מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות
21 בפברואר 2015
פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להבדיל בין תאי אב עצביים לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, על מנת להניב אוכלוסיית תאים עצביים חזקה ומשוכפלת, אשר עשויה לשמש לזיהוי מסלולי ההתפתחות התורמים לפתוגנזה של מחלות בהפרעות נוירולוגיות רבות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תאי אב עצביים או NPCs מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם או PSCs גבוהים כפלטפורמה לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים התורמים למחלות נוירולוגיות. זה מושג על ידי הבחנה ראשונה של PSCs גבוהים באמצעות מעכבי smad כפולים לרוזטות עצביות. השלב השני הוא לקצור את הרוזטות העצביות הללו ולאפשר להן לגדול לאוכלוסיות N PC הניתנות להרחבה.
התמרה לנטיוויראלית הבאה עם זיהום ספין. צעד לשיפור היעילות משמש למניפולציה של ביטוי גנים. השלב האחרון הוא לגדל את ה-NPCs בתרחיף כך שהם ייצרו באופן ספונטני נוירוספרות.
בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפלטפורמה זו כדי לבחון מגוון פנוטיפים תאיים. לדוגמה, מדידת ההשפעה של מניפולציה גנטית על הגירה נוירולוגית. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מנגנונים תאיים כגון נדידה.
ניתן ליישם אותו גם כדי לחקור תהליכים ביולוגיים אחרים כגון שכפול, מתח חמצוני, אפופטוזיס וצמיחת נויריטים. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם או PSCs גבוהים מובילה להיווצרות רוזטות עצביות גלויות, המאופיינות כאשכולות עגולים של תאים נוירו-אפיתל עם קוטביות בסיסית aico לבחירה אנזימטית של רוזטות עצביות ביום 14. שאפו מדיה מגופי העובר המודבקים או ה-ebs והוסיפו מיליליטר אחד של מגיב בחירת רוסט עצבי לכל באר של צלחת שש בארות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
אחרי שעה. השתמש באיש פיפטה P 1000 כדי להסיר בעדינות את האנזים מכל באר ולהוסיף מיליליטר אחד של D-M-E-M-F 12 לכל באר. כדי לשטוף את הרוזטות, אספו את המיליליטר האחד של D-M-E-M-F 12 והוציאו אותו במהירות חזרה לבאר, ובכך נתקו את הרוזטות מהצלחת.
אוספים את הרוזטות לתוך שפופרת בז, פיפטה נוספת של מיליליטר אחד של D-M-E-M-F 12 ומוציאים אותה במהירות לאותה באר כדי לנתק את הרוזטות הנותרות. אל תנסה ונסה לא לפרק את אגרגטים הרוזטה. אסוף את הרוזטות העצביות לאותו צינור בז.
ניתן להוסיף עוד מהאנזים והליך זה חוזר על עצמו אם הרוזטות אינן מתנתקות בקלות כאשר כל הרוזטות העצביות נאספו. סובב את צינור הפלקון ב -300 גרם למשך שלוש דקות. שאפו את הכביסה והחייאה.
השעו את הרוזטות בשני מיליליטר של מדיה תאי אב עצביים. מעבירים את התאים ללמינציה פולי L אורניתין מצופה שש לוחות קיר, וגדלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע אחד. במעבדה זו מגדלים תאי אב עצביים או NPCs על צלחות מטריג'ל, מוזנים כל יומיים ונשמרים בצפיפות גבוהה מאוד.
כדי לפצל את ה-NPCs, שאפו תחילה את המדיה ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של אקוטן חם לכל באר של צלחת שש בארות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. העבירו בעדינות את התאים המנותקים לצינור של 15 מיליליטר המכיל D-M-E-M-F 12 עם כמה שפחות לחץ מכני. אין לבצע טריטרציה של התאים בזמן שהאנזים כדור את התאים על ידי סיבוב ב-1000 גרם למשך חמש דקות לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את ה-NPCs.
בכמיליליטר אחד של מדיה NPC לבאר מקורית של צלחת שש בארות, צפויים חמישה עד 10 מיליון תאים לכל באר מתכנסת של צלחת שש בארות לאחר השעיה מחדש וספירת תאים. החזר את צלחת ה-NPCs כ-1 עד 2 מיליון תאים לבאר של צלחת שש בארות כדי לשמור על ה-NPCs. היעילות של היווצרות נוירוספרות משתנה בין ניסוי לקווי תאים, אך בדרך כלל מתרחשת בצורה הטובה ביותר אם בין 200, 000 למיליון תאים יושבים לבאר של צלחת לא דביקה של שישה קירות אם מתרחש גוש, הפחיתו את מספר התאים היושבים באופן אידיאלי תוך יום עד יומיים מהפיצול.
יש להמיר את ה-NPCs עם וקטורים לנטי-ויראלים או רטרו-ויראלים כדי להגדיל את אחוז התאים שעברו טרנספטציה. השתמש בזיהום ספין. שאבו את המדיה מכל באר והחליפו בביטוי יתר או בקרה רלוונטיים לנטי-וירוסים או רטרו-וירוסים המכוונים לריבוי הרצוי של זיהום מדולל.
במדיה NPC השתמש ב-1.5 מיליליטר לבאר של ספין צלחת שש בארות ב-1000 גרם וטמפרטורת החדר למשך שעה בצנטריפוגת צלחת. לאחר הסיבוב, הנח את הצלחת בחזרה באינקובטור כדי להפחית את המוות התאי. החלף את המדיה תוך שמונה שעות מרגע הזיהום בסיבוב.
התחל הליך זה על ידי שטיפת ה-NEUROSPHERES שמקורו ב-NPC פעם אחת במדיה NPC כדי להסיר פסולת תאית. הטה את הצלחת בזווית של 45 מעלות ואפשר לנוירוספרות להתיישב ואז הסר כמה שיותר מדיה מבלי לשאוב את הנוירוספרות. החלף במדיה חדשה.
לאחר מכן, בחר ידנית את ה-NEUROSPHERES שמקורו ב-NPC תחת מיקרוסקופ באמצעות פיפטה P 200 להעביר כדור נוירוס אחד לכל באר של צלחת 96 בארות מצופה מטריג'ל. חשוב לבחור נוירוספרות בגדלים דומים על מנת להפחית את השונות בתוצאות. הוסף 0.5 מיליגרם נוסף של ג'ל מאטרי מדולל במדיה NPC קרה לנוירוספרות בכל צלחת 96 בארות.
באמצעות קצה פיפטה מרכז ידנית כל כדור נוירוס בודד באמצע הבאר אפשר לנדידת כדור הנוירוס להתרחש במשך 48 שעות. לאחר קיבוע וצביעה של התאים בסמנים האימונוהיסטוכימיים הרצויים, צלם את הנוירוספרות בשלמותן באמצעות מטרת מיקרוסקופ מט"ח. כדי למדוד נדידה רדיאלית, השתמש בתוכנת image J.
השתמשו בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לעקוב ידנית אחר קצה התאים הנודדים הרחוקים ביותר. ודא שהאזור מסומן בחלון המדידות המוגדר שנמצא תחת לשונית הניתוח. ולאחר מכן השתמש בפונקציית המידה כדי לחשב את שטח הצורה המתקבלת.
השתמש בערך מדידת השטח ובמשוואה עבור שטח המעגל כדי לקבוע את הרדיוס החיצוני באותו אופן, לעקוב אחר קצה כדור הנוירוס המקורי. מדוד את השטח וחשב את הרדיוס הפנימי. חשב את הנדידה הרדיאלית הכוללת כהפרש בין הרדיוסים החיצוניים והפנימיים.
תמונות אלה מציגות את השלבים של התמיינות עצבית גבוהה של PSC מ-PSCs גבוהים לגופי עובר, רוזטות עצביות, NPCs ונוירונים מאומתים NPCs מבטאים, קינון סמן NPC וגורם שעתוק תאי גזע עצבי SOX שניים ברוב התאים. צביעת בטא שלוש טובולין נראית גם בכל אוכלוסיות ה-NPC. NPCs מבטאים גם את גורם השעתוק של תאי הגזע העצביים PAC 6 ואת סמן האב של ארבעת המוח.
TBR שניים, אך לא סמני מוח תיכון כגון LMX אחד A ו-FOX A שני NPCs יכולים להבדיל ל-70 עד 80% בטא שלושה נוירונים חיוביים לטובולין המוצגים בירוק ו-20 עד 30% אסטרוציטים חיוביים לחלבון חומצי סיבי גליה המוצגים באדום, PSC גבוה באיכות גבוהה. NPCs מבטאים נסטון ו-SOX שניים ברוב התאים, בעוד של-NPCs באיכות נמוכה יש טלאים של SOX שני שליליים ומקננים בתאים שליליים בלבד. תאי העצב בני ארבעה שבועות המובחנים מ-NPCs באיכות גבוהה מבטאים מפה 2 AB ובטא 3 טורבולנטיות.
לאחר התמרה מוצלחת עם וקטור לנטי-ויראלי או רטרו-ויראלי עם טיטר גבוה. יותר מ-80% מהתאים מסומנים על ידי המדווח הפלואורסצנטי. כלול ביצירת הכדור הנוירוס הווקטורי מניב אוכלוסייה של נוירוספרות בגודל הומוגני יחסית, שיכולות להישאר בריאות בתרבית במשך כשבוע.
עם הזנה קבועה של כדורי נוירוס נדידת כדור מתרחשת בצורה חזקה בנוירוספרות בריאות כפי שמומחש על ידי תמונות שדה בהירות אלה לפני ואחרי 48 שעות נדידה במטריג'ל לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסכיזופרניה לחקור הגירה עצבית ב-NPCs שמקורם בתאי גזע פוננטים PL המושרה על ידי בני אדם. אל תשכח שעבודה עם רטרו-וירוס עלולה להיות מסוכנת וכל עבודת תרבית הרקמה צריכה להיעשות בתנאי BL שניים פלוס כאשר הנגיף עלול להימצא.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את ההתמיינות של תאי גזע עצביים (NPCs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSCs) למחקר מחלות עצביות. התהליך כולל יצירת NPCs שניתן להרחיב ולתפעל למטרות מחקר.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- הפרעות נוירולוגיות
רקע
- תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSCs) יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים.
- תאי גזע עצביים (NPCs) הם חיוניים לחקר התפתחות המוח ומחלות.
- הבנת מסלולי ההתמיינות של NPC יכולה לספק תובנות לגבי הפרעות נוירולוגיות.
- פרוטוקול זה נועד ליצור מקור אמין של NPCs למחקר.
מטרת המחקר
- ליצור NPCs מ-hiPSCs לחקר מחלות עצביות.
- לחקור מנגנונים תאיים ומולקולריים המעורבים בפתוגנזה של מחלות.
- לספק פלטפורמה למחקר עתידי על הפרעות התפתחות עצבית.
שיטות בשימוש
- התמיינות של hiPSCs באמצעות מעכבי SMAD כפולים לרוזטות עצביות.
- קצירת רוזטות עצביות לגידול אוכלוסיות NPC מורחבות.
- טרנסדוקציה לנטי-ויראלית עם זיהום ספין לתפעול ביטוי גנים.
- גידול NPCs בהשעיה ליצירת נוירו-ספרים.
תוצאות עיקריות
- התמיינות מוצלחת של NPCs מ-hiPSCs.
- ביסוס אוכלוסיות NPC מורחבות למחקר.
- הוכחת היעילות של טרנסדוקציה לנטי-ויראלית.
- NPCs יצרו נוירו-ספרים בתרבית השעיה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה להפקת NPCs מ-hiPSCs.
- ניתן להשתמש ב-NPCs לחקר מנגנוני מחלות נוירולוגיות.
- הגישה יכולה לסייע במחקר נוסף בתחום האסטרטגיות הטיפוליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to model early neurodevelopmental events in human cells, providing a scalable platform to interrogate disease mechanisms prior to symptom onset. By generating expandable, genetically tractable NPCs from patient-derived hiPSCs, teams can de-risk target hypotheses through empirical testing of gene manipulation effects on cellular phenotypes such as migration, replication, oxidative stress, and apoptosis. This supports predictive confidence in target validation and informs go/no-go decisions in preclinical neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing molecular consequences of gene expression changes in a human-derived neural system.
- Operational Value: Provides a renewable NPC source for consistent phenotypic screening across genetic perturbations.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking genetic manipulation to quantifiable cellular outcomes relevant to neurological disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates neurosphere-forming NPC populations suitable for high-content migration and stress-response assays.
- Operational Value: Enables standardized, scalable neurosphere production for reproducible compound or genetic screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces expandable NPCs that can be cryopreserved, passaged, and transitioned to suspension culture for longitudinal phenotypic monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by modeling human neurodevelopmental processes in a dish.
- Disease-Relevant System: Uses patient-derived NPCs to capture genetic background effects on cellular phenotypes, enhancing clinical relevance.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early assessment of target modulation effects on neuronal differentiation and glial fate, informing safety and efficacy profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing a human cellular system to validate targets before committing to medicinal chemistry campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target de-risking by enabling controlled manipulation of gene expression in NPCs and measurement of downstream phenotypic effects.
- Screening: Delivers assay-ready NPCs and neurospheres for quantifying impacts on migration, replication, oxidative stress, and apoptosis following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Generates imaging-based migration metrics (e.g., radial distance via ImageJ) and fluorescent reporter readouts to assess transduction efficiency and phenotypic changes.
- Translational Research: Maintains developmental and disease relevance by using patient-derived cells to model early pathogenic events in neurological disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable NPC platform that can be reused across multiple targets, genetic backgrounds, and phenotypic assays within a neuroscience discovery portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing reliance on post-mortem or non-human models through direct empirical testing in human neural progenitors.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized NPC expansion, cryopreservation, and neurosphere formation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, reducing late-stage failure due to unanticipated biological mechanisms in human neurons.
- Portfolio Impact: Facilitates data-driven prioritization of targets based on phenotypic rescue or exacerbation in a clinically relevant human cellular system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neural differentiation, and lentiviral transduction techniques.
- Depends on access to poly-L-ornithine/laminin or Matrigel-coated surfaces, neural progenitor media, and centrifugation equipment for rosette harvesting and NPC splitting.
- Necessitates standardized protocols for neurosphere formation and migration assays to minimize variability across experiments and cell lines.
- Requires biosafety level 2-plus conditions when working with lentiviral or retroviral vectors to ensure safe handling.
- Success depends on careful handling to avoid rosette breakage during harvesting and maintaining optimal seeding densities for neurosphere formation.
