תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine
28 במאי 2015
כאן אנו מדווחים על תיוג כפול של תאי ציצה עצביים וכלי דם באמצעות השתלת צינור עצביGFP אפרוחים בשילוב עם הזרקת DiI תוך וסקולרית. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לנו לדמיין וללמוד בו זמנית את ההתפתחות של מערכת העצבים (האנטרית) הנגזרת מ- NCC ומערכת כלי הדם, במהלך אורגנוגנזה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לצבוע ולדמיין רקמת עצבים שמקורה בקרום העצבי ומערכת כלי הדם הקשורה במהלך ההתפתחות העוברית. זה מושג על ידי הסרת הצינור העצבי מעובר מארח מסוג בר. אזור צינור עצבי מקביל הוא X שנכרת מעובר עוף טרנסגני תואם GFP, עוכל אנזימטית, מעוכל ומושתל במארח מסוג הבר.
התוצאה היא עובר כימרי. השלב השני הוא הזרקת צבע פלואורסצנטי למערכת הדם של העוברים הכימריים כדי לדמיין את מערכת כלי הדם המתפתחת. לאחר מכן, העוברים נקצרים ומנתחים את הרקמות המעניינות.
לבסוף, הדגימות מצולמות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמיין הן את מערכת העצבים האנטרית המסומנת GFP והן את רשתות כלי הדם המסומנות ב-DAI. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות, כמו טכניקת השתלת אפרוחי השליו הקלאסית, הם שהעוף והרקמות של GFP בהירים מאוד וכי ה- GFP של הציטופלזמה מאפשר הדמיה של הקרנות תאים בתוך רשתות עצביות. כמו כן, שיטות התיוג GFP ו-DAI תואמות להדמיה חיה.
כדי להתחיל להכין את אזור העבודה ואת כל הכלים והריאגנטים הדרושים להליך, הצעד הראשון הוא יצירת חלון בקליפת הביצה כדי לאפשר גישה לעובר. לאחר הסרת שניים עד שלושה מיליליטר אלבומין, העובר צריך להיות גלוי דרך החלון. לאחר מכן מוזרק דיו הודי כדי לעזור לדמיין את העובר.
לשם כך, הכנס מיקרופיפט דרך קרום החלמון מחוץ להיקף הפיצוץ. זווית זהירה את קצהו ישירות מתחת לעובר. לאחר שנמצא במקום, העביר את הדיו מתחת לעובר על ידי נשיפה על צינור הפה.
הקפד לא להכניס בועות אוויר שעלולות להוביל לזיהום. הסר בזהירות את המיקרו פיפטה מזכוכית. לאחר מכן, השתמש באזמל מיקרו בהתאמה אישית המותקן על מחזיק מחט כדי ליצור קרע קטן מאוד בקרום ה-IGN ליד האזור בו יבוצע המיקרו-כירורגיה.
כדי להסיר את אזור העניין של הצינור העצבי, השתמשו באזמל זעיר כדי לחתוך את כל הצינור העצבי, החל מקרדית אחת או שתיים וכלה בשש או שבע. לאחר מכן חתכו דו-צדדית בין הצינור העצבי לסומיטים כדי להפריד את הצינור העצבי מהרקמות שמסביב. הקפד לא לפגוע בסומיטים.
כשהוא מוכן, הפרד בעדינות רבה את הצינור העצבי מהצינור הבסיסי ולא החוט, שאמור להישאר שלם. כריתה מוצלחת של צינור עצבי תשאיר את כל הרקמות שמסביב שלמות לחלוטין. הסר והשליך את הצינור העצבי של הבלו.
העובר המארח מוכן כעת לקבל את הצינור העצבי של התורם. לאחר זיהוי עובר GFP תואם שלב, הסר אותו מהביצית על ידי ביצוע ארבעה חתכים במספריים קפיציים, צור צורת מלבן סביב העובר ולאחר מכן הרם אותו בעדינות באמצעות דומונט. מספר חמש, פינצטה.
מניחים את העובר בריבוע. צפו בזכוכית עם בסיס פולימר סוגאר. נער בעדינות את העובר כדי להסיר את כל החלמון המצורף.
הסר את קרום ה-VII והצמד את העובר לבסיס הפולימר באמצעות סיכות זעירות מנירוסטה. לאחר מכן, בצע ארבעה חתכים בצורה מלבנית סביב הצינור העצבי והסומיטים שמסביב באותו אזור שהוסר מהעובר המארח. באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק מעבירים את הצינור העצבי וכך רקמות קרדית לתוך זכוכית שעון המכילה 2% פנקראטין ב-PBS לעיכול אנזימטי.
לאחר 10 דקות של טמפרטורת החדר, השתמש בסיכות זעירות אל חלד המותקנות על ידית כדי להפריד ידנית את הצינור העצבי מכל הרקמות הסמוכות. לאחר הבידוד, העבירו את הצינור העצבי הקשור לכוס שעון אחרת על קרח כדי לשטוף את עודפי הפנקראטין ולעצור את העיכול האנזימטי. לאחר חמש דקות, הצינור העצבי המנותח מוכן להשתלה.
אורטו באופן מקומי למארח הגוזל. כאשר מוכנים להתחיל בהליך ההשתלה, העבירו בזהירות את הצינור העצבי המנותח מזכוכית השעון לעובר המארח. מקם את הצינור העצבי בכיוון הנכון ודחף בעדינות את האקס אקספליין הסמוך לאזור הכריתה.
במידת הצורך, השתמש באזמל המיקרו כדי לקצץ את האקספלן לגודל המדויק של האזור הכרות. ברגע שאתה במצב הנכון, הסר PBS ונוזלים אחרים כדי לעזור לתורם ולרקמות המארחות להיצמד ולבסס את השתל. ניתן להעריך את השילוב המוצלח של הצינור העצבי החיובי GFP המושתל במארח התרנגולות מסוג הבר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
אטום את החלון כולו עם סרט שקוף ברוחב 24 מילימטר כדי למנוע התייבשות וזיהום. סמנו את העובר הכימרי והחזירו את הביצית לאינקובטור להמשך התפתחות בנקודת הזמן הרצויה לניסוי, הוציאו את הביצית מהחממה והסירו את הסרט השקוף כדי לקבל גישה לעובר. לאחר הנראה, אתר וריד נגיש על החלמון, וודא שזרימת הדם מופנית לכיוון העובר.
בחר נקודת הסתעפות באחד מוורידי ה-IGN עבור מיקום ההזרקה. השתמש בפינצטה כדי להסיר את קרום הזכוכית מעל נקודת ההזרקה שנבחרה על ידי קריעה בכיוונים מנוגדים. לאחר מכן, התאם את קוטר מחט הזכוכית הנמשכת לגודל הווריד.
תיעב את המחט עם חמישה עד 10 מיקרוליטר של תמיסת דאי. הכנס במהירות את המחט לווריד ונשוף בהתמדה עם צינור הפה כדי לאפשר לדאי להצטרף לזרימת הדם לאט מבלי ליצור קריש דם. ניתן להעריך את הצלחת הזרקת הדאי על ידי התבוננות קצרה בעובר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הברור לעובר מיד לאחר ההזרקה.
כדי לשמור על כמה שיותר dii, גרפו את העובר על כף מחוררת וחתכו את כלי הדם ורקמות החיבור כדי לשחרר את העובר מהחלמון. הסר את כל הממברנות הרופפות ונתח את איברי העניין. היזהר מאוד לא לדחוס את הרקמה, מה שעלול להוביל לדיפוזיה של העין היבשה.
יש לתקן מיד את הרקמות ב-4% פרלדהיד למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר ולהמשיך בהליכים סטנדרטיים לבדיקת הרכבה שלמה או להקפאה. שחזורים תלת מימדיים אלה של ערימת תמונה קונפוקלית באזור הקיבה מראים תאי פסגה עצבית אנטרית חיוביים של GFP, מערכת כלי הדם המוכתמת ותמונה מופיעה של שתי הרשתות. חתכים היסטולוגיים מייצגים באזור הקיבה מראים גם תאי פסגה עצבית אנטרית חיוביים GFP, מערכת כלי הדם המוכתמת DII ותמונה שהופיעה.
ניתן להשתמש בשחזורים תלת מימדיים להפקת סרטים עם סיבובים של 360 מעלות כאן. שחזורים תלת מימדיים באזור הצקום מראים את חזית הפסגה העצבית האנטרית החיובית GFP בירוק ואת מערכת כלי הדם המוכתמת בצבע באדום. חלונית זו מציגה מיזוג של שתי הרשתות כאן.
ערימת התמונה הקונפוקלית שימשה להפקת סרט של חזית נדידת תאי הפסגה העצבית האנטרית וכלי הדם הנלווים. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס העצבוב וכלי הדם של איברים במהלך ההתפתחות על ידי מתן אפשרות לתיוג פלואורסצנטי חזק של תאים עצביים וכלי דם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהוא דורש תיאום קצה מצוין תחת המיקרוסקופ.
בסך הכל, גם השתלת הצינור העצבי וגם הזרקת הצבע דורשים תרגול רב כדי להצליח.
סקירה כללית
מחקר זה מדווח על טכניקת סימון כפולה להדמיית תאי רכס עצבי וכלי דם במהלך ההתפתחות העוברית באמצעות עוברי אפרוח. השיטה משלבת השתלת צינור עצבי GFP עם הזרקת DiI כדי לבחון את התפתחות מערכת העצבים האנטרית ומערכת כלי הדם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה
רקע
- תאי רב רבדי העצב (NCCs) תורמים להתפתחותם של רקמות שונות, כולל מערכת העצבים האנטרية.
- מערכת כלי הדם ממלאת תפקיד מכריע באורגנוגנזה ובפיתוח רקמות.
- לשיטות הקיימות לחקר מערכות אלו יש מגבלות בכל הנוגע להדמיה.
- מחקר זה מציג טכניקה חדשנית לתצפית סימולטנית על NCCs ועל כלי דם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לסימון כפול של רקמות ממקור רב רגבי (neural crest) ומערכת כלי הדם.
- שיפור הוויזואליזציה של מערכת העצבים האנטרית במהלך האורגנוגנזה.
- שיפור טכניקות השתלה מסורתיות להשגת תוצאות דימות טובות יותר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתלה של צינור עצבי המסומן ב-GFP מעוברים של אפלוף טרנסגני לתוך מארחים מסוג פרא.
- הזרקת צבע פלואורסצנטי DiI למערכת כלי הדם של עוברים כימריים.
- נתיחה והדמיה של רקמות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- הערכת השתלבות השתל וויזואליזציה תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
תוצאות עיקריות
- סימון כפול מוצלח של רקמה עצבית ורשתות כלי דם שמקורן בתאי NCC.
- ויזואליזציה משופרת של שלוחות תאים בתוך רשתות עצביות הודות לסימון ב-GFP.
- תאימות של שיטות הסימון לטכניקות של דימיון חי.
- הערכה משופרת של השתלבুত השת Transplant בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- טכניקת הסימון הכפול מספקת כלי רב עוצמה לחקר ההתפתחות העוברית.
- שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של אינטראקציות מורכבות בין מערכות עצביות וכליות.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למחקרים אחרים בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
טכניקה זו של סימון כפול מאפשרת ויזואליזציה סימולטנית של רקמות שמקורן ברבדי העצב (neural crest) ושל רשתות כלי דם בעוברים מתפתחים, ובכך מספקת כלי רב עוצמה להפחתת סיכונים מכניסטיים (mechanistic de-risking) בתהליך של תיקוף מטרות. על ידי מתן אפשרות לתצפית בזמן אמת על התפתחות משותפת בין מערכת העצבים למערכת כלי הדם, השיטה תומכת בביטחון תחזיתי בשלבי גילוי מוקדמים, שבהם הבנת אינטראקציות בין רקמות היא קריטית לזיהוי מטרות טיפוליות ברות-ביצוע. הגישה נותנת מענה לאתגר מרכזי בשלב הגילוי: ביסוס הרלוונטיות הביולוגית של מטרות בתוך מערכות התפתחותיות מורכבות בעלות אינטראקציות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי ויזואליזציה של האופן שבו רקמות שמקורן ברבדי העצב (neural crest) מקיימות אינטראקציה עם רשתות כלי דם מתפתחות במהלך אורגנוגנזה.
- ערך תפעולי: מספק סימון פלואורסצנטי בהיר ותואם (GFP ו-DiI) התומך בדימות חי ומפחית שונות טכנית במערכות של תרבית משולבת (co-culture) או השתלה של רקמה (explant).
- ערך חזוי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי חשיפה לשאלה האם מטרות מועמדות משפיעות הן על ההתפתחות העצבית והן על ההתפתחות כלי הדם, ובכך עוזר לתעדף מטרות בעלות השפעה פיזיולוגית רחבה יותר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית של תבניות עצביות וכלי דם, שניתן להשתמש בהן כנקודת ייחוס להשפעות של תרכובות בסריקות פנוטיפיות.
- ערך תפעולי: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכת תגובות של רקמות כפולות, ובכך משפר את מהימנות הבדיקה לאורך קמפיינים של סריקה.
- יכולת הרחבה: ממנפת את נגישותם של עוברים של עופות לצורך הכנה ודימוי בתסריף גבוה, ובכך תומכת בשימוש חוזר בפלטפורמה בתהליכי גילוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול רלוונטי למחלות על ידי לכידה של הפיתוח הסימולטני של מערכת העצבים האנטרית ואספקת כלי הדם, תהליך המופר במצבים כמו מחלת הירשספרונג (Hirschsprung’s disease).
- ערך תפעולי: מאפשר דימות אורך של אינטגרציה רקומית והיווצרות רשתות, ובכך מספק מדדים דינמיים להערכת יעילות פרה-קלינית.
- הפחתת סיכונים: מסייע בזיהוי מטרות שמודיולציה שלהן עלולה לשבש התפתחות רקומית מתואמת, ובכך מפחית את שיעור הכישלונות בשלבים מאוחרים עקב השלכות פיזיולוגיות בלתי צפויות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיקוק מודלים פרה-קליניים, במיוחד עבור טיפולים המכוונים להפרעות נוירו-התפתחותיות או כלי דם, שבהן תקשורת בין רקמות היא רלוונטית פתופיזיולוגית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על האופן שבו הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות משפיעות על נדידת הרכס העצבי ועל דפוסי כלי הדם במקביל.
- סריקה: מספק פלטים מרובים (מדדים עצביים וכלי דם) המאפשרים ניתוח השוואתי של השפעות תרכובים על מערכות ביולוגיות המקיימות אינטראקציה.
- אנליטיקה: מייצר סדרות תמונות קונפוקאליות ושחזורי תלת-ממד המניבים נתונים כמותיים על חזיתות נדידת תאים, צפיפות הרשת וקו-לוקליזציה לצורך קבלת החלטות מבוססת נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול תהליכי אורגנוגנזה רלוונטיים לבני אדם במערכת עוברית ניתנת לניהול.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימוי הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להחלה על פרויקטים מרובים החוקרים אינטראקציות עצביות-חvסכוליות, ובכך מפחית פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי בבחירת מטרות על ידי חשיפת קשרים מכניסטיים בין נתיבי התפתחות עצביים וכלי דם.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים להשתלה ולהזרקת צבע, תוך מזכור השונות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות המשך (go/no-go) באמצעות מתן תובנה מוקדמת לגבי השפעת המטרות על מערכות התפתחותיות קריטיות מרובות, ובכך משפר את יעילות ההון.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על השפעתן על מערכות רקמות saling-מקושרות, ומפחית את הסבירות לכישלונות בשלבים מאוחרים עקב הפרעות פיזיולוגיות בלתי צפויות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בעוברי עוף, בניתוחים מיקרוכירורגיים ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להבטיח את חיוניות הש Transplant ואספקה מדויקת של הצבע.
- תלוי בגישה לעוברי תרנגולת טרנסגניים ל-GFP, מיקרוסקופי פלואורסצנציה וכלי ניתוח מיקרוכירורגיים לצורך כריתה והשתלה של צינור העצבים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי שלבי התפתחות העובר, נפח ההזרקה ופרמטרי הדמיה כדי להבטיח השוואתיות בין פרויקטים.
- יש להתחשב בתזמון ההתפתחותי הספציפי למין בעת הצהרה על ממצאים המוחללים על מערכות יונקים, למרות שדגם האפרופ מציע יתרונות בנגישות ובבהירות ההדמיה.
- מגבלות מעשיות כוללות את המיומנות הטכנית הנדרשת לדיסקציה של צינור העצבים ולהזרקה לוואסקולריזציה, הדורשות הכשרה כדי לשמור על עקביות ועל חיוניות העובר.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Preparing the Host Embryo
3:30
Preparing the Donor Graft Tissue
5:05
Grafting the Tissue
6:11
Injecting Dil into Blood Vessels
7:20
Harvest Embryos for Sectioning or Wholemount Examination
8:05
Results: Dual Labeling in Chimeric Chick Embryos
9:19
Conclusion
