הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להזריק מיקרו-בועות לעוברי עכברים חיים מבודדים. לניגודיות הדמיית אולטרסאונד משופרת. זה מושג על ידי קצירת עוברים חיים E 16.5 או E 17.5 מעכברה בהריון.

לאחר הכנת המיקרו-בועות המטרה, המיקרו-בועות מוזרקות לעובר החי דרך רשת כלי הדם של השליה. השלב האחרון הוא לדמות את המיקרו-בועות באמצעות הדמיית אולטרסאונד. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהדמיית אולטרסאונד משופרת בניגודיות כדי למדוד פרמטרים של זלוף כלי דם ולהעריך קשירת מיקרו-בועות ממוקדת בעוברים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם הטיפול בעוברים וחלקי ההזרקה של הפרוטוקול עד שיהיה להם מספיק תרגול בהפעלת לחץ המחט והמלקחיים הנדרשים לניסוי מוצלח המדגים את ההליך יהיה בריאן ניקסון, סטודנט קו-אופ מהמעבדה שלנו כדי להרכיב מחדש את הבקבוקונים המוכנים למטרה התחל בדילול 20 מיקרוגרם של תמיסת הנוגדנים לנפח סופי של מיליליטר אחד של מי מלח. שמור את הבקבוקונים על קרח. לאחר מכן, מלאו מזרק במיליליטר מי מלח.

הסרת כל בועות האוויר. חבר מחט בגודל 21 והזריק את התמיסה לאט לתוך בקבוקון המיקרו-בועה. משוך לאט את הבוכנה, הסר מיליליטר אוויר ואז משוך את המחט.

מערבבים בעדינות את הבקבוקון ונותנים לו לעמוד על קרח במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, מלאו מזרק חדש בדילול הנוגדנים והוסיפו אותו לבקבוקון המתאים. לאחר התסיסה, הניחו בעדינות לתערובת כעת שני מיליליטר.

עמדו 10 דקות על הקרח. כדי להרכיב מחדש את הבקבוקונים הלא ממוקדים, מלאו מזרק במיליליטר אחד של מי מלח. הסרת כל בועות האוויר.

חבר מחט בגודל 21 והזריק את התמיסה לאט לתוך בקבוקון מיקרו-בועות חדש. משוך לאט את הבוכנה, הסר מיליליטר אוויר ואז משוך את המחט. מערבבים בעדינות ונותנים לו לעמוד חמש דקות.

לאחר הוספת מיליליטר אחד נוסף של מי מלח כדי להעלות את הנפח לשני מיליליטר, ערבבו בעדינות ותנו לו לעמוד 10 דקות על קרח. לאחר ערבוב עדין של בקבוקון המיקרו-בועות הרצוי, השתמש במחט בגודל 21 על מזרק מיליליטר אחד כדי לשאוב כ-50 מיקרוליטר מהתמיסה. לאחר מכן הזרקו את המיקרו-בועות לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ריק של שני מיליליטר.

לאחר מכן, פיפטה דגימה של 10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי מיקרו-בועות ל-10 מיליליטר של מדלל. לאחר ערבוב עדין, השתמש בספירת קולטר כדי להעריך את התפלגות הריכוז והגודל של אוכלוסיית המיקרו-בועות. ספור מינימום שלוש מדידות של 50 מיקרוליטר לכל דגימת בקבוקון.

באמצעות צמצם של 30 מיקרומטר. שלב זה מבוצע במקביל להזרקת מיקרו-בועות לעוברים. בזמן שהמנתח מזריק את העוברים, העוזר מכין את הזריקה הבאה כדי לוודא שהמנתח עיוור לסוג הבועה המוזרקת.

קבע את נפח תמיסת בועות המלאי הנדרשת לייצור ריכוז סופי של 100 מיליון מיקרו-בועות למיליליטר בנפח של 400 מיקרוליטר. ציטוט את נפח המלח המתאים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ריק. לאחר ערבוב עדין של בקבוקון המיקרו-בועות שנבחר, השתמש במזרק מיליליטר אחד עם מחט בגודל 21 כדי לשאוב נפח עודף של התמיסה.

לאחר מכן הזרקו את המיקרו-בועות לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ריק. לאחר מכן, פיפטה את הנפח הדרוש של תמיסת מלאי מיקרו-בועות והוסף לעלי רביעיית מי מלח. מערבבים על ידי ערבוב עדין עם קצה הפיפטה.

לאחר מכן השתמש במחט בגודל 21 כדי לשאוב את תמיסת המיקרו-בועות המדוללת למזרק נקי. לאחר הסרת המחט, הסר את כל בועות האוויר מהמזרק והצמד את הפיתוי והצינור. דחף לאט את התמיסה לקצה הצינור, וודא שלא תיצור בועות אוויר.

לבסוף, הכנס את המזרק למשאבת עירוי מזרק המוגדרת להוצאת בועות המיקרו בקצב של 20 מיקרוליטר לדקה. לנפח כולל של 20 מיקרוליטר, חבר מחט זכוכית משוכה לקצה הצינור. הזז את המשאבה קרוב לשלב ההזרקה.

השתמש בכף מחוררת כדי לבחור ולהוציא באופן אקראי עובר אחד מצלחת המדיה המצוננת. הניחו את העובר בצלחת דיסקציה הממוקמת על במת האולטרסאונד מתחת לסטריאוסקופ. לאחר מכן, אתר את הצד של העובר שנראה הכי פחות כלי דם.

הנה אזור של כלי דם נמוכים בדרך כלל צמוד לאזור הראש. לאחר מכן השתמש במלקחיים עדינים כדי לחתוך או לקרוע מספיק משק החלמון ומממברנות מי השפיר כדי שתוכל להוציא את העובר מבפנים, אך לא יותר. לאחר מכן, תמרן בעדינות את השק מסביב לעובר.

לאחר מכן מקם את העובר על צדו כשהשליה וכלי הטבור מלפנים. ייצב את צלחת החיתוך באמצעות חתיכות קטנות של פלסטלינה באמצעות ארבע סיכות חרקים המוצמדות לשק החלמון ולשולי השליה, תוך הימנעות מכל כלי עיקרי באמצעות מזרק המכיל חימום מראש. 45 מעלות צלזיוס.

PBS שוטפים את העובר עד שניתן לראות דם זורם לתוך העובר. עורק הטבור מזוהה על ידי הדם האדום הבוהק הפועם. לווריד הטבור ולרשת כלי הדם הקשורה אליו יש דם כהה יותר ובדרך כלל מכסים את אלה מעורק הטבור בצד השליה.

בשלב זה, מקם את המנה כך שניתן יהיה לבצע את ההזרקה בנוחות. לאחר שהעובר התעורר לחיים, כסו אותו, אך לא את השליה. עם ג'ל אולטרסאונד חם מראש, השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר בעדינות בועות אוויר מסביב לעובר ומלא את המנה ב-PBS חם מראש לאורך כל ההליך.

שימו לב לרמת התמיסה במזרקי ה-PBS והג'ל והוסיפו מזרקי גיבוי לכוס החימום לפי הצורך. לאחר מכן, הרכיב את מחט הזכוכית על כדור פלסטלינה גדול בקצה צלחת הדיסקציה והכנס את קצה המחט לתוך ה- PBS. בחר וריד על המשטח הכוריוני של דיסק השליה רחוק ככל האפשר מהענף הראשי

לאחר מכן השתמש במספריים כדי לקצץ את קצה המחט כך שיתאים לגודל הכלי. חיתוך הקצה בזווית קלה. השתמש בקצה המספריים הקפיציים כדי להסיר קצוות זכוכית משוננים.

כעת, באמצעות משאבת המזרק, הזריקו לאט את תמיסת המיקרו-בועות במהירות של 20 מיקרוליטר לדקה לתוך מחט הזכוכית עד שכל האוויר יוצא מקצה המחט, וניתן לראות את המיקרו-בועות זורמות בחופשיות לתוך ה-PBS. עצור את המשאבה ואפס אותה לנפח הזרקה של 20 מיקרוליטר. אל תאפשר לאוויר להיכנס למחט ההזרקה כדי למנוע הזרקת אוויר למערכת כלי הדם של העובר.

הכנס את קצה מחט הזכוכית בעדינות לווריד שנבחר בשליה וודא שהוא לא זז. סובב את ראש הסטריאוסקופ ומקם את מתמר האולטרסאונד כך שהעובר ממוקם באופן שווה בין המוקדים בשישה עד 10 מילימטרים. לאחר מכן, התחל הדמיה והתחל את הזרקת הבולוס של המיקרו-בועות לאחר דקה עם השלמת ההזרקה, התחל את הטיימר לשלב רכישת הנתונים.

תמונת אולטרסאונד זו במצב B מציגה עובר E 17.5 מוחצן מיד לפני הזרקת מיקרו-בועות ממוקדות. תמונת אולטרסאונד ניגודיות לא ליניארית זו מציגה את העובר לפני הזרקת מיקרו-בועות, כאשר רק הממשקים המשקפים חזק כמו עצם נראים עם אות מינימלי מהרקמות הרכות. הזרקת המיקרו-בועות משפרת את הניגודיות בכל החיה, כולל הווריד הנבוב התחתון, הלב והמוח.

תרשים עוצמה של מיקרו-בועות כפונקציה של זמן בתוך אזור עניין יחיד במוח העוברי מאפשר זיהוי של פרמטרים שונים של זלוף, כולל שיפור שיא או שטיפת pe בקצב המוצג על ידי השיפוע והזמן לשיא או TTP. יחסי ההספק הממוצעים של הניגודיות ממיקרו-בועות ממוקדות אנדוגלין היו גבוהים משמעותית מאלה שנאספו לבקרה במיקרו-בועות לא ממוקדות. יתר על כן, קשירת מיקרו-בועות ממוקדת אנדוגלין נמצאה גבוהה משמעותית בעוברים אוגלי פלוס פלוס בהשוואה לעוברים אוגלי פלוס מינוס.

לאחר השליטה, ניתן להזריק ולדמות כל עובר תוך 15 דקות אם הטכניקה מבוצעת כראוי.