Name: מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למדו ליצור תאי מקדם עצביים (NPCs) מתאי גזע pluripotent אנושיים (hiPSCs) לחקר מחלות נוירולוגיות. השיטה כוללת שימוש במעכבי SMAD כפולים, זיהום לנטיווירלי וגידול נוירוספירות בתליה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

קריסטן ברננד היא חוקרת של קרן תאי הגזע של ניו יורק - רוברטסון. מעבדת ברננד נתמכת על ידי מענק חוקר צעיר למוח והתנהגות, מענק R01 MH101454 של המכון הלאומי לבריאות (NIH) וקרן תאי הגזע של ניו יורק.

1. hiPSC בידול לתאים עצבי אב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ולהתרחב hiPSCs בתאי גזע עוברי אנושיים תקשורת (הס) (טבלת 1) שיתוף תרבותי על פיברובלסטים עכבר עובריים שכבת מזין עד מושבות גדולות (אבל subconfluent) מוכנות לבידול עצבי באמצעות גוף embryoid (EB) ביניים (MEF) (איור 2). תנאי תרבות hiPSC שגרה מתוארים גם במקומות אחרים 16,17; בקצרה, לגדול hiPSCs בתקשורת הס על שכבת מזין MEF עד מחוברות, מעבר אז אנזימים עם collagenase (1 מ&quot;ג / מיליליטר בDMEM) ולהרחיב כ 1: 3 בכל 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למ&quot;ל להכין צלחות פולי-L-ornithine / laminin מצופים, צלחות מעילים עם 10 גר &#39;/ פולי-L-ornithine במים סטריליים על משטחי פלסטיק (50 גר&#39; / מיליליטר למשטחי זכוכית) ולדגור על RT עבור 3-24 שעות. לשטוף לפחות פעם אחת עם מים סטריליים ולאחר מכן מעיל עם 5G / מיליליטר Laminin בPBS סטרילי ב RT עבור 3-24 שעות. הערה: אם עטוף בפלסטיק, צלחות יכולות להיותלאחסן עד שישה חודשים ב -20 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, אנזימים להרים hiPSCs subconfluent (בדרך כלל גדל על MEFs, או hiPSCs גדל בתקשורת מוגדרת כגון 18 TeSR על Matrigel) ממושבות גדולות כמו הצלחת באמצעות 1mg / ml Collagenase IV בDMEM / F12. הערה: בעקבות 1-2 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, מושבות מרחף בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות מושבות hiPSC (על ידי שיקוע, לא צנטריפוגה) 1-2x עם DMEM / F12, גלול ב2ml / היטב N2 תקשורת / B27 (טבלת 1) והעברה למאכלים שאינם חסיד 6 היטב (לשלב 3-בארות לתוך 1 &quot;טוב) 19. הערה: לילה, מושבות תהווה אשכולות כדוריים צפים מכונה &quot;גופי embryoid&quot; (EBS). מצפה מוות תאי משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, צלחות הטיה ולאפשר EBS להתיישב. מוציא בזהירות את התקשורת לשטוף פעם אחת עם DMEM / F12 כדי להסיר שאריות. להאכיל עם N2 / B27 תקשורת בתוספת מעכבים כפולים הסמאד (0.1M LDN193189 ו10M SB431542) 12 </sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימי 3-7, neuralization יתרחש בהקשר של עיכוב הסמאד כפול; לבדוק שEBS הם עגול, אבל לא פיברוזיס. להאכיל את EBS בכל יום שני בתקשורת N2 / B27 בתוספת 0.1M LDN193189 ו10M SB431542. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימי 7-14, הבא ציפוי של EBS לפולי-L-ornithine / Laminin צלחות מצופים, לבדוק באמצעות מיקרוסקופ brightfield שרוזטות העצבית מתחילה להופיע תוך מספר ימים (מאופיין כאשכולות עגולים של תאי neuroepithelial עם קוטביות apico-בסיס; איור 1). תמשיך להאכיל את EBS חסיד בכל יום שני בתקשורת N2 / B27 בתוספת 0.1M LDN193189, 10M SB431542 ו -1 g / ml laminin. </li></ol> 2. קציר של עצבי רוזטות הערה: אנו ממליצים שרוזטות העצבית לקצור enzymatically באמצעות העצבי רוזט הבחירה מגיב 20 או מגיב בחירה דומה. למרות רוזטות העצבית ניתן לאסוף באופן ידני לתוך 6-גם צלחת מצופה פולי-L-ornithine / Laminin, thiהמתודולוגיה של לוקחת הכשרה מקיפה להורים, ו, תלוי במיומנות למשתמש, עשוי לדרוש עגול של חיטוט ביום 20 להעשרה נוספת לNPCs ורוקן סוגים שאינם עצביים תא שני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחירה האנזימטית של רוזטות העצבית ביום 14, תקשורת לשאוב מEBS דבק ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב בחירת שושנה עצבי לכל גם לצלחת 6-היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם pipetman P1000, להסיר בעדינות אנזים מכל טוב. הוסף 1 מיליליטר של DMEM / F12 לכל גם לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם P1000, לאסוף 1 מיליליטר של DMEM / F12 ובמהירות לגרש DMEM / F12 בחזרה לתוך הבאר, ובכך לנתק את רוזטות מהצלחת. לאסוף את רוזטות לתוך צינור בז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 1 מיליליטר נוסף של DMEM / F12 ובמהירות לגרש לאותו גם לנתק רוזטות שנותרה. (אל triturate. נסה לא לשבור את אגרגטים שושנה). לאסוף את רוזטות העצבית לתוך הצינור בז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4 במידת צורך. אם רוזטות לא לנתק בקלות, להוסיף מומחדש אנזים וחזור על התהליך (שלבים 2.1-2.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאים ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב לשטוף, ומחדש להשעות רוזטות ב 2 מיליליטר של תקשורת NPC (טבלת 1). תאי העברה (1: 1) לפולי-L-ornithine / Laminin מצופים 6 צלחת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימי 15-21, רוזטות העצבית תרחיב; רוזטות להאכיל בכל יום שני בתקשורת NPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את האיכות של רוזטות העצבית ולהבטיח שתאים כמו פיברובלסטים-שטוחים אינם מתרחבים בתוך התרבות. הערה: אם אינה רוזטות להתמיד, תרבות NPC יכולה לפעמים להציל ידי מסיק ידני, בחירה רק את הטוב ביותר של רוזטות הרימו לתוך Accutase. לנתק את 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. גלולה, לשטוף וצלחת בתקשורת NPC על 24 גם צלחת מצופה פולי-L-ornithine / Laminin. </li></ol> 3. הרחבת תאים עצבי אב הערה: ניתן לגדל hiPSC NPCs משני Matrigel- או פולי-L-ornithine / Laminin צלחות מצופים. אנחנו בדרך כלל להשתמש Matrigel-צלחות כפי שהם יכולים להיות מוכנים במהירות רבה יותר ובעלות נמוכה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחות Matrigel מצופים, במהירות להפשיר וresuspend aliquot הקפוא 1mg של Matrigel ב 24 מיליליטר DMEM / F12 קר ולהפיץ באופן מיידי 2 מיליליטר היטב כל אחד משני לוחות שישה-היטב. דגירה במשך שעה לפחות 1 ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: Matrigel צריך רק להישאף, לא שטף, מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל NPCs בכל יום שני ולשמור על צפיפות גבוהה מאוד, או שהם באופן ספונטני יבדילו לתאי עצב. הערה: NPCs למרות מבוסס יותר הם בדרך כלל לפצל 1: 4 בכל שבוע, NPCs מעבר נמוך מאוד ניתן לפצל 1: 2 לעתים רחוקות ככל אחת לשבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפצל, תקשורת לשאוב ראשונה ולהוסיף 1 מיליליטר Accutase החם (1X) לכל טוב של 6-גם צלחת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר תאים מנותקים לתוך צינור המכיל 15 מיליליטר DMEM / F12 עם לחץ מכאני קטן ככל האפשר. אל לכייל תאים ואילו באנזים. תאים גלולה ידי spinning XG ב 1000 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב לשטוף, מחדש להשעות NPCs ב~ 1 מיליליטר מדיה NPC בכל טוב המקורי של 6-גם. הערה: צפה שליש לו גם מחוברות של צלחת 6-גם 5-10 מיליון תאים; זה יכול להיות מאושר על ידי ספירת aliquot 10L של תאים באמצעות hematocytometer מחדש ציפוי קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מחדש השעיה, NPCs מחדש הצלחת כNPCs, תאי עצב או neurospheres. כדי לשמור על NPCs, צלחת כ-1-2 מיליון תאים לכל טוב של 6-גם צלחת. היעילות של היווצרות neurosphere יכולה להשתנות בין ניסויים ושורות תאים, אך בדרך כלל מתרחשת הכי טוב אם בין 200,000 ו 1,000,000 תאי זרע לכל טוב של 6-גם צלחת לא חסיד; אם התקבצות של neurospheres מתרחשת, להפחית את מספר תאי זרע. להבדיל לתאי עצב, צלחת כ -200,000 תאים לכל טוב של 6-גם צלחת, החלפת מדיה NPC עם תקשורת Neuron. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunohistochemically לאמת כל שורת NPC הוקמה. Expan מרגע שחומר תאי מספיק כברNPCs טוליפ אין, תווית עם נוגדנים לnestin וSox2. קווי Validated NPC גם צריכים להיות מובחנים לתוך הנוירונים למשך 4-6 שבועות, ושכותרתו עם נוגדנים לIII טובולין וMAP2AB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים בparaformaldehyde 4% PBS ב 4C במשך 10 דקות. Permeabilize NPCs ב RT במשך 15 דקות ב1.0% Triton בPBS, ולאחר מכן לחסום ב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton ב RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני ב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton, הלילה בשעה 4C. הערה: אנו ממליצים הנוגדנים הבאים: העז נגד Sox2, 1: 200; Nestin עכבר אנטי-אנושי, 1: 200; אנטי-βIII טובולין ארנב, 1: 500; עכבר אנטי-βIII טובולין, 1: 500; העכבר אנטי-MAP2AB, 1: 200. (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף עם PBS, דגירה תאי נוגדנים משני עם הנוגדנים משני מצומדות המתאימים לעז, עכבר או ארנבת ב 1: 300, בב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton במשך 1-2 שעות בRT. כדי להמחיש גרעינים, תאי כתם עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) ולאחר מכן לעלות עם Vectashield. </li></ol></li></ol> 4. NPC התמרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש spinfection (צנטריפוגה של צלחות תרבית תאים בנוכחות הווירוס XG ב 1000 עבור שעה 1) כדי להגדיל את אחוז תאי transfected 21. תקשורת לשאוב ולהחליף עם ביטוי היתר הרלוונטי (או שליטה) lentiviruses (או רטרווירוסים), titered לריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים) (בדרך כלל 1-10), בדילול מלא בתקשורת NPC. השתמש בכל טוב של 6-גם צלחת 1.5 מיליליטר נפח (או נפח מדורגים בהתאם לסוגים אחרים של צלחות תרבית רקמה). ספין XG ב 1000 ו -37 ºC עבור שעה 1 בצנטריפוגה צלחת. הערה: באופן אידיאלי, transduce NPCs עם lentiviral או וקטורי retroviral בתוך 1-2 ימים של פיצול. בין אם באמצעות וירוסים מסחריים או-הכין מעבדה, זה יכול להיות מועיל לtiter כראוי קבוצות של וירוס מראש על ידי דילול סדרתי. (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית celמות lular, להחליף תקשורת בתוך 8 שעות של spinfection. הערה: שילוב ויראלי וביטוי transgene צריכה להתגלות בתוך 24 שעות על ידי הקרינה גן הכתב. (אם הווירוס חסר כתב ניאון, זה קשה יותר להעריך; transfection המוצלח ביותר יכול להיות מאומת על ידי immunoblot, אימונוהיסטוכימיה או qPCR למוצרי ביטוי יתר.) ביטוי מלא עשוי להימשך 3-7 ימים; spinfections חוזר ונשנה עם וירוס נוסף עשוי להידרש להגדיל את האחוז של תאי transfected. spinfections החוזר יכול להתרחש מדי יום, אך לא צריך להיות כל כך תכוף. באופן אידיאלי, אם באמצעות כתב ניאון,&gt; 80% של תאים צריכים להיות מסומנים. </li></ol> 5. neurosphere ההגירה Assay הערה: טופס neurospheres באופן ספונטני, בעקבות הניתוק האנזימטית של NPCs (על ידי אופן זהה לזה המשמש בהרחבת NPC - הצעדים 3.3-3.6), אם תאים בתרבית השעיה בתקשורת NPC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לגדול לנתקNPCs ד בתקשורת NPC במשך 48 שעות בצלחות nonadherent כדי ליצור neurospheres. (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגירת neurosphere, להכין צלחות Matrigel טריות באמצעות תקשורת NPC קרה, ולא DMEM, בצלחת 96-היטב, 1-2 שעות לפני neurosphere קטיף. לא לשאוב Matrigel מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שפורסם במקור עבור neurospheres מקורן בתאי הגזע עוברי 22, לבחור באופן ידני neurospheres נגזרת NPC תחת מיקרוסקופ, לאחר שטיפת פעם בתקשורת NPC כדי להסיר פסולת הסלולר. העבר את neurosphere אחד היטב בכל צלחת 96-היטב Matrigel מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.5 מ&quot;ג נוסף Matrigel, בדילול מלא בתקשורת NPC הקרה, לneurospheres בכל צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני במרכז כל neurosphere הבודד באמצע גם באמצעות קצה pipet. הערה: חשוב לבחור neurospheres בגודל דומה, על מנת לצמצם את השונות בתוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הגירה להתרחש במשך 48 שעות ולאחר מכן לתקן תאי wה- i paraformaldehyde 4% וכתם עם סמני immunohistochemical הרצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הגירת רדיאלי היא שיקבע, neurospheres תצלום בהם לחלוטין באמצעות מטרת 4x מיקרוסקופ. תכלול כל neurospheres פנייה קצה טוב או neurosphere שני מהניתוח. הערה: אם הגירה מתרחשת למשך זמן ארוך יותר מ -48 שעות, הגירת רדיאלי וכתוצאה מכך צפויה להיות גדולה מדי לתמונה באמצעות אובייקטיבי 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הגירה ממוצעת מכל neurosphere באמצעות תוכנת NIH ImageJ (איור 5). ניתן לעשות זאת באמצעות כל אחת משיטות הניתוח המפורטות להלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירת מחוגי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני להתחקות הקצה של התאים הרחוקים הנודד באמצעות כלי הבחירה חופשית ולאחר מכן להשתמש באמצעי הפונקציה (Ctrl + M) כדי לחשב את השטח של הצורה וכתוצאה מכך. לפני מדידת השטח לוודא שהשטח מסומן בחלון מדידות סט נמצא תחת הלשונית לנתח. השתמש בערך של מדידת השטח והמשוואה עבור שטחיו של מעגל (= πr 2) כדי לקבוע את הרדיוס (חיצוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר קצה neurosphere המקורי, למדוד את השטח ולחשב את הרדיוס (הפנימי) באותה הדרך. לחשב את הגירת רדיאלי הכוללת כהפרש בין הרדיוסים החיצוניים ופנימיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההגירה סלולרית הגדולה ביותר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המרחק שעבר מחמשת התאים הרחוקים מקצה neurosphere הפנימי באמצעות כלי בחירת קו הישר ואחריו מדוד הפונקציה (Ctrl + M). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Brennand, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+differences+in+hiPSC+NPCs+derived+from+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. , (2014).</li>
<li>Nicholas, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+hPSC-derived+forebrain+interneurons+requires+an+extended+timeline+and+mimics+human+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development.</a> Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).</li>
<li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+heat+shock+factor+1+in+neuronal+response+to+fetal+environmental+risks+and+its+relevance+to+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders.</a> Neuron. 82, 560-572 (2014).</li>
<li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+neuronal+differentiation+and+mitochondrial+dysfunction+in+hair+follicle-derived+induced+pluripotent+stem+cells+of+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients.</a> Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).</li>
<li>Paulsen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+oxygen+metabolism+associated+to+neurogenesis+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+a+schizophrenic+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).</li>
<li>Yu, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+hippocampal+neurogenesis+using+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).</li>
<li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li>
<li>Wen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysregulation+in+a+human+iPS+cell+model+of+mental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+pf+Inflammation+and+Tumor+Microenvironment+in+the+Development+of+Gastrointestinal+Cancers%3A+What+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Can+Do%5BTitle%5D)+AND+%22Current+stem+cell+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do.</a> Current stem cell research & therapy. , (2014).</li>
<li>An, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Correction+of+Huntington%27s+Disease+Phenotypes+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143, 527-539 (2010).</li>
<li>Sareen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+7+and+19+trisomy+in+cultured+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells.</a> PLoS One. 4, e7630(2009).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Cowan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460, 1127-1131 (2009).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+model+spinocerebellar+ataxia+type+2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+neuroscience+%3A+MN%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro.</a> Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Delaloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+coordinates+proliferation+and+migration+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors.</a> Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יש לנו תארנו שיטות שבאמצעותו להבחין hiPSCs לNPCs, סוג תא עצבי שבחלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC נשמרת ושעשויה לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה 8, 11. בנוסף, כפי שפורטנו, NPCs הוא אוכלוסייה עצבית וחסונה replicative וtransduced בקלות, שאנו מאמינים שעשויות להיות מתאימים למחקרים מולקולריים והביוכימי של נטייה למחלות. אמנם יש לנו שיטות מפורטות להבדיל וNPCs בדוג...

מחקרי ביטוי גנים של תאי עצב הבדיל במבחנה מתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSCs) על ידינו 1 ואחרים מצביעים על כך שתאי עצב 2,3 hiPSC דומים רקמת מוח עוברית ולא למבוגרים. נכון לעכשיו, מודלים מבוססי hiPSC עשויים להיות מתאימים יותר ללימוד נטייה ל, ולא תכונות מאוחרות של, מחלה נוירולוגית. יש לנו דיווח בעבר כי חלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה נשמרת בתאי סכיזופרניה הנגזר hiPSC העצביים אב (NPCs), מצביע על כך שNPCs עשוי להיות סוג תא שימושי לחקר המסלולים המולקולריים תורם לסכיזופרניה 1 . אנחנו ואחרים דיווחנו הגירה חריגה, סטרס חמצונים מוגברים ומיני חמצן תגובתי, רגישות ללחצים סביבתיים תת-סף ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה בסכיזופרניה hiPSC NPCs 1,4-6, כמו גם ירידת ג העצביonnectivity ותפקוד הסינפטי בנוירונים hiPSC סכיזופרניה 5,7-10. אם הגורמים המולקולריים תרמו להגירה חריגה ו / או סטרס חמצונים בסכיזופרניה hiPSC NPCs גם בבסיס הקישוריות העצבית המופחתת בתאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה, NPCs יכול להיות אוכלוסייה עצבית חזקה וreplicative מאוד שבה לחקור את המנגנונים אחראים למחלה. יתר על כן, כי אחד יכול במהירות לייצר מספר רב של תאים ולא צריך לחכות שבועות או חודשים להבשלה עצבית, מבחני מבוססי NPC מתאימים למחקר של קבוצות גדולות יותר של משתתפים והם נוחים יותר להקרנת תפוקה גבוהה. אנו מאמינים כי hiPSC NPCs יכול לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה, כפי שכבר הוכיח בהפרעות מגוונות כמו מחלת סכיזופרניה 1 והנטינגטון 11. להבדיל מNPCs hiPSCs, עצבי ראשוני בduction מושגת על ידי עיכוב כפול הסמאד (0.1mm LDN193189 ו10mm SB431542) 12. על ידי להכעיס BMP וTGF איתות עם מולקולות קטנות אלה, האנדודרם ומפרט mesoderm חסום, האצת בידול עצבי ומובילים להיווצרות של שושנות עצביות גלויות בתוך השבוע של ציפוי אחד. דפוסים עצביים מתרחש בשלב מוקדם בתהליך הזה, ככל הנראה בתקופת היווצרות שושנה עצבית ומייד לאחר מכן. בהיעדר רמזים אחרים, התאים עצביים האלה פרימיטיביים להניח גורל כמו המוח הקדמי-קדמי 13. מייד לאחר היווצרות שושנה עצבית, ומתמשך לאורך הרחבת NPC, NPCs המוח הקדמי בתרבית עם FGF2 8,14. יש להם פוטנציאל שושלת כפול ויכול להיות מובחן לאוכלוסיות עצביות של 70-80% נוירונים III טובולין-חיוביים וחלבון חומצי (GFAP) האסטרוציטים 20-30% גליה fibrillary -positive (איור 1). רוב הנוירונים hiPSC המוח הקדמי הם VGLUT1 חיובי, ולכן הם ככל הנראה glutamatergic, למרות שכ -30% מתאי העצב הם GAD67-חיובי (GABAergic) 8. NPCs הוא passaged באופן שיגרתי יותר מעשר פעמים במבחנה, תוך שמירה על פרופילי בידול עקביים, וללא צבירת חריגות קריוטיפ. קבוצות דיווחו NPCs passaging יותר מ -40 פעמים 15, לעומת זאת, אנו מוצאים כי מעבר לעשרה קטעים, NPCs להראות גדל נטייה לבידול astrocyte. NPCs גם לסבול הקפאה-מפשיר מרובה ויכול לעבור לגדול כneurospheres פשוט על ידי culturing בצלחות שאינן חסיד. NPCs הם transduced ביעילות על ידי וקטורים ויראליים, המאפשר הערכה מהירה של התוצאות מולקולריות ותאיות של ההפרעות גנטיות, ובקלות להרחבה להניב מספיק חומר למחקרים ביוכימיים. יתר על כן, מכיוון שוקטורים ויראליים להתיר חזק על ביטוי ו / או מציאה של גנים של מחלות-רלוונטיות, בכל שליטה או neur חולה נגזרתאי אל, אחד יכול להשתמש בפלטפורמה זו על מנת לבחון את ההשפעה של רקע גנטי על המניפולציות הללו. למרות שאינו מתאים להסינפטי או מבחני מבוססי פעילות הדורשים תאים בוגרים, NPCs עשוי להיות חלופה מעשית עבור רבים ניתוחים מולקולריים או ביוכימי פשוטים של תאים עצביים המופקת מחולה.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#11330</td><td>עבור מדיה HES</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#10565</td><td>עבור מדיה עצבית</td></tr><tr><td>KO-Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>#10828</td><td>צריך להיבדק הרבה</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#11140</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#17502-048</td><td>צריך להיבדק הרבה</td></tr><tr><td>B27-RA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#12587-010</td><td>צריך להיבדק הרבה</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Life Technologies</td><td>#13256-029</td><td>השעיה ב-PBS + 1% BSA</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>#04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>#04-0010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>#450-02</td><td>השעיה ב-PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>GDNF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;#450-10</td><td>השעיה ב-PBS + 0.1%</td></tr><tr><td>BSA Dibutyryl cyclic-AMP</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;#D0627</td><td>השעיה ב-PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>L-ascorbic</td><td>acid Sigma</td><td>#A0278</td><td>השעיה ב-H20</td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>&nbsp;#05832</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>Life Technologies</td><td>#17104019</td><td></td></tr><tr><td>CF1 mEFs</td><td>Millipore</td><td>#PMEF-CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>למינין, עכבר טבעי 1 מ"ג</td><td>Life Technologies</td><td>#23017-015</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD</td> <td>#354230</td><td>השעיה על קרח ב-DMEM קר ב-10 מ"ג/מ"ל, השתמש ב-1 מ"ג לכל שתי צלחת שוות ערך לצלחת 6 בארות</td></tr><tr><td>תרבית רקמות מטופלת צלחות 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות חיבור נמוך במיוחד</td><td>קורנינג</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי-Sox2&nbsp;</td><td>סנטה קרוז</td><td>ביישן; 17320</td><td>שימוש ב-1:200</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-אנושי Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>שימוש ב-1:200</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-ובטא; III-טובולין</td><td>קובאנס</td><td>PRB&shy; שימוש ב-435P</td><td>ב-1:500</td></tr><tr><td>עכבר נגד ובטא; III-טובולין</td><td>קובאנס</td><td>MMS&shy; שימוש ב-435P</td><td>ב-1:500</td></tr><tr><td>שימוש בעכבר נגד MAP2AB</td><td>Sigma</td><td>M1406</td><td>ב-1:200</td></tr><tr><td>צנטריפוגת צלחת</td><td>בקמן קולטר</td><td>בקמן קולטר אלגרה X-14 (עם מנשא צלחת SX4750)</td><td></td></tr></tbody></table>

מדריך ליצירת וnpcs hipsc שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

מחקרים שלאחר המוות של מחלות נוירולוגיות אינם אידיאליים לזיהוי הגורמים הבסיסיים להתחלת המחלה, מכיוון שמחלות רבות כוללות תקופה ארוכה של התקדמות המחלה לפני הופעת התסמינים. מכיוון שניתן לתכנת מחדש ביעילות פיברובלסטים מחולים ובקרות בריאות לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs), ולאחר מכן להתמיין לתאי אב עצביים (NPCs) ונוירונים לחקר מחלות אלה, כעת ניתן לסכם את האירועים ההתפתחותיים שהתרחשו לפני הופעת התסמינים בחולים. אנו מציגים שיטה שבאמצעותה ניתן להבדיל ביעילות hiPSCs ל-NPCs, אשר בנוסף להיותם מסוגלים להתמיין עוד יותר לנוירונים פונקציונליים, ניתן גם לעבור בצורה חזקה, להקפיא-להפשיר או להעביר אותם כדי לגדול כנוירוספרות, מה שמאפשר סריקה גנטית מהירה לזיהוי הגורמים המולקולריים המשפיעים על פנוטיפים תאיים כולל שכפול, נדידה, מתח חמצוני ו/או אפופטוזיס. NPCs hiPSC שמקורם במטופל הם פלטפורמה ייחודית, המתאימה באופן אידיאלי לבדיקה אמפירית של ההשלכות התאיות או המולקולריות של מניפולציה של ביטוי גנים.

ניתן לזהות רוזטות העצבית מורפולוגית, באמצעות מיקרוסקופ brightfield, לפי המראה האופייני שלהם כמקבצים עגולים של תאי neuroepithelial עם קוטביות apico-בסיס (איור 1). למרות NPCs הם בדרך כלל בתרבית בצפיפות תאים גבוהה מאוד, הבא passaging מייד, מעט סומה בצורת הפירמידה ומבנה neurite דו קוטבי הוא גלוי (1D איור). NPCs תוקף להביע nestin וSox2 ברוב המכריע של תאים, אם כי צביעת III טובולין היא גם נראית לעין בכל אוכלוסיות NPC, מעיד על כך שחלקם של NPCs יוזם הבחנה ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להבדיל בין תאי אב עצביים לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, על מנת להניב אוכלוסיית תאים עצביים חזקה ומשוכפלת, אשר עשויה לשמש לזיהוי מסלולי ההתפתחות התורמים לפתוגנזה של מחלות בהפרעות נוירולוגיות רבות.

מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק תאי מוצא עצביים או NPCs מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים או hiPSCs, כפלטפורמה למחקר של המנגנונים התאיים והמולקולריים התורמים למחלות נוירולוגיות. דבר זה מושג תחילה על ידי גדיעת hiPSCs באמצעות מעכבי smad דואליים לכדי רוזטות עצביות. השלב השני הוא קצירת רוזטות עצביות אלו ואפשרתן לגדול לאוכלוסיות NPCs ניתנות להרחבה.בשלב הבא תבוצע התמרה לנטיוויראלית באמצעות זיהום בסבב (spin infection). שלב זה לשיפור היעילות משמש למניפולציה של ביטוי גנים. השלב הסופי הוא גידול של ה-NPCs בתרחיף, כך שהם ייווצרו באופן ספונטני כנוירוספירות.בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפלטפורמה זו כדי לבחון מגוון של פנוטיפים תאיים. לדוגמה, מדידת ההשפעה של מניפולציה גנטית על נדידת נוירונים. כך שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנונים תאיים כגון נדידה.ניתן להשתמש בשיטה זו גם למחקר של תהליכים ביולוגיים אחרים, כגון רפליקציה, עקה חמצונית (oxidative stress), אפופטוזיס וצמיחת נוריטים. דיפרנציאציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים (hiPSCs) או תאי PSCs גבוהים מובילה להיווצרות של רוזטות עצביות (neural rosettes) נראות לעין, המאופיינות כצבירים עגולים של תאי נוירו-אפיתליום עם קוטביות אפיתליאלית-בזאלית, לצורך בחירה אנזיםטית של רוזטות עצביות ביום ה-14. שאבו את המצע מהגופים העובריים (embryoid bodies או ebs) ההודבקים והוסיפו 1 mL של ריאגנט לבחירת רוזטות עצביות לכל באר בלוח של 6 בארות; הדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.לאחר שעה אחת, השתמשו בפיפטמן P 1000 כדי להסיר בעדינות את האנזים מכל באר והוסיפו 1 mL של D-M-E-M-F 12 לכל באר. כדי לשטוף את הרוזטות, אספו את ה-1 mL של D-M-E-M-F 12 והחזירו אותו במהירות לבאר, ובכך נתקו את הרוזטות מהפלטה.אספו את הרוזטות אל תוך מבחנה מסוג פלקון. פפטו 1 mL נוסף של D-M-E-M-F 12 והוסיפו אותו במהירות לאותה באר כדי לנתק את הרוזטות שנותרו. אין לבצע טריטורציה (trituration) והשתדלו שלא לפרק את מקבצי הרוזטות. אספו את הרוזטות העצביות לאותה מבחנת פלקון.ניתן להוסיף כמות גדולה יותר של האנזים ולחזור על הליך זה אם הרוזטות אינן נפרדות בקלות לאחר איסוף כל הרוזטות העצביות. סובבו את מבחורת הפלקון (Falcon) ב-300 G למשך שלוש דקות. שאבו את תמיסת השטיפה ובצעו רספנדסיה (resuspend).השעו את השושנות (rosettes) בשני מיליליטרים של מצע גידול לתאי מוצא עצביים. העבירו את התאים לפלטה בעלת שישה בארות המצופה ב-poly L ornithine laminate, וגדלו בטמפרטורה של 37 °C למשך שבוע. במעבדה זו, תאי מוצא עצביים או NPCs גודלים על פלטות matrigel, מקבלים תזונה מדי יומיים ונשמרים בצפיפות גבוהה מאוד.כדי לפצל את ה-NPCs, ראשית שאיפו את המצע ולאחר מכן הוסיפו 1 mL של accutane חם לכל באר בפלטה של שש בארות; הדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 15 דקות. העבירו בעדינות את התאים שהסתלקו למבחנה של 15 mL המכילה D-M-E-M-F 12 תוך הפעלת מינימום של מאמץ מכני. אין לבצע טריטורציה (trituration) לתאים. השקיעו את התאים הנמצאים בכדור האנזים על ידי סבוב ב-1000 ×g למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאיפו את העלייה (supernatant) ושחזרו את ה-NPCs.בכ-1 mL של מצע NPC לכל באר מקורית של פלטת 6 בארות, צפויות כ-5 עד 10 מיליון תאים לכל באר מלאה (confluent) בפלטת 6 בארות לאחר השהייה מחדש וספירת תאים. כדי לתחזק את ה-NPCs, השתמש ב-1 עד 2 מיליון תאים לכל באר בפלטת 6 בארות. יעילות היווצרות הנוירוספירות משתנה בין ניסויים וקווי תאים, אך בדרך כלל היא מיטבית כאשר מושבים בין 200,000 למיליון תאים לכל באר בפלטה לא-דבקה (nonadherent) בעלת 6 בארות; אם מתרחשת התגבשות (clumping), יש להפחית את מספר התאים המושבים. הזריעה רצוי שתתבצע בתוך יום עד יומיים לאחר הפיצול.יש להעביר את ה-NP NPCs באמצעות וקטורים לנטיויראליים או רטרוויראליים כדי להעלות את אחוז התאים שעברו טרנספקציה. השתמשו בשיטת spin infection. שאבו את המצע מכל באר והחליפו אותו בלנטיווירוסים או רטרוויראליים רלוונטיים לביטוי 과-ביטוי (overexpression) או לבקרות, המדללים לריכוז (titer) התואם את ריבוי הזיהום (multiplicity of infection) הרצוי.במדיה NPC, השתמשו ב-1.5 milliliters לכל באר בלוחית בעלת שש בארות; סובבו ב-1000 G ובטמפרטורת החדר במשך שעה אחת בצנטריפוגה ללוחיות. לאחר הסבוב, החזירו את הלוחית לאינקובטור כדי להפחית את תמותת התאים. החליפו את המדיה בתוך שמונה שעות מהסבוב וההדבקה.התחילו את הפרוצדורה על ידי שטיפה חד-פעמית של ה-NEUROSPHERES המופקים מ-NPC במצע NPC כדי להסיר פסדתיים תאיים. הטו את הפלטה בזווית של 45 מעלות ואפשרו ל-neurospheres לשקוע, ולאחר מכן הסירו כמה שיותר מצע מבלי לשאוב את ה-neurospheres. החליפו במצע טרי.בשלב הבא, בחרו ידנית את ה-NEUROSPHERES הגזורות מ-NPC תחת מיקרוסקופ באמצעות פיפט P 200 והעבירו נוירוספירה אחת לכל באר בלוח 96 בארות מצופה ב-matrigel. חשוב לבחור נוירוספירות בגדלים דומים כדי להפחית את השונות בתוצאות. הוסיפו 0.5 milligrams נוספים של matri gel המדולל במצע NPC קר אל הנוירוספירות בכל לוח 96 בארות.בעזרת טיפ של פיפט, מרכזו ידנית כל כדור עצבי (neurosphere) במרכז הבאר. אפשרו להגירה של כדורי העצב להתרחש במשך 48 שעות. לאחר קיבוע וצביעה של התאים עם הסמנים האימונוהיסטוכימיים הרצויים, צלמו את כדורי העצב במלואם באמצעות עדשת מיקרוסקופ Forex. למדידת ההגירה הרדיאלית, השתמשו בתוכנת Image J.השתמשו בכלי הבחירה החופשית (freehand selection tool) כדי לעקב ידנית את קו הגבול של התאים שהתרחלו למרחק הרב ביותר. ודאו שהאפשרות area מסומנת בחלון המדידות (set measurements window) הנמצא תחת לשונית analyze. לאחר מכן, השתמשו בפונקציית המדידה (measure function) כדי לחשב את השטח של הצורה שהתקבלה.השתמשו בערך מדידת השטח ובנוסחה לשטח מעגל כדי לקבוע את הרדיוס החיצוני באופן דומה, ועקבו אחר קצה הכדור הנוירונלי המקורי. מדדו את השטח וחשבו את הרדיוס הפנימי. חשבו את סך הגירה הרדיאלית כהפרש בין הרדיוסים החיצוני והפנימי.תמונות אלו מציגות את שלבי ההבדלה העצבית של PSCs ריכוז גבוה, מ-PSCs ריכוז גבוה לגופי עובר (embryo bodies), רוזטות עצביות, NPCs ונוירונים מאומתים. NPCs מבטאים את סמן ה-NPC Nestin ואת גורם השעתוק של תאי גזע עצביים SOX2 ברוב התאים. צביעת Beta III tubulin נראית גם היא בכל אוכלוסיות ה-NPCs. NPCs מבטאים בנוסף את גורם השעתוק של תאי גזע עצביים PAX6 ואת סמן הפרוגניטור של המוח Pax6.TBR2, אך לא סמני מוח אמצעי כגון LMX1A ו-FOXA2. NPCs באיכות גבוהה מ-PSC יכולים להתמיין ל-70% עד 80% נוירונים חיוביים ל-beta three tubulin המוצגים בירוק ו-20% עד 30% אסטרוציטים חיוביים ל-glial fibrillary acidic protein המוצגים באדום. NPCs באיכות גבוהה מביעים nestin ו-SOX2 ברוב התאים, בעוד שב-NPCs באיכות נמוכה קיימים מגוון תאים שליליים ל-SOX2 ושליליים ל-nestin בלבד. נוירונים בני ארבעה שבועות שהתמיינו מ-NPCs באיכות גבוהה מביעים map2AB ו-beta three tubulin.בעקבות טרנסדוקציה מוצלחת עם וקטור לנטיבירי או רטרובירי בעל titer גבוה, יותר מ-80% מהתאים מסומנים על ידי הרפורטר הפלואורסצנטי. יצירת נוירוספירות (neurospheres) באמצעות הווקטור המגולמים בתוכנית מניבה אוכלוסייה של נוירוספירות בגודל הומוגני יחסית, שיכולות להישאר בריאות בתרבית למשך כשבוע.עם הזנה סדירה, הגירה של neurospheres מתרחשת בצורה רחבה ב-neurospheres בריאות, כפי שמודגם בתמונות brightfield אלו לפני ואחרי 48 שעות של הגירה ב-matrigel לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסכיזופרניה לבחון הגירה עצבית ב-NPCs המופקים מתאי גזע אנושיים מושריים (iPSC). זכרו כי עבודה עם רטרו-וירוס עלולה להיות מסוכנת, וכל עבודת תרבית רקמה צריכה להתבצע בתנאי BSL-2+ כאשר קיים חשש לנוכחות וירוס.

a-guide-to-generating-using-hipsc-derived-npcs-for-study-neurological

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת culturing תא אוטומטי עם דימות גבוהה תוכן כדי לחזות ולכמת תהליכים תאיים רבים ומבנים, באופן תפוקה גבוהה. שיטות כאלה יכולות לסייע ביאור תפקודית נוספת של הגנום, כמו גם לזהות את הגן למחלה רשתות מטרות סמים פוטנציאליים.

הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות

סרטון זה מדגים את מבחן ההגירה של תאי נוירוספירה עצביים מקדימים – בדיקה במבחנה לחקר התגובה הנודדת של תאים מקדימים עצביים מהנוירוספרה – באמצעות אנליזה מיקרוסקופית.

NPC Neurosphere Assay: בדיקה חוץ גופית כדי להעריך את התגובה הנודדת של תאים מבשרי עצבים מן הנוירוספרה

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד תאים מהיפוקמפי חולדה, כולל נוירונים, אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה.

קבלת אוכלוסיות תאים עצביים שונות מהיפוקמפוס של חולדה

מידול התפתחות המוח האנושי נפגע עקב המורכבות חסרת התקדים של רקמת האפיתל העצבית. כאן מתוארת שיטה לייצור חזק של אורגנואידים במוח כדי לתאר אירועים מוקדמים של התפתחות המוח האנושי ולדגמן מיקרוצפליה במבחנה.

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

התפתחותיות תהליכים כגון התפשטות ההעברה, תוצר neurite לעיתים קרובות מוטרד מנוטלי מחלות. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקולים להעריך במהירות, reproducibly אלה בתהליכי התפתחותיות NPCs נגזר iPSC אנושי. פרוטוקולים אלה מאפשרות גם להערכת ההשפעות של גורמי גדילה הרלוונטיים הרפוי על פיתוח NPC.

זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

מחקר זה מציג ומתאר פרוטוקולים לגזור שני מסוימים נוירונואידים אנושיים האדם כמודל רלוונטי ומדויק עבור לימוד 1) התפתחות האדם הגלינובלסטומה בתוך אורגנואידים האדם באופן בלעדי בבני אדם ו 2) תא העצב הדואמיאנרגיות בידול היוצר אורגאיד תלת מימדי.

ארגונית עצבית אנושית לחקר סרטן המוח ומחלות ניווניות

הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה לneurite מוצלח הערכה ורעילות המוח של תרכובות מולקולה קטנה.

Neurite Outgrowth שיטת והערכה רעילות נוירועם האדם העצבי תא מחולל נוירונים

אנו מתארים פרוטוקול לתכנת מחדש פיברובלסטים אנושיים שמקורם בעור לתאי אב עצביים המושרים (iNPCs), ואת הבידול הבא שלהם לאסטרוציטים המושרים (iAs). שיטה זו מובילה לייצור מהיר וניתן לשחזור של iNPCs ו- iAs בכמויות גדולות.

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

פרוטוקול זה מדגים כיצד סימולציות עצביות מבוססות פיזיקה יכולות לשמש לפרשנות סמנים ביולוגיים אלקטרופיזיולוגיים של נוירותרפיה ולגילוי השפעתם על מעגלים עצביים, ומספק גישה מכנית מבוססת להתפתחות נוירותרפיה.

פרוטוקול לחשיפת מנגנונים עצביים של השפעות נוירותרפיות על אלקטרואנצפלוגרפיה באמצעות הנוירוסולבר הניאוקורטיקלי האנושי

למדו ליצור תאי מקדם עצביים (NPCs) מתאי גזע pluripotent אנושיים (hiPSCs) לחקר מחלות נוירולוגיות. השיטה כוללת שימוש במעכבי SMAD כפולים, זיהום לנטיווירלי וגידול נוירוספירות בתליה.

מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

גלה סרטונים נוספים