-3 דקות לפני תוספת של מדיום התרבות. כ -75% מקשקשים ידבק ולגדול גיליונות (מספר התרבויות שנקבעו לגבי כל ניסוי צריך להיות מותאם בהתאם). גיליונות Keratocyte לא יוצרים סביב כל קנה מידה הוסרה מהדגים והניחו בתרבות מכמה סיבות. ראשית, מכתים DAPI של explants מגלה כי כמה קשקשים יש כמה תאים מחוברים ובכך צפוי שהקשקשים אלה לא יהיו לי גיליונות של keratocytes. שנית, היכולת של explants לדבוק בצלחת תרבית הרקמ...

<html> מחקרים של תנועתיות תא התמקדו בעיקר בתאים בנפרד נודדים. Keratocytes תרבית מדגים ודו-חי explants הוכיח להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי לחקור את המנגנונים של תנועתיות תא באמצעות מודלים מתמטיים והן ניסיוניים גישות 1-6. עבודה ניסויית בתאים בנפרד נודדים נעזר בתנועה המהירה, חלקת הגלישה של התאים, תוך שמירה על צורה, מהירות, וכיוון אחיד. עם זאת, in vivo, תאים לעתים קרובות לעבור באופן קולקטיבי, תוך שמירה על צמתים תא-תא, במיוחד בעובר, ריפוי פצעים, וגרורות. לפיכך, נדידת תאים קולקטיבית הוא אזור גידול והבולט יותר ויותר של מחקר בתחום של נדידת תאים. לאחרונה ההגירה הקולקטיבית של תאים אלה תוארה 7 ויש לו תכונות ייחודיות רבות ההופכות אותו למערכת רבת עוצמה כדי לחקור נדידת תאים קולקטיבית במודל ריפוי פצע. &quot;&gt; כאשר מאזניים קטפו מדג זברה מבוגרת בהרדמה, כמה רקמות אפיתל נשארה מחוברת לחלק התחתון של הסולם. כאשר מדיום תרבית תאים הוא הוסיף, תאי האפיתל אלה, או keratocytes ove_content, להעביר במהירות כיחידה קולקטיבית מהסולם. ניתן לצפות בתרבות explant כמודל ריפוי פצע אפיתל, שבו התאים לנדוד הרחק מexplant כפי שהם היו על פני המטריצה ​​הזמנית של פצע המיטה כדי לבסס מחדש את האפיתל ללא פגע. נתונים אחרונים מצביעים על כך שvivo לשעבר זה מחקה תרבות תכונות רבות של in vivo ריפוי הפצע בדג זברה מבוגרת. שיעורי סגירת פצעים 8 לתרגם למהירות הגירה דומה לזה שנצפה במערכת vivo לשעבר 7. בנוסף, בפצע in vivo ריפוי מודל, הטיפול בקומדין מצביע על כך שיש עצירה דימום אין כל השפעה על שיעור של ריפוי, בעוד שהטיפול בהידרוקורטיזון כדי להקטין את התגובה חיסונית לא לעכב reepithelialization 8 </sup&gt;. כדג הזברה אינה לדמם כאשר קנה המידה היא להסיר את בעלי החיים, עצירת דימום הוא לא שחקן מרכזי. למרות שמצאנו תאים חיסוניים בexplants, יש לנו לא בחנו את ההשפעות שאולי יש להם בנדידת תאים קולקטיבית. הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד להקים תרבויות explant keratocyte דג הזברה שלהבטיח עקביות ושחזור לשימוש במבחנים רבים ביולוגיים. תרבויות explant אלה הן משכנעים במיוחד במודל חוץ גופית לנדידת תאים קולקטיבית מכמה סיבות. ראשית, keratocytes דג הזברה הם תאים ראשוניים בשימוש בתוך שעות של הקמת תרבויות explant. לכן, תאים אלה לא עברו שינויים מורפולוגיים וביטוי גנים הקשורים למעבר של תאים ראשוניים 9-13. שנית, מערכת זו מהווה מודל לחקר reepithelialization בתגובה לפציעתם 14 ו, כחלק מהתגובה לפציעה, אפיתל לtr mesenchymalansition תהליך (EMT) הוא יזם כפי שמעיד שינויים בביטוי הגנים וארגון מחדש cytoskeletal 14,15. לפיכך, השינויים בביטוי הגנים הרקע ותנועתיות המתרחשים בתאים שלא טופלו כבר מאופיינים ולספק הקשר לפרש שינויים בטיפול. יתר על כן, keratocyte הדגים וkeratinocyte האנושית הן תפקודיות שווי ערך; שניהם תאי האפיתל העיקריים של מיניהם ולשחק תפקיד מפתח בריפוי פצע אפיתל. דג הזברה שלישית, מבוגר זוכה להכרה כמערכת מודל עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם 16-18 כוללים מלנומה וסוגי סרטן אחרים 19-21, פצע cutaneous ריפוי 8,14 ורקמות התחדשות 22-24. יתרונות טכניים של מערכת מודל זה הם פחות משכנעים. מספר הולך וגדל של קווים מוטנטים ומהונדסים זמינים ללא כוונת רווח, מתקנים מרכזיים. באופן ספציפי, דג הזברה מוטצית הפרויקט (ZMP) בWellcome Trust סנגר המכון שואף ליצור אלל נוקאאוט בכל חלבון קידוד גנטי בגנום דג הזברה. נכון לעכשיו, יש להם מוטציה 11,892 גנים, כ -45% מהגנום, עם 24088 אללים מאופיינים. בנוסף, ZMP מקבל הצעות ויפיק לדפוק outs ללא תשלום. השיטות האחרונות במציאת גן בדג זברה זחל והמבוגר 25-28 לספק גמישות ללמוד את הפונקציה של גנים חשובים מבחינה התפתחותית שלגישות מהונדסים הן בעייתיות או לא מעשיות. בשלהם שיעורים מאוד מהירים של תנועתיות ~ 145 מיקרומטר / hr זמן קצר לאחר הקמתה של תרבויות 29, ניתן להשלים במהירות מבחני (בדרך כלל 24 שעות באו פחות). כפי שניתן הושלמו ניסויים במהירות ובתרבויות לגדול גם ב RT, כמה מהמכשולים הטכניים הקשורים למבחני נדידת תאי יונקים מעורבים מיקרוסקופיה וידאו נמנעים. בנוסף, בגיל של הידוק תקציבי מחקר, zebrafish נשמרים בקלות ובזול. המבנה וההתנהגות של explant הוא מורכב. כדגים לא לדמם כאשר קנה המידה מוסר, אין זה סביר כי הרבה יותר משכבות אפידרמיס השטחיות יוסרו עם הסולם. Keratocytes נראה סוג התא הדומיננטי בexplant כאשר קשקשים לראשונה הוסרו מהדגים כמו הרוב המכריע של תאים מופיעים להכתים עם נוגדן אנטי E-cadherin 14. יתר על כן, אין ראיות של fibroblasts בתרבות הראשונית כמו להישפט על ידי העדר כתמי vimentin על ידי immunofluorescence 14. עם זאת, עם הסרת קנה מידה חוזרת ונשנית, נראה שיש מספר רב של נויטרופילים בexplant (ראה וידאו 1). אנו זיהינו תאים אלה כנויטרופילים המבוססים על תצפיות מורפולוגיים לגודל שלהם, במהירות תנועתיות, והגירתם אל מחוץ לגיליון התא בעת החשיפה לLPS (מידע לא מוצג). בנוסף, תאים אלה כתם בהיר שנינותh נוגדנים לגורם cytosolic נויטרופילים, כמו גם עם מגוון רחב של נוגדני IgG משניים, אשר מציין כי יש להם בשפע FcRs על פני השטח שלהם (מידע לא מוצגים). שכבות תאים מרובות נמצאות בתוך explant. מיקרוסקופיה Confocal חושפת את הנוכחות של שכבה אחת ליד הקצה המוביל ליותר משתי שכבות של keratocytes ליד קנה המידה עם נויטרופילים נראים מעל, מתחת, ובין סדיני keratocyte התא. בנקודות זמן מוקדמות, תאים בקצה לקטב explant הרב שכבתי, ייזום הגירה קולקטיבית של keratocytes מexplant בשיעורים ראשוניים של ~ 145 מיקרומטר / hr. האזור המכוסה על ידי explant מגדיל במהירות, מה שמוביל לתא התפשטות, מתח בתוך גיליון, ושיעור ירידה במראש של הקצה קדמי. interconversions המהיר בין תאי מנהיג וחסיד הם נצפו בקצה המוביל במהלך ההיווצרות וסגירת חורים שנוצרו באופן ספונטני בתוך גיליון 7. כתהליך EMT יזם עם explant ממשיך, הברים וכו &#39;וkeratocytes לאבד תנועתיות מיוחדת, המהירה. ביטוי גנים ושינויים מורפולוגיים בקנה אחד עם EMT, ריפוי פצעים, ותגובות דלקתיות להתרחש תוך 7 ימים של תרבות עם explants נשקלים קיימא עבור כ 10 ימים 14.

<table><tbody><tr><td>כלי תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ (מצופה ליזין Poly-D)</td><td>עובי MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>1.5 מ"מ הוא הטוב ביותר להסרת כיסוי. קוטר 14 מ"מ מספק שטח תרבות גדול יותר.</td></tr><tr><td>מלקחיים בסגנון תכשיטנים שוויצריים, אינטגרה, Miltex 17-303</td><td>VWR</td><td>21909-460</td><td>אנו מוצאים כי מלקחיים צרים ועדינים עובדים בצורה הטובה ביותר להסרת אבנית.</td></tr></tbody></table>

explants keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וreepithelialization בריפוי פצע עורית

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

בשל המאפיינים הייחודיים שלהם ניע, keratocytes הדגים ניתק מתרבויות explant כבר מזמן משמשות כדי לחקור את המנגנונים של נדידת תאים בודדת. עם זאת, כאשר explants הוקם, תאים אלה גם לנוע באופן קולקטיבי, שמירה רב של התכונות ההופכות את פרט keratocytes מודל אטרקטיבי ללמוד הגירה: שיעורים מהירים של תנועתיות, lamellae אקטין עשיר נרחב עם כבל אקטין בניצב, ומהירות קבועה יחסית ו כיוון ההגירה. בexplants המוקדם, הדדי המהירה של תאים נודדים באופן אישי עם אלה נודדים באופן קולקטיבי מאפשר הלימוד של התפקיד של הידבקויות תאי תאים בקביעת המצב של הגירה, ומדגיש את הקישורים המולקולריים בין שני המצבים של הגירה. תאים בexplants מאוחר יותר לאבד את היכולת שלהם לנוע במהירות ובאופן קולקטיבי כאפיתל מעבר mesenchymal מתרחש וגנים הקשורים לריפוי פצעים ודלקת באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. לפיכך, explants keratocyte יכול לשמש כמודל במבחנה לreepithelialization המתרחש במהלך ריפוי פצע עורי ויכול לייצג את מערכת ייחודית ללמוד מנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של תכנית מוגדרת של שינויי ביטוי גנים. מגוון רחב של קווי דג הזברה מוטציה ומהונדסים זמין, המאפשר explants שיוקם מדגים עם רקע גנטי שונה. זה מאפשר את התפקיד של חלבונים שונים בתוך תהליכים אלה יש לטפל באופן ייחודי. הפרוטוקולים המפורטים כאן מתארים שיטה קלה ויעילה להקמת תרבויות explant אלה לשימוש במגוון רחב של מבחני הקשורים לנדידת תאים קולקטיבית.

כפי שמודגם באיור 1, גיליונות של keratocytes ניתן לצפות נודדים החוצה מתחת לקנה המידה בתוך שעות של הקמת תרבות explant. מדי פעם, יכול להיות שנצפה keratocyte בנפרד נודדת שהתנתק מהגיליון הנודד באופן קולקטיבי. בנוסף, כexplant הוקם מדגים שנתלשו בעבר, יש בשפע נויטרופילים הנודדים דרך גיליון. בתקופות ארוכות יותר תרבות, הברים וכו &#39;keratocyte כתאים עוברים EMT 14. שיעוריו הראשוניים של קידום גיל...

keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.

Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להקים תרביות אקספלאנט (explan) של קרטוציטים מדגי zebrafish לשימוש במחקרי נדידה תאית קולקטיבית וריפוי פצעים אפיתליאליים. הדבר מושג תחילה על ידי הסרת קשקשים עם רקמה אפיתליאלית צמודה מדגי zebrafish בוגרים תחת הרדמה. הקשקשים עם הרקמה הצמודה מונחים בצלחת תרבית כדי לאפשר לתאים להיקשר.לאחר מכן מוסיפים את מצע התרבית יחד עם כל טיפול שנקבע בתכנון הניסויי. לבסוף, התאים מדגברים ונצפים באמצעות מיקרוסקופיה של וידאו לאורך פרק הזמן הרצוי. לבסוף, ניתן להשתמש במגוון בדיקות כדי להדגים שינויים בנדידה או במורפולוגיה התאית, כמו גם ביטוי של חלבונים או סמנים אחרים לאורך זמן.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת תרביות של תאים שעברו טרנספורמציה, הוא שתרביות של אקספלנטים (explant cultures) הן ראשוניות, ובכך הן דומות במידה רבה לתכונות של תאים in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ריפוי פצעים אפיתליאליים, כגון תפקידה של נדידה קולקטיבית ומעבר אפיתליאלי-מזנכימלי (epithelial to mesenchymal transition). באופן כללי, מי שאינו מנוסה בשיטה זו עשוי להיתקל בקשיים, כיוון שקשקשים עשויים שלא להיקשר למשטח הגדילה או לא לצמוח בצלחת תרבית נתונה.את הפרוצדורה זו ידגימו Jose Rap PanIN, סטודנט לרפואה, ו-Chana TI ו-Agnes Pasquale, שתיות עמיתות מחקר בכירות במעבדתי. כדי להתכונן לניסוי זה, הסִירו את הכלור מכ-1.5 liters של מי ברז באמצעות חומר להסרת כלור מסחרי או על ידי השארת המים למשך 24 שעות, ולאחר מכן השתמשו ב-500 milliliters למילוי של כל אחד משלושה כוסי כימיה בנפח של one liter. סמנו כוס אחת להחזקת הדגים לפני הפרוצדורה, וכוס שניית לשלב ההתאוששות, בעוד הכוס השלישית תשמש למטרה אחרת.הוסיפו 100 µg/mL של trica. להרדמת הדגים, מלאו מגש רדוד בקרח. חממו את מצע התרבית לטמפרטורת החדר והכינו פינצטות צורפים נקיות.נקו את הפינצטה על ידי טבילת הקצוות ב-70% ethanol והעברתם מעל מבער בנזן, כדי לאפשר לאתנול להישרף. תפסו את מספר הדגים הרצוי והניחו אותם בכלי קיבול.לאחר הרדמת הדג לפי הפרוטוקול הכתוב, העבירו אותו לקרח והניחו אותו בצורה אופקית כאשר הזנב פונה ליד המחזיקה את הפינצטה. להסרת הקשקשים, מקמו את הפינצטה במקביל לדג. כאשר הקצה נמצא על שולי קשקש, לחצו קלות בעזרת הצד השטוח של הפינצטה אל דופן הדג כדי לגרום לקשקש להיגבה מגופו של הדג.השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את הקשקש, לאחר מכן שלפו אותו והניחו אותו בתוך צלח תרבית הרקמה מבלי להפוך אותו. חזרו על הפעולה, תוך הסרה של מקסימום 12 קשקשים מדגיג בוגר, תוך הימנעות מאזור הזימים, קו הצד והסנפירים. הניחו את הדג בכוס התאוששות ועקבו כדי לוודא שהוא מתאושש מהשפעות ההרדמה.לאחר מכן, העבירו את הדג לאקווריום פרטי והניחו לו להתאושש במשך 21 ימים כדי לאפשר התחדשות מלאה של הקשקשים. בהתאם לניסוי, הניחו עד 20 קשקשים בכל צלחת פלסטיק לתרביות רקמה בקוטר 35 מילימטר, או ארבעה עד שישה קשקשים בכל צלחת זכוכית.בבית הגידול התחתון, המתינו עד שהקשקשים יידבקו לכלי לפני הוספה עדינה של 1.2 milliliters של מצע מלא לכל כלי תרבית. דגרו את תרביות ה-X explan בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך פרק הזמן הרצוי, עם או ללא טיפול, לצורך ביצוע מיקרוסקופיה. לאחר הוצאת כלי המכיל שכבות תאים מהאינקובטור, הניחו אותו על במת המיקרוסקופ.השתמש בעדישה פי 4 כדי לבצע מיקוד ראשוני, במטרה להקל על צילום התמונות לאורך זמן. סמן את מיקום כל גלה של תאים ו/או את כיוון הצלחת על הבמה. צלם את גללי התאים בנקודות זמן שונות בהתאם לפרוטוקול הניסוי, ובמידה ונדרשות תמונות סטטיות בלבד עבור הניסוי, החזר את הצלחת למדגרה.כדי לקבע דגימות עבור מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה, הכין וחמם מראש תמיסות בטמפרטורת החדר. לצורך צפייה באתרים של OSE תחת פלואורסצנציה, השתמש בצלחות תרבית בעלות תחתית זכוכית של 35 מילימטר לגידול חצאיים כפי שפורט קודם לכן בסרטון זה; מבלי להסיר את מדיום התרבית, הוסף 0.8 מיליליטר של 4%paraformaldehyde ב-1.1 XPBS לכל צלחת. הדגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.לאחר מכן, שאפו את התמיסה. הוסיפו 0.8 מיליליטר נוספים של מקבע לכל צלחת, ולאחר דגירה שנייה של חמש דקות, שאפו את התמיסה. אלא אם כן נעשה שימוש בליגנדים או באפיטופים חיצוניים, בצעו פרמיאציה לתאים על ידי הוספה של 0.5 מיליליטר של 0.2%TRITTON X 100 ב-XPBS אחת, ודגרו למשך חמש דקות.לפני הסרת התמיסה, הוסיפו 0.5 milliliters של 1%BSA ב-one XPBS, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת או ב-4°C למשך לילה. לאחר ההדגרה, שאבו את התמיסה והמשיכו בצביעה בנוגדנים. לחלופין, הוסיפו 1 עד 2 milliliters של 1%BSA ב-one XPBS ואחסנו ב-4°C למשך שלושה עד ארבעה שבועות. בצעו אימונופלואורסצנציה.בהתאם לפרוטוקול הכתוב כפי שמוצג כאן, ניתן להבחין בדפי קרטוציטים הנודדים ממתחת לקשקש בתוך שעות מרגע הקמת תרבית ה-EXPLAN. לעיתים ניתן להבחין בקרטינוציט בודד הנודד באופן עצמאי, לאחר שהיפרד מהדף הנודד באופן קולקטיבי. קצב ההתקדמות הראשוני של הדף הוא מהיר ביותר, אך קצב זה מואט במהירות ככל שהתאים מתפשטים במהלך 48 השעות הראשונות של התרבית.העלייה המהירה אינה קשורה לשגשוג תאים, שכן לאחר סימון למשך 24 שעות באמצעות EDU פלואורסצנטי, כ-10% מהתאים מראים עדות לחלוקה תאית – קצב נמוך בהרבה מזה הנראה בקווי תאים טרנספורמיים. כאשר מוסיפים טיפול בעת הקמת ה-explan, תרכובות מסוימות משנות את נדידת התאים הקולקטיבית. לדוגמה, כפי שמוצג כאן, מעכבי MMP מסוימים מקטינים את שטח גילי התאים לאחר 24 שעות.בתרבית, כאשר מוסיפים למצע התרבית פפטיד מסיס המכיל RGD כדי לשבש את היווצרות ההיצמדות, הלאמלה (lamella) בקצה המוביל של הגילייה מתכווצת במהירות, ובעקבות כך קצה הגילייה ניתק ונסוג תוך פחות משתי דקות. כדי להעריך את מיקום החלבונים בתוך הגילייה או בתוך תאי המובילים ותאי העוקבים, ניתן לקבע ולצבוע את כל הגילייה כפי שמוצג בדמות זו. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה תוך 10 עד 15 דקות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להוסיף מצע תרבית שחומם מראש רק לאחר מתן זמן מספיק לתאים להיצמד לכלי התרבית בעקבות פרוצדורה זו.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון QPCR, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון שינויים בביטוי גנים ביחס לזמן ו/או לתנאי הטיפול. לאחר צפייה בהליך זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה בהרבה לגבי האופן שבו מקריאים תרביות IDE explan לשימוש במגוון פרוצדורות.

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

תאים מתים נמתחים מרקמות אפיתל על ידי התכווצות מתואמת של תאים שכנים מבלי לשבש תפקוד מחסום. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטות לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל ברזולוציה הסלולר.

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזחלי דג הזברה.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פגיעה מכנית בכלי דם בעוברי דג זברה. מודל פציעה זה מספק פלטפורמה לחקר המוסטזיס, דלקת הקשורה לפציעה וריפוי פצעים באורגניזם המתאים באופן אידיאלי למיקרוסקופיה בזמן אמת.

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

אנו מציגים פרוטוקול ללכידת הדינמיקה של התחדשות סנפיר זנב זחל דג הזברה בקנה מידה של רקמה שלמה באמצעות סטריאומיקרוסקופיה מבוססת שדה בהיר. טכניקה זו מאפשרת ללכוד את דינמיקת ההתחדשות ברזולוציית תא בודד. ניתן להתאים מתודולוגיה זו לכל סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת CCD ותוכנת זמן-lapse.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

מתואר כאן הקמת מודל ניתוח קטרקט מדומה ex vivo רלוונטי מבחינה קלינית שניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנונים של תגובת הפגיעה של רקמות אפיתל בתוך המיקרו-סביבה הטבעית שלהן.

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

כתב יד זה מתאר את zWEDGI (דג זברה Wounding והתקן מלכודת צמיחה, הדמיה), אשר הוא מכשיר ממודר שנועדה אוריינט לרסן את הזחלים דג זברה. העיצוב מאפשרת חיתוך זנב ארוך טווח אוסף של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה של ריפוי הפצע והתחדשות.

התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לביצוע הדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקת קולטן כימותרפיה בנויטרופילים של דגי...

הדמיה חיה של קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה במהלך תגובות לפצעים

explants blastoderm דגי זברה נוצרים על ידי בידוד תאים עובריים ממרכזי איתות אנדוגני בתוך העובר המוקדם, ומייצרים אשכולות תאים נאיביים יחסית מניפולציה בקלות ו ex vivoתרבית . מאמר זה מספק הוראות להכנת explants כאלה ומדגים את התועלת שלהם על ידי חקירת תפקידים עבור נודל איתות במהלך gastrulation.

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

פרוטוקול זה מתמקד בפגיעה במשטח העין של דגי הזברה באמצעות שחיקה כדי להעריך את סגירת הפצעים הבאים ברמה התאית. גישה זו מנצלת בר עיני כדי להסיר חלקית את אפיתל הקרנית ומשתמשת במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה של התא במהלך סגירת הפצע.

ריפוי פצעים בקרנית דגי זברה: משחיקה לניתוח הדמיה לסגירת פצעים

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פצעים באפיתל של מדוזה חיה של Clytia hemisphaerica וריפוי פצעים ברזולוציה גבוהה in vivo. בנוסף, מוצגת טכניקה להחדרת צבעים ותרופות להפרעות לתהליכי איתות בתאי האפיתל ובמטריצה החוץ תאית במהלך ריפוי פצעים.

אפיון ריפוי פצעי אפיתל in vivo באמצעות אורגניזם המודל הקנידרי Clytia hemisphaerica

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

חקור תרביות אקספלנט של קרטינוציטים מדג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית של תאים וריפוי פצעים אפיתליאליים. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה בהתנהגות התאים ומספקת מודל ראשוני הדומה לתנאים פיזיולוגיים.

Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

גלה סרטונים נוספים