ומניפולציה במבחנה ההבשלה של Laevis Xenopus ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

מטרת הניסוי הבא היא להפיל חלבונים אימהיים המאוחסנים בביציות או לבטא יתר על המידה חלבונים מעניינים בנקודת ההפריה של ביצי צפרדעים. זה מושג על ידי הזרקת אוליגוס אנטיסנס או mRNA לתוך ביציות לא בשלות לא מווסתות אנזימטית כדי לפרק או לבטא יתר על המידה חלבון ספציפי. כשלב שני, הביציות מועברות למדיום המכיל פרוגסטרון, הגורם להבשלת הביציות לביציות.

לאחר מכן, הזרע מוזרק לביציות הבוגרות במבחנה על מנת לבחון את ההשפעה של נוקדאון או ביטוי יתר על התפתחות העובר. בסופו של דבר, התפתחות הביציות המוזרקות של אוליגו לראשנים שוחים היא המבחן הפונקציונלי של הפלת גנים או ביטוי יתר. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני כלים קיימים כמו מארח להעברה, הוא שאנו יכולים לדלג על תהליך ניתוח הצפרדע באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.

אסוף אופוס על SAC המכיל ציטים בריאים בצלחת פטרו של תשעה סנטימטרים המכילה MBS בתוספת ps. לאחר מכן מפרקים את השחלה לחתיכות מרובעות ברוחב של סנטימטר עד שניים. אוספים כחמישה מיליליטר מהשחלה הקרועה עם ציטים לצינור חדש של 50 מיליליטר.

לאחר מכן שטפו את הטישו עם MBS פלוס PS כמה פעמים, ואספו את הביצים ב-15 מיליליטר של MBS טרי בתוספת ps. כעת, הוסיפו שבע יחידות של אנזים הסרת עלים לתרחיף ודגרו על התרחיף בצמחייה עדינה עד שהם יוסרו לפחות חלקית. זה ייקח לפחות שעה לאחר הדגירה.

מלאו את הצינור ב-MBS פלוס Ps כדי לעצור את התגובה. משוך את התמיסה על דופן הצינור ולא ישירות על הציטים. תנו לרקמות להתיישב והשליכו את המרק והסוכן.

ציטים קטנים ולא בשלים יצופו ויש להשליך גם אותם. חזור על כביסה זו שלב בסך הכל 10 פעמים לאחר הכביסה. מעבירים את הציטים לצלחת של תשעה סנטימטרים עם MBS פלוס ps.

מעבירים את הצלחת למיקרוסקופ מנתח ומכאן והלאה, שומרים על הציטים בטמפרטורה של 16 עד 18 מעלות צלזיוס ככל האפשר. בחר ציטים שלב שש באיכות טובה באמצעות סיווג דומונט באמצעות פיפטת זכוכית, אסוף אותם לצלחת חדשה עם MBS פלוס ps. ציט באיכות טובה צריך להיות בעל פיגמנטציה אחידה בחצי הכדור של בעלי החיים ולהראות הפרדה ברורה בין חצי הכדור החיה לחצי הכדור הצמחי.

כולם גם צריכים להיות בערך באותו גודל, שקוטרו יהיה בין 1.2 ל -1.4 מילימטרים. אספו כ-2 עד 300 ציטים לכל זריקה, המהווים כ-1000 ציטים בכל ניסוי. איכות אתר O היא מפתח להצלחה.

אם ה-Oside מראה חריגה מסוימת במהלך ההכנה, אני ממליצה לך לתקן שחלה מלהקה אחרת ולהתחיל מחדש. כהכנה להזרקת האוליגו האנטיסנס, כוון את בוכנת המתכת של מזרק מיקרו למקומה הנמוך ביותר, והכנס נימי זכוכית מלאים בשמן על בוכנת המתכת. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חותכים את קצה המחט בעזרת מספריים כירורגיים קטנים.

הכינו טיפ קטן ככל האפשר. הלייזר הבא. רצועת פרפורם על במת המיקרוסקופ ועליה מחלקים שלושה מיקרוליטר של תמיסת חומצת גרעין במיקרוגרם אחד למיקרוליטר.

עם זה, מלאו את קצה המחט. אם נלכד אוויר, יש להגדיל את הפתח. כעת סמן סימן גלוי על מחט ההזרקה כחצי מילימטר מהקצה.

לאחר מכן המשך בהזרקת הציטים כדי להזריק אחד תחילה, מצא אזור נקי מתאי זקיק שבו המחט יכולה לחדור לאזור זה. הכנס את הקצה לאורך הגבול המשווני על ידי כיוון לנקודת המרכז מתחת לשלפוחית הנבט. במקביל, ייצב את הצייט בעזרת מלקחיים בצד הנגדי.

כעת באמצעות בקרת מתג רגל, הוציאו את התמיסה, פלטו בין 4.6 ל-9.2 ננוגרם של אוליגוס אנטיסנס או בין 250 פיקוגרם ל-13.8 ננוגרם של RNA שליח. לאחר הזרקת כל הציטים, העבירו אותם למדיום הדגירה ותנו להם לדגור כמה ימים כדי שיוכלו להתרחש שינויים. בפרוטאזום.

מאוחר יותר, העבירו את הציטים עם כמות מינימלית של מדיה לכלים מצופים אגרוס בשישה סנטימטרים המכילים חמישה עד שמונה מיליליטר של מדיום התבגרות. לאחר מכן תנו לציטים להתפתח במדיה זו במשך 16 שעות לפני הזרקת זרע. לצורך פרוטוקול זה, יש להכין מלאי זרע קפוא.

התייעץ עם פרוטוקול הטקסט לאחר 16 שעות של דגירה להתבגרות. העבירו בזהירות רבה את הציטים לכלי מצופה ביצה ברוטו של שישה סנטימטרים עם MBS בתוספת PS כדי לשטוף אותם. אם הצייטים מטופלים בצורה לא נכונה, הם עלולים לפעול באופן ספונטני לפני ה-ixy.

כעת, ספרו את הציטים הבוגרים וחפשו כתמים לבנים המעידים על כך ששלפוחית הנבט של הצייט נשברה. אם פחות מ-80% טובים, הם ביחד לא בריאים מספיק כדי לשרוד את הליך ה-ixy. להמשיך.

ממלאים צלחת חדשה במדיום הזרקה ומעבירים בעדינות את כל הציטים לתבשיל לאחר חצי שעה. המשך בהזרקת תמיסת זרע לציטים הבוגרים באמצעות אותו תכשיר מזרק המתואר עבור אוליגוס. באופן אידיאלי, צריך להיות זרע אחד או שניים לכל 4.6 ננוליטר בתמיסת ההזרקה.

כדי לבדוק את תמיסת ההזרקה הזו, הכינו טיפות של תמיסת DPI ב-0.3 מיקרוגרם DPI למיליליטר והזריקו 4.6 ננוליטר לתוך הטיפות הללו. לאחר מכן ספרו את מספר הזרע בכל טיפה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר אישור ריכוז הזרע, הזריקו לציטים 4.6 ננוליטר מתמיסת הזרע.

ודא שהזמן הנדרש להזרקת התמיסות נשאר עקבי והזריק את הביציות בהתמדה עם הפסקה מינימלית בין הזריקות. לאחר כל החלפת 100 זריקות, תמיסת הזרע. לאחר הזרקת כל הביציות הבוגרות, יש לדגור את המנה במשך ארבע עד חמש שעות, ולאחר מכן לבדוק אותה.

עבור עוברים שעברו מחשוף, תלמי המחשוף עשויים שלא להיות ברורים כמו אלה של עוברים מופרים רגילים מעבירים את כל העוברים המפוצלים לאמצעי הדגירה ונותנים להם לדגור למשך הלילה. למחרת, יש להעביר את העוברים ששרדו להתפתחות עוברית של 0.1 XMMR של עוברי ixy. שימוש בביציות בוגרות במבחנה נבדק בניסויים טובים, כמעט 100% מביציות שלפוחית הנבט הגיבו לפרוגסטרון והראו סימני התבגרות.

כ-25% עברו מחשוף. 60 עד 80% מהעוברים המפוצלים הגיעו לשלב הפיצוץ, וכשליש מהם הגיעו לשלב הראשנים. עוברי האיקסי היו תערובת של עוברים נורמליים וחריגים כאחד, מה שהראה כי הזרקת הסוגו האנטיסנס לתוך ציטים צמחיים נבטים, ואחריה IVM ודיקסי אפשרו התפתחות עוברית מוקדמת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתפעל חלבונים אימהיים לפני פקטוריזציה.