Name: ומניפולציה במבחנה ההבשלה של Laevis Xenopus ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: חקור מניפולציה של ביציות Xenopus laevis לא בשלות להבשלה במבחנה והזרקת זרע תוך-ציטופלזמית. שיטה זו מאפשרת נוק-דאון של חלבונים מטניים ועליית ביטוי גנים לחקר התפתחות עוברית מוקדמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לחברי מעבדת גורדון על הדיון המועיל. ק.מ. הוא עמית מחקר במכללת וולפסון ונתמך על ידי מלגת הרשל סמית לפוסט-דוקטורט וקרן ססאקאווה הבריטית. מעבדת גורדון נתמכת על ידי מענקים מקרן וולקאם (RG69899) ו-MRC ל-J.B.G.

<ol><li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyamoto%2C+K+%22Biology+and+Pathology+of+the+Oocyte%3A+Role+in+Fertility%2C+Medicine%2C+and+Nuclear+Reprogramming%22">Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming</a>. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).</li>
<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
<li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li>
<li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+antisense+oligonucleotides+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 75-81 (2010).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Wave1+is+required+for+reprogramming+transcription+in+oocytes+and+for+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development.</a> Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).</li>
<li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li>
<li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
<li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li>
<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנחנו כאן פירוט שיטה חדשה לרוקן גורמים אימהיים או לביטוי יתר גורמים אקסוגניים לפני ההפריה. מערכת זו דורשת שני microinjections, אבל במקום זה מדלג הניתוח של צפרדעים, המשמש ב7,17 שיטת העברת מארח. זה הוא אופטימלי כדי להסיר את שלב ניתוח הצפרדע במונחים של טיפול בבעלי חיים. יתר על כן, אין לנו לקחת בחשבון לאיכות של צפרדעי נקבת מארח לניסויי ההעברה, מה שאומר שאנחנו יכולים להיפטר מגורם ביולוגי אחד שמשפיע על ההצלחה של ניסויים. לכן במערכת זו האיכות של ביציות שהתקבלו מצפרדעים דרוכים-PMSG היא גורם ביולוגי מרכזי שהוא מפתח לניסויים מוצלחים. האיכות של ביציות יכולה להישפט לאחר איסוף defolliculation השחלה או אחרי. אם כל חריגות שנצפו בשלבים האלה, זה אופטימלי כדי לאסוף השחלה אחרת מצפרדע חדשה. נקודה נוספת, כאשר אתה יכול לבדוק את איכות הביצית היא לאחר הבשלת ביצית. אם פחות מ -80% מprogesteronביציות שטופלו דואר להראות סימנים של התבגרות, ייתכן שלא תוכל לקבל מספיק מספר העוברים לניתוח נוסף. השימוש בdefolliculation האנזימטית במקום defolliculation הידני הוא גם יתרון נוסף של שימוש במערכת זו כדי להפחית את העבודה הדרושה לdefolliculation. עם זאת, זה עדיין אפשרי שdefolliculation הידני עשוי לתת פיתוח טוב יותר מאשר הטיפול האנזימטית. כפי שניתן לראות באיור 3, כמעט 10% במבחנה התבגרו ביציות יכולים להגיע לשלב ראשן שחייה. נתונים אלה נאספו מ -13 ניסויים עצמאיים כוללים אלה שדווחו ב- 8 וחדשים ניסויי הזרקה. שיטת העברת מארח צריך 75-150 ביציות בכל טיפול לקבלת נתונים משמעותיים מאז 30-60% מהביציות הועברו יכולים להגיע לשלב neurula 17. השיטה שלנו בדרך כלל מתחילה עם 200-300 ביציות בכל קבוצת ניסוי מאז כ 40-60% מעוברים ביקעו יכולים להגיעשלב תגובת שרירים. נתונים אלה מראים כי שני השיטות לתמוך בשיעור התפתחותי סביר. עד כה יש לנו להשיג 10 צפרדעים בחיים מביציות מוזרקות אוליגו antisense-הזריק mRNA ובקרת שליטה באמצעות טכניקה זו, מצביעה על כך שגישה זו תומכת בפיתוח באמצעות מטמורפוזה. שיטת המניפולציה-ICSI הביצית שלנו מספקת הזדמנות לבחון את תפקידם של גורמים אימהיים במהלך התפתחות עוברית בשלב מוקדם מאוד, זמן קצר לאחר ההפריה. בנוסף, ביטוי יתר של גורמי שינוי הכרומטין לפני ההפריה יכול לעשות את זה אפשרי לשפץ הכרומטין האימהי לפני ההפריה להבנת מצבי הכרומטין אימהיים הכרחיות לפיתוח. אסטרטגיה זו יכולה גם לעבוד היטב עם מערכות עריכת הגן הנוכחיות כגון nuclease תמלול כמו activator-מפעיל (Talen) 18,19 וCRISPR / CAS9 20,21 מאז אלה יכולים לבוא לידי ביטוי עוד לפני ההפריה. לכן, לגישה החדשה שלנו potentiאל לשמש ליישומים רבים בעתיד.

laevis Xenopus הוא בשימוש נרחב אורגניזם מודל רב עוצמה, ללמוד פיתוח 1. סיבה לכך הוא ביצי Xenopus הן גדול במיוחד (כ 1.2-1.4 מ&quot;מ, בהשוואה לעמיתיהם יונקים להיות על 0.1 מ&quot;מ) ושפע. ביצים מכילות רכיבים אימהיים מסונתזים ומאוחסנים, שהם מספיק כדי לנהוג התפתחות עוברית עד מעבר אמצע blastula (MBT, המתרחשות בשלב 8-8.5 עם 4,000-8,000 תאים). MBT מלווה בהפעלת הגנום zygotic, אשר לאחר מכן מייצרת מוצרי גן עובריים המכוונים את התפתחות נוספת. מחקרים רבים שמטרה לזהות גורמים אימהיים חשובים להתפתחות. מחקרים רבים מסתמכים על הזריקה של oligonucleotides antisense (oligos) כולל oligonucleotides morpholino לעוברי מופרים, ובמקרה זה פירוק של חלבונים אימהיים ניתן לצפות בשלב gastrula 2-4. לחלופין, mRNAs מוזרק להם מופריםbryos להפריע פונקציות גן או לאתר את גורלם של חלבוני ביטוי יתר. עם זאת, ההזרקה לעוברי שלב אחד תא בדרך כלל אינה משפיעה על רמות ביטוי של חלבונים אימהיים בשלבים עובריים בשלב מוקדם מאוד לפני MBT. Heasman ויילי הקימו את שיטת העברת מארח ללהתגבר על בעיה זו 5. בשיטה שלהם, ביציות defolliculated ידנית מוזרקות עם oligos antisense והועברו לנקבות מארח 6. חלבונים downregulated לפני הפריה כך שניתן לבחון תפקידים של חלבוני downregulated בהתפתחות עוברית מוקדמת. שיטת האזילה אימהית זה הובילה לזיהוי של מספר תפקידים התפתחותיים ייחודיים של חלבונים אימהיים, כפי שנסקרה ב- 7. בדוח זה, הפרט השיטה שפותחה לאחרונה, שבה דלדול אימהי או ביטוי יתר של mRNA לפני ההפריה מושגת ללא defolliculation ידני והעברת מארח8. Defolliculation הידני דורש הרבה זמן והעברת מארח לעתים קרובות צריכה טכניקות מיומנים והרישיון הספציפי לניתוח בעלי חיים, ובכך פוגעים שימוש תכוף בשיטת האזילה האימהית. Defolliculation והעברת מארח יוחלפו על ידי defolliculation האנזימטית 9,10 והזרקת זרע intracytoplasmic (ICSI) 11-13, בהתאמה. ICSI לביצים שימש במקור כדי לייצר צפרדעים מהונדסים 12. גרעיני זרע ועובריים גם הושתלו במבחנה ביציות דו-חיים התבגרו 11,14,15. כאן, אנו מציגים שיטת צעד-אחר-צעד שלנו להזריק זרע לביציות במבחנה התבגרו שהיו לפני שהוזרק עם oligos antisense או mRNA.

<table><tbody><tr><td>גונדוטרופין בסרום סוסות בהריון (PMSG)&nbsp;</td><td>MSD Animal Health</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu אבקה וממס לתמיסה להזרקה</td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט (MS222)</td> <td>Sigma</td><td>A5040</td><td>להרדמה</td></tr><tr><td>Liberase TM דרגת מחקר</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>להסרת ביציות. יש לאחסן ב-20&nbsp; &#176;ג.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td> עבור נימי זכוכית <td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>מעבדות אלפא</td><td>7 אינץ' דראמונד #3-000-203-G/XL</td> לחולץ מיקרופיפטה <td>מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>מכשיר SUTTER</td><td>דגם D-97</td><td>למיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>להבשלה in vitro</td></tr><tr><td>וצינור צנטריפוגה שקוף במיוחד ICSI 14 מ"ל&nbsp;</td><td>בקמן קולטר בריטניה בע"מ</td><td>344060</td><td>לטיהור זרע</td></tr><tr><td>OptiPrep צפיפות שיפוע בינוני (יודיקסאנול)</td> <td>Sigma</td><td>D1556</td><td>לטיהור זרע</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>מגיב חדירות תאים</td></tr><tr><td>שייקר</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td></td></tr><tr><td>למיקרוסקופ ניתוח ביציות (מיקרוסקופ זום סטריאו)</td> <td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>לאיסוף ביציות והזרקת מיקרו</td></tr><tr><td>50 &mu; m מסנן נקבוביות</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>לטיהור זרע</td></tr><tr><td>אולטרה צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>אופטימה L-100XP</td><td>לטיהור זרע</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 או 210261</td><td>איסוף ביציות ותגובת דפוליקולציה</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>לטיהור זרע</td></tr><tr><td>90 מ"מ פטרי מנה&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים קלה לאחיזה, 60&nbsp; x&nbsp; </td> צלחת תרבית <td>תאים FALCON</td><td>353004</td><td></td>15 מ"מ</tr><tr><td>לאחיזה קלה, 35&nbsp; x&nbsp; </td><td>351008</td><td></td> <td>FALCON</td> 15 מ"מ</tr></tbody></table>

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; laevis xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

ביצי דו-חיים היו בשימוש נרחב לחקר התפתחות עוברית. התפתחות עוברית מוקדמת מונעת על ידי גורמים המאוחסנים על ידי האם שהצטברו במהלך הביציות. על מנת לחקור את תפקידם של גורמים אימהיים כאלה בהתפתחות עוברית מוקדמת, רצוי לתמרן את תפקודיהם כבר מתחילת ההתפתחות העוברית. דרכים קונבנציונליות להתערבות גנים מושגות על ידי הזרקת אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (אוליגוס) או mRNA לביציות מופרות, מה שמאפשר ביטוי חסר או יתר של חלבונים ספציפיים, בהתאמה. עם זאת, שיטות אלה בדרך כלל דורשות יותר ממספר שעות עד שביטוי החלבון מושפע, ולכן ההתערבות בתפקודי הגנים אינה יעילה בשלבים העובריים המוקדמים. כאן, אנו מציגים מערכת ניסויית שבה ניתן לשנות את רמות הביטוי של חלבונים אימהיים לפני ההפריה. ביציות Xenopus laevis המתקבלות מהשחלות מנוקות על ידי דגירה עם אנזימים. אוליגוס אנטיסנס או mRNA מוזרקים לביציות מפוזרות בשלב שלפוחית הנבט (GV). ביציות אלו מבשילות במבחנה לביציות בשלב המטאפאזה II (MII), ולאחר מכן הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI). בדרך זו, עד 10% מעוברי ICSI יכולים להגיע לשלב הראשן השחייה, ובכך לאפשר בדיקות פונקציונליות של הפלת גנים ספציפיים או ביטוי יתר. גישה זו יכולה להיות דרך שימושית לחקור את התפקידים של גורמים המאוחסנים על ידי האם בהתפתחות עוברית מוקדמת.

התפתחות עוברית של עוברי ICSI באמצעות ביציות מבחנה התבגרה נבדקה (איור 3 א). שיעורי הבשלה של ביציות GV לבמה MII משתנים ובמידה רבה תלויים באיכות הביצית. בניסויים טובים, כמעט 100% מביציות GV להגיב לסימני פרוגסטרון ותכנית של הבשלת ביצית, סוף סוף הופכים לביצים בשלב MII. כל הביציות התבגרו היו נתונים לICSI וכ -25% מביצים שהוחדרו ביקעו (איור 3 א, n = 13 לשליטה מקושקשות ביציות מוזרקות אוליגו וn = 7 ללא ביציות מוזרקות אוליגו). כ -60% או 80% מעוברים ביקעו, המופקים מביציות מוזרקות אוליגו שליטה או ביצית-הזריק עישון, בהתאמה, הגיעו לשלב blastula / gastrula. בין עוברי blastula / gastrula, כמחצית מעוברים בדגימות מוזרקת אוליגו היתה באיכות טובה (כמעט ללא סימני מחשוף נורמלי ואפופטוזיס) ואילו 82% מעוברי blastula / gastrula היו באיכות טובה בnדגימות מוזרקות על-(איור 3 א). לבסוף, 41% ו -11% מעוברים ביקעו בדגימות מוזרקות אוליגו הגיעו תגובת השרירים ושלבי ראשן שחייה, בהתאמה, ואילו 60% ו -29% מעוברים ביקעו בדגימות מוזרקות אינם עשו (איור 3 א). עוברי ICSI אלה הם התערובת של עוברים נורמלים ולא נורמלים (איור 3). חלקם עוברים מטמורפוזה ולפתח להתבגר צפרדעי 8. תוצאות אלו מצביעות על כך שהזרקה של oligonucleotides antisense לתוך ביציות GV, ואחריו IVM וICSI, מאפשרת התפתחות עוברית מוקדמת יעילה. למרות שההזרקה של oligos antisense עצמו מקטינה התפתחות עוברית, אנחנו עדיין הצלחנו להשיג מספיק עוברים למטרות ניסויים רבים כגון בדיקת שיעורים התפתחותית, RT-PCR, כתם מערבי וכן הלאה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> איור<html> יור 1: דוגמאות אופייניות של Xenopus laevis ביציות באיכות טובה או באיכות גרועה לניסויי התבגרות במבחנה. (א) דוגמא של ביציות באיכות גרועות. לדוגמא, ביציות מראים פיגמנטציה בלתי סדיר אינן משמשות לניסויים הבאים. כל Xenopus laevis ביצית היא כ 1.2-1.4 מ&quot;מ קוטר. (ב) ביצית defolliculated באופן חלקי. המחצית הימנית של הביצית היא מכוסה על ידי תאי זקיק, שניתן להבחין בנוכחותם של כלי דם. חץ מראה על שטח חופשי של תאי זקיק ושלתוכו מחט הזריקה מוזרקת. (ג) דוגמא של ביציות באיכות טובות, שהם שווים בהגודל ולהראות ההמיספרות בבעלי חיים באופן שווה עם פיגמנט ניגוד ברור בין האונה בעלי החיים וחצי הכדור הצמחי. 2,496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2:. Xenopus laevis ביציות לפני ואחרי ההתבגרות לאחר הבשלת ביצית, כתמים ברורים לבנים מופיעים בחלק העליון של ההמיספרות בעלי חיים ותאי זקיקם התקלף. כל ביצית laevis Xenopus היא כ 1 מ&quot;מ בקוטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> איור 3: פיתוח של עוברי ICSI, המופקים מביציות מבחנה התבגרה. (א) לפיתוח של עוברי ICSI לכל שלב הוא סיכם. ביציות הוזרקו שליטה מקושקשת oligonucleotides antisense (הזרקת אוליגו שליטה) או בלי הזרקה (הזרמה שאינה), ואחריו IVM וICSI. המספר המתאים של עוברים בכל שלב מוצג לעיל הסורג והבריח. ממוצע ± SEM מוצג. N = 4-13 ניסויים עצמאיים / f שונהemales. (ב) דוגמאות לשרוד עוברי ICSI. עובר שלב tailbud אלה יוצרו בניסוי אחד, שבו כ -200 ביציות שמשו כחומר מוצא.

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

מטרת הניסוי הבא היא להשתיק חלבונים אימהיים המאוחסנים באוציטים או לבטא יתר של חלבונים רלוונטיים בנקודת ההפריה של ביצי צפרדע. דבר זה מושג על ידי הזרקת אוליגוניוקלאוטידים אנטי-סנס (antisense oligos) או mRNA לאוציטים לא בשלים שעברו דה-רגולציה אנזימטית, במטרה להשמיד או לבטא יתר של חלבון ספציפי. כשלב שני, האוציטים מועברים למצע המכיל פרוגסטרון, המשרה הבשלה של האוציטים לביצים.בשלב הבא, מזריקים זרע לתבويضים שהבשילו in vitro כדי לבחון את ההשפעה של knockdown או ביטוי יתר (overexpression) על ההתפתחות העוברית. בסופו של דבר, התפתחותן של תבويضים שהוזרקו להם אוליגו-נוקליאוטידים עד לשלב השבבים השוחים מהווה את הבדיקה התפקודית ל-knockdown או לביטוי יתר של הגן. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון העברה למארח (host transfer), הוא היכולת לדלג על תהליך הניתוח של הצפרדע תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים.אספו דגימה של שחלה המכילה תאי זרע בריאים לצ그러ת פטרי בקוטר תשעה סנטימטרים המכילה MBS בתוספת ps. לאחר מכן, פרקו את השחלה לחתיכות מרובעות ברוחב של አንድ עד שני סנטימטרים. אספו כחמישה מיליליטרים מהשחלה המפורקת עם התאים לשפורת חדשה בנפח 50 מיליליטר.לאחר מכן, שטפו את הרקמות עם MBS פלוס PS מספר פעמים, ואספו את הביצים לתוך 15 milliliters של MBS פלוס ps טרי. כעת, הוסיפו שבע יחידות של אנזים להסרת מעטפת להסכית ודגרו את התמיה תוך כדי ערבוב עדין עד שהן יהיו לפחות חלקית נקיות ממעטפת. תהליך זה יארך לפחות שעה לאחר הדגירה.מלאו את המבחנה ב-MBS בתוספת Ps כדי לעצור את התגובה. משכו את התמיסה לדופן המבחנה ולא ישירות על התאים. המתינו עד שהרקמות ישקעו והשליכו את הנוזל ואת הסוכן.תאים קטנים ולא בשלים יצופו ויש להסיגם. חזור על שלב שטיפה זה סך הכל 10 פעמים לאחר השטיפות. העבר את התאים לכלי תרבית של תשעה סנטימטרים עם MBS פלוס ps.העבירו את הצלחת למיקרוסקופ דיסקציה, ומכאן ואילך, שמרו על התאים בטמפרטורה של 16 עד 18 מעלות צלזיוס ככל האפשר. בחרו תאים באיכות טובה משלב שש (Stage six) לפי סיווג Dumont באמצעות פיפטת זכוכית, ואספו אותם לצלחת חדשה עם MBS פלוס ps. תא באיכות טובה צריך להציג פיגמנטציה אחידה בחצי החייתי ולהראות הפרדה ברורה בין החצי החייתי לחצי הצמחי.כמו כן, כולן צריכות להיות בגודל דומה, שיהיה בין 1.2 ל-1.4 מילימטרים בקוטר. אספו כ-200 עד 300 cytes עבור כל הזרקה, כך שיהיו כ-1000 cytes לכל ניסוי. איכות אתר ה-O היא המפתח להצלחה.אם השחלה מראה חריגות כלשהן במהלך ההכנה, אני ממליץ להוציא שחלה מעדר אחר ולהתחיל מחדש. כהכנה להזרקת האוליגו אנטי-סנס (antisense oligo), הגדירו את הבוכנה המתכתית של המיקרו-מזרק למנמנת הנמוכה ביותר, והניחו על הבוכנה קפילרה מזכוכית מלאה בשמן. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חתכו את קצה המחט באמצעות מספריים כירורגיים קטנים.צרו טיפה קטנה ככל האפשר. עבורו ללייזר הבא. הניחו רצועת פאראפורם על משבטת המיקרוסקופ ועליה טפטפו 3 µL של תמיסת חומצות גרעין בריכוז של 1 µg/µL.באמצעות פעולה זו, מלאו את קצה המחט. אם נלכד אוויר, יש להגדיל את הפתח. כעת, סמנו סימן גלוי על מחט ההזרקה במרחק של כחצי מילימטר מהקצה.לאחר מכן, התקדמו להזרקה של התאים: להזרקה של התא הראשון, חפשו אזור נקי מתאי זקיק שבו המחט תוכל לחדור. הכניסו את הקצה לאורך הגבול המשווני על ידי כיוון לנקודת המרכז מתחת ל-germinal vesicle. במקביל, ייצבו את התא באמצעות פינצטה מהצד opposite.כעת, באמצעות בקרת מתג רגל, הזרק את התמיסה, הזרק בין 4.6 ל-9.2 nanograms של antisense oligos או בין 250 picograms ל-13.8 nanograms של messenger RNA. לאחר הזרקת כל התאים, העבר אותם למצע דגירה והנח להם להדגיר מספר ימים כדי שיוכלו להתרחש שינויים בתוך הפרוטאוזום.בהמשך, העבירו את התאים עם כמות מינימלית של מצע למערכות גידול מסוג agros בעלות ציפוי ובקוטר שישה סנטימטרים, המכילות 5 עד 8 מיליליטרים של מצע הבשלה. לאחר מכן, אפשרו לתאים להתפתח במצע זה במשך 16 שעות לפני ההזרקת זרע. עבור פרוטוקול זה, יש להכין מלאי של זרע קפוא.עיין בפרוטוקול הכתוב לאחר 16 שעות של דגירה לצורך הבשלה. העבר בזהירות רבה את התאים לצלחית בעלת ציפוי egg gross בקוטר שישה סנטימטרים המכילה MBS בתוספת PS כדי לשטוף אותם. אם התאים לא מטופלים כראוי, הם עלולים להתרגש באופן ספונטני לפני ה-ixy.כעת, ספרו את התאים הבשלים וחפשו נקודות לבנות המעידות על כך שהשלב של השלישייה הגרעינית (germinal vesicle) של התא התפרק. אם פחות מ-80% מהם תקינים, הם אינם בריאים מספיק באופן קולקטיבי כדי לשרוד את הליך ה-ixy. כדי להמשיך.מלאו צלחית חדשה בתמיסת הזרקה והעבירו בעדינות את כל התאים לצלחית לאחר חצי שעה. המשיכו בהזרקת תמיסות זרע לתאים הבשלים באמצעות אותה הכנת מזריק שתוארה עבור האוליגוספרמיה. באופן אידיאלי, צריכים להיות אחד או שניים זרעים ל-4.6 nanoliters בתמיסת ההזרקה.כדי לבחון תמיסת הזרקה זו, הכינו טיפות של תמיסת DPI בריכוז 0.3 micrograms DPI למילליליטר והזריקו 4.6 nanoliters לתוך טיפות אלו. לאחר מכן, ספרו את מספר התבליות בכל טיפה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר אישור ריכוז התבליות, הזריקו לתאים 4.6 nanoliters מתמיסת התבליות.יש להבטיח שזמן ההזרקה של התמיסות יישאר עקבי, ולהזריק את התבويضות באופן רציף עם מינימום השהיות בין ההזרקות. לאחר כל 100 הזרקות, יש להחליף את תמיסת הזרע. לאחר שהוזרקו כל התבويضות הבשלות, יש להדגיר את הצלחת למשך ארבע עד חמש שעות, ולאחר מכן לבחון אותה.עבור עובריים שעברו שלב פילול (cleavage), ייתכן שחריצי הפילול לא יהיו ברורים כמו אלו של עובריים מופרים תקינים; העבירו את כל העובריים שעברו פילול למצע דגירה והשאירו אותם לדגירה למשך הלילה. למחרת, יש להעביר את העובריים ששרדו ל-0.1 XMMR להתפתחות עוברית של עוברי ixy. השימוש באוציטים שהבשילו במעבדה (in vitro) נבחן בניסויים מוצלחים, וכמעט 100% מהאוציטים בשלב ה-germinal vesicle הגיבו לפרוגסטרון והראו סימני הבשלה.כ-25% עברו פילוח. 60 עד 80% מהעוברים שנפלחו הגיעו לשלב הבלסטולה, וכשליש מהם הגיעו לשלב השבב השוחה. עוברי ה-ixy היו תערובת של עוברים תקינים ובלתי תקינים, מה שמעיד כי הזרקה של sogo antisense לתאי נבט בביצים, ולאחריה IVM ו-Dixie, אפשרה התפתחות עוברית מוקדמת.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפעיל חלבונים אימהיים לפני תהליך הפקטוריזציה (factorization).

manipulation-vitro-maturation-xenopus-laevis-oocytes-followed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבשלה חוץ גופית של ביציות דג הזברה המשמש מניפולציה של מוצרים הגן האימהי מוצג כאן.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

אנו מתארים שיטת היצרה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים מעוברים חד-תאיים של Xenopus laevis .

מניפולציה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים של Xenopus

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבשלות חוץ-גופית של ביציות עכברים, הפריה חוץ-גופית , ותרבות עוברים לשלב הבלסטוציסט.

ביציות עכברים בבגרות במבחנה, הפריה ותרבות עוברים לפני ההשתלה

חקור מניפולציה של ביציות Xenopus laevis לא בשלות להבשלה במבחנה והזרקת זרע תוך-ציטופלזמית. שיטה זו מאפשרת נוק-דאון של חלבונים מטניים ועליית ביטוי גנים לחקר התפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה

גלה סרטונים נוספים