מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות
21 בפברואר 2015
פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להבדיל בין תאי אב עצביים לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, על מנת להניב אוכלוסיית תאים עצביים חזקה ומשוכפלת, אשר עשויה לשמש לזיהוי מסלולי ההתפתחות התורמים לפתוגנזה של מחלות בהפרעות נוירולוגיות רבות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק תאי מוצא עצביים או NPCs מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים או hiPSCs, כפלטפורמה למחקר של המנגנונים התאיים והמולקולריים התורמים למחלות נוירולוגיות. דבר זה מושג תחילה על ידי גדיעת hiPSCs באמצעות מעכבי smad דואליים לכדי רוזטות עצביות. השלב השני הוא קצירת רוזטות עצביות אלו ואפשרתן לגדול לאוכלוסיות NPCs ניתנות להרחבה.
בשלב הבא תבוצע התמרה לנטיוויראלית באמצעות זיהום בסבב (spin infection). שלב זה לשיפור היעילות משמש למניפולציה של ביטוי גנים. השלב הסופי הוא גידול של ה-NPCs בתרחיף, כך שהם ייווצרו באופן ספונטני כנוירוספירות.
בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפלטפורמה זו כדי לבחון מגוון של פנוטיפים תאיים. לדוגמה, מדידת ההשפעה של מניפולציה גנטית על נדידת נוירונים. כך שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנונים תאיים כגון נדידה.
ניתן להשתמש בשיטה זו גם למחקר של תהליכים ביולוגיים אחרים, כגון רפליקציה, עקה חמצונית (oxidative stress), אפופטוזיס וצמיחת נוריטים. דיפרנציאציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים (hiPSCs) או תאי PSCs גבוהים מובילה להיווצרות של רוזטות עצביות (neural rosettes) נראות לעין, המאופיינות כצבירים עגולים של תאי נוירו-אפיתליום עם קוטביות אפיתליאלית-בזאלית, לצורך בחירה אנזיםטית של רוזטות עצביות ביום ה-14. שאבו את המצע מהגופים העובריים (embryoid bodies או ebs) ההודבקים והוסיפו 1 mL של ריאגנט לבחירת רוזטות עצביות לכל באר בלוח של 6 בארות; הדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.
לאחר שעה אחת, השתמשו בפיפטמן P 1000 כדי להסיר בעדינות את האנזים מכל באר והוסיפו 1 mL של D-M-E-M-F 12 לכל באר. כדי לשטוף את הרוזטות, אספו את ה-1 mL של D-M-E-M-F 12 והחזירו אותו במהירות לבאר, ובכך נתקו את הרוזטות מהפלטה.
אספו את הרוזטות אל תוך מבחנה מסוג פלקון. פפטו 1 mL נוסף של D-M-E-M-F 12 והוסיפו אותו במהירות לאותה באר כדי לנתק את הרוזטות שנותרו. אין לבצע טריטורציה (trituration) והשתדלו שלא לפרק את מקבצי הרוזטות. אספו את הרוזטות העצביות לאותה מבחנת פלקון.
ניתן להוסיף כמות גדולה יותר של האנזים ולחזור על הליך זה אם הרוזטות אינן נפרדות בקלות לאחר איסוף כל הרוזטות העצביות. סובבו את מבחורת הפלקון (Falcon) ב-300 G למשך שלוש דקות. שאבו את תמיסת השטיפה ובצעו רספנדסיה (resuspend).
השעו את השושנות (rosettes) בשני מיליליטרים של מצע גידול לתאי מוצא עצביים. העבירו את התאים לפלטה בעלת שישה בארות המצופה ב-poly L ornithine laminate, וגדלו בטמפרטורה של 37 °C למשך שבוע. במעבדה זו, תאי מוצא עצביים או NPCs גודלים על פלטות matrigel, מקבלים תזונה מדי יומיים ונשמרים בצפיפות גבוהה מאוד.
כדי לפצל את ה-NPCs, ראשית שאיפו את המצע ולאחר מכן הוסיפו 1 mL של accutane חם לכל באר בפלטה של שש בארות; הדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 15 דקות. העבירו בעדינות את התאים שהסתלקו למבחנה של 15 mL המכילה D-M-E-M-F 12 תוך הפעלת מינימום של מאמץ מכני. אין לבצע טריטורציה (trituration) לתאים. השקיעו את התאים הנמצאים בכדור האנזים על ידי סבוב ב-1000 ×g למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאיפו את העלייה (supernatant) ושחזרו את ה-NPCs.
בכ-1 mL של מצע NPC לכל באר מקורית של פלטת 6 בארות, צפויות כ-5 עד 10 מיליון תאים לכל באר מלאה (confluent) בפלטת 6 בארות לאחר השהייה מחדש וספירת תאים. כדי לתחזק את ה-NPCs, השתמש ב-1 עד 2 מיליון תאים לכל באר בפלטת 6 בארות. יעילות היווצרות הנוירוספירות משתנה בין ניסויים וקווי תאים, אך בדרך כלל היא מיטבית כאשר מושבים בין 200,000 למיליון תאים לכל באר בפלטה לא-דבקה (nonadherent) בעלת 6 בארות; אם מתרחשת התגבשות (clumping), יש להפחית את מספר התאים המושבים. הזריעה רצוי שתתבצע בתוך יום עד יומיים לאחר הפיצול.
יש להעביר את ה-NP NPCs באמצעות וקטורים לנטיויראליים או רטרוויראליים כדי להעלות את אחוז התאים שעברו טרנספקציה. השתמשו בשיטת spin infection. שאבו את המצע מכל באר והחליפו אותו בלנטיווירוסים או רטרוויראליים רלוונטיים לביטוי 과-ביטוי (overexpression) או לבקרות, המדללים לריכוז (titer) התואם את ריבוי הזיהום (multiplicity of infection) הרצוי.
במדיה NPC, השתמשו ב-1.5 milliliters לכל באר בלוחית בעלת שש בארות; סובבו ב-1000 G ובטמפרטורת החדר במשך שעה אחת בצנטריפוגה ללוחיות. לאחר הסבוב, החזירו את הלוחית לאינקובטור כדי להפחית את תמותת התאים. החליפו את המדיה בתוך שמונה שעות מהסבוב וההדבקה.
התחילו את הפרוצדורה על ידי שטיפה חד-פעמית של ה-NEUROSPHERES המופקים מ-NPC במצע NPC כדי להסיר פסדתיים תאיים. הטו את הפלטה בזווית של 45 מעלות ואפשרו ל-neurospheres לשקוע, ולאחר מכן הסירו כמה שיותר מצע מבלי לשאוב את ה-neurospheres. החליפו במצע טרי.
בשלב הבא, בחרו ידנית את ה-NEUROSPHERES הגזורות מ-NPC תחת מיקרוסקופ באמצעות פיפט P 200 והעבירו נוירוספירה אחת לכל באר בלוח 96 בארות מצופה ב-matrigel. חשוב לבחור נוירוספירות בגדלים דומים כדי להפחית את השונות בתוצאות. הוסיפו 0.5 milligrams נוספים של matri gel המדולל במצע NPC קר אל הנוירוספירות בכל לוח 96 בארות.
בעזרת טיפ של פיפט, מרכזו ידנית כל כדור עצבי (neurosphere) במרכז הבאר. אפשרו להגירה של כדורי העצב להתרחש במשך 48 שעות. לאחר קיבוע וצביעה של התאים עם הסמנים האימונוהיסטוכימיים הרצויים, צלמו את כדורי העצב במלואם באמצעות עדשת מיקרוסקופ Forex. למדידת ההגירה הרדיאלית, השתמשו בתוכנת Image J.
השתמשו בכלי הבחירה החופשית (freehand selection tool) כדי לעקב ידנית את קו הגבול של התאים שהתרחלו למרחק הרב ביותר. ודאו שהאפשרות area מסומנת בחלון המדידות (set measurements window) הנמצא תחת לשונית analyze. לאחר מכן, השתמשו בפונקציית המדידה (measure function) כדי לחשב את השטח של הצורה שהתקבלה.
השתמשו בערך מדידת השטח ובנוסחה לשטח מעגל כדי לקבוע את הרדיוס החיצוני באופן דומה, ועקבו אחר קצה הכדור הנוירונלי המקורי. מדדו את השטח וחשבו את הרדיוס הפנימי. חשבו את סך הגירה הרדיאלית כהפרש בין הרדיוסים החיצוני והפנימי.
תמונות אלו מציגות את שלבי ההבדלה העצבית של PSCs ריכוז גבוה, מ-PSCs ריכוז גבוה לגופי עובר (embryo bodies), רוזטות עצביות, NPCs ונוירונים מאומתים. NPCs מבטאים את סמן ה-NPC Nestin ואת גורם השעתוק של תאי גזע עצביים SOX2 ברוב התאים. צביעת Beta III tubulin נראית גם היא בכל אוכלוסיות ה-NPCs. NPCs מבטאים בנוסף את גורם השעתוק של תאי גזע עצביים PAX6 ואת סמן הפרוגניטור של המוח Pax6.
TBR2, אך לא סמני מוח אמצעי כגון LMX1A ו-FOXA2. NPCs באיכות גבוהה מ-PSC יכולים להתמיין ל-70% עד 80% נוירונים חיוביים ל-beta three tubulin המוצגים בירוק ו-20% עד 30% אסטרוציטים חיוביים ל-glial fibrillary acidic protein המוצגים באדום. NPCs באיכות גבוהה מביעים nestin ו-SOX2 ברוב התאים, בעוד שב-NPCs באיכות נמוכה קיימים מגוון תאים שליליים ל-SOX2 ושליליים ל-nestin בלבד. נוירונים בני ארבעה שבועות שהתמיינו מ-NPCs באיכות גבוהה מביעים map2AB ו-beta three tubulin.
בעקבות טרנסדוקציה מוצלחת עם וקטור לנטיבירי או רטרובירי בעל titer גבוה, יותר מ-80% מהתאים מסומנים על ידי הרפורטר הפלואורסצנטי. יצירת נוירוספירות (neurospheres) באמצעות הווקטור המגולמים בתוכנית מניבה אוכלוסייה של נוירוספירות בגודל הומוגני יחסית, שיכולות להישאר בריאות בתרבית למשך כשבוע.
עם הזנה סדירה, הגירה של neurospheres מתרחשת בצורה רחבה ב-neurospheres בריאות, כפי שמודגם בתמונות brightfield אלו לפני ואחרי 48 שעות של הגירה ב-matrigel לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסכיזופרניה לבחון הגירה עצבית ב-NPCs המופקים מתאי גזע אנושיים מושריים (iPSC). זכרו כי עבודה עם רטרו-וירוס עלולה להיות מסוכנת, וכל עבודת תרבית רקמה צריכה להתבצע בתנאי BSL-2+ כאשר קיים חשש לנוכחות וירוס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הגזרת תאי מוצא עצביים (NPCs) מתאי גזע אנושיים פלוריפוטנטיים מושריים (hiPSCs) לצורך חקר מחלות נוירולוגיות. התהליך כולל ייצור של NPCs שניתן להרחיב ולעבד למטרות מחקר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאי גזע
- הפרעות נוירולוגיות
רקע
- תאי גזע פלוריפוטנטיים המושגים מבני אדם (hiPSCs) יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים.
- תאי אב עצביים (NPCs) הם חיוניים לחקר התפתחות המוח ומחלות.
- הבנת נתיבי ההתמיינות של NPCs יכולה לספק תובנות לגבי הפרעות נוירולוגיות.
- פרוטוקול זה נועד ליצור מקור מהימן של NPCs למחקר.
מטרת המחקר
- ליצירת NPCs מתוך hiPSCs לצורך חקר מחלות נוירולוגיות.
- לבחינת מנגנונים תאיים ומולקולריים המעורבים בפתוגנזה של מחלות.
- לספק פלטפורמה למחקרים עתידיים על הפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיפרנציאציה של hiPSCs לוורוזטות נוירונליות באמצעות מעכבי dual SMAD.
- קציר של ורוזטות נוירונליות להגדלת אוכלוסיות NPC הניתנות להתרחבה.
- טרנסדוקציה לנטיביריאלית באמצעות spin infection למניפולציה של ביטוי גנים.
- גידול של NPCs בתליה ליצירת נוירוספירות.
תוצאות עיקריות
- ביצוע דיפרנציאציה מוצלחת של NPCs מ-hiPSCs.
- הקמת אוכלוסיות NPC ניתנות להרחבה לצורכי מחקר.
- הדגמת היעילות של טרנסדוקציה לנטיוויראלית.
- NPCs הצמיחו נוירוספירות בתרבית סספנסיה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה להפקת NPCs מ-hiPSCs.
- ניתן להשתמש ב-NPCs כדי לחקור את המנגנונים של מחלות נוירולוגיות.
- גישה זו יכולה לסייע במחקרים נוספים על אסטרטגיות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
שיטה זו מאפשרת למחלקות מו"פ בביופרמצבטיקה למדל אירועים מוקדמים של התפתחות נוירולוגית בתאים אנושיים, ובכך מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה לבדיקת מנגנוני מחלה לפני הופעת התסמינים. באמצעות יצירת NPCs ניתנים להתרחבה ולמניפולציה גנטית מתוך hiPSCs שמקורם בחולה, צוותים יכולים להפחית סיכונים בהשערות לגבי מטרות טיפוליות באמצעות בדיקה אמפירית של השפעות מניפולציה גנטית על פנוטיפים תאיים כגון נדידה, רפליקציה, עקה חמצונית ואפופטוזיס. הדבר תומך בביטחון חיזוי בתיקוף המטרה ומסייע בקבלת החלטות go/no-go בתוכניות נוירוביאולוגיות פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הערכת ההשלכות המולקולריות של שינויים בביטוי גנים במערכת עצבית ממקור אנושי.
- ערך תפעולי: מספק מקור מתחדש של NPC לצורך סריקה פנוטיפית עקבית על פני הפרעות גנטיות.
- ערך חזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור מניפולציה גנטית לתוצאות תאיות כמותיות הרלוונטיות למסלולי מחלות נוירולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר אוכלוסיות של NPC יוצרי נוירוספירות המתאימות לבדיקות תגובת מאמץ ונדידה בעלות תוכן גבוה.
- ערך תפעולי: מאפשר ייצור סטנדרטי וניתן להרחבה של נוירוספירות עבור קמפיינים של סריקה גנטית או סריקת תרכובות הניתנים לשחזור.
- מוכנות לבדיקה: מייצר NPCs ניתנים להרחבה שניתן להקפיא בשימור קריוגני, להעביר פסיג'ים ולהעביר לתרבית סספנסיון לצורך ניטור פנוטיפי ארוך טווח.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאי תגליות לוולידציה פרה-קלינית על ידי מידול של תהליכים נוירו-התפתחותיים אנושיים בצלחת (in a dish).
- מערכת רלוונטית למחלה: משתמשת ב-NPCs המופקים מחולים כדי ללכוד השפעות של רקע גנטי על פנוטיפים תאיים, ובכך משפרת את הרלוונטיות הקלינית.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר הערכה מוקדמת של השפעות המודולציה של מטרה על דיפרנציאציה נוירונלית וגורל גליאלי, ובכך מספק מידע לפרופילי בטיחות ויעילות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מיצירת היפותזות למטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת מערכת תאים אנושית לתיקוף מטרות לפני השקעת משאבים במערכות של כימיה רפואית.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים במטרות על ידי מתן אפשרות למניפולציה מבוקרת של ביטוי גנים ב-NPCs ומדידה של השפעות פנוטיפיות במורד המסלול.
- סריקה: מספקת NPCs ונוירוספירות מוכנות לבדיקה לצורך כימות השפעות על נדידה, רפליקציה, עקה חמצונית ואפופטוזיס בעקבות הפרעה גנטית או פרמקולוגית.
- אנליטיקה: מייצרת מדדי נדידה מבוססי דימיג'ינג (למשל, מרחק רדיאלי באמצעות ImageJ) וקריאות של רפורטרים פלואורסצנטיים להערכת יעילות הטרנסדוקציה ושינויים פנוטיפיים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רלוונטיות התפתחותית ומחלתית על ידי שימוש בתאים המופקים מחולים לצורך מידול אירועים פתוגניים מוקדמים בהפרעות נוירולוגיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת NPCs ניתנת להרחבה שניתן להשתמש בה שוב עבור מטרות מרובות, רקעים גנטיים שונים ובדיקות פנוטיפיות בתוך פורטפוליו של תגליות במדעי המוח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת ההסתמכות על מודלים לאחר המוות או מודלים שאינם אנושיים, וזאת באמצעות בדיקה אמפירית ישירה בתאי מוצא עצביים אנושיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים להרחבת NPC, הקפאה (cryopreservation) ויצירת נוירוספירות.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות להורדת סיכונים מוקדמת של מטרות, ובכך מפחית כשלים בשלבים מאוחרים הנובעים ממנגנונים ביולוגיים בלתי צפויים בנוירונים אנושיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מטרות המבוסס על נתונים, בהתבסס על הצלה פנוטיפית או החמרה במערכת תאית אנושית רלוונטית קלינית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות של תאי גזע, דיפרנציאציה עצבית וטכניקות של טרנסדוקציה לנטיבירילית.
- תלוי בגישה למשטחים מצופים ב-poly-L-ornithine/laminin או ב-Matrigel, מצע גידול לתאי מקור עצביים וציוד צנטריפוגה לאיסוף רוזטות ופיצול של NPC.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים ליצירת נוירוספירות ולבדיקות נדידה כדי למזער שונות בין ניסויים וקווי תאים.
- דורש תנאי בטיחות ביולוגית ברמה 2-פלוס (BSL 2+) בעת עבודה עם וקטורים לנטיביריליים או רטרוביריליים כדי להבטיח טיפול בטוח.
- ההצלחה תלויה בטיפול זהיר כדי למנוע שבירה של הרוזטות במהלך האיסוף ובשמירה על צפיפויות זריעה אופטימליות ליצירת נוירוספירות.
