שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS
March 5th, 2015
אנו מציגים מערכת מבוא מדגם אגל דיסקרטית לספקטרומטריית מצמידים אינדוקטיבי פלזמה המונית (ICPMS). הוא מבוסס על שבב microfluidic זול וחד פעמי שיוצר טיפות monodisperse ביותר בטווח גודל של 40-60 מיקרומטר בתדרים בין 90 ל -7,000 הרץ.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ולנתח כמותית את הרכב היסודות של מיקרו טיפות מפוזרות מונו המכילות תאים בודדים או תמיסות מימיות על ידי I-C-P-M-S. זה מושג על ידי ייצור תחילה של שבב מיקרופלואידי, באמצעות יציקת העתק עם PDMS. השלב השני הוא חיבור משאבות מזרק לשבב המיקרופלואידי.
המשאבות יספקו את הדגימה המימית ואת ה-PFH הנדיף והקביל או האורגני PFH. כאשר משאבת המזרק מופעלת, השבב המיקרופלואידי מייצר טיפות מפוזרות מונו של תמיסת הדגימה המימית או מתלה תא על ידי זרימה, תוך התמקדות ב-PFH ופולט את הטיפות הללו עם PFH נוסף מהשבב כסילון נוזלי. השלב האחרון הוא הכנסת השבב למכלול הובלה המורכב ממחמם מחסנית שמאדה את הטיפות וממברנה דה סלבטור שמסיר את הממיסים לפני היינון וזיהוי תכולת הטיפות על ידי I-C-P-M-S.
בסופו של דבר, האותות המוקלטים ומדידת כיול עם תמיסה סטנדרטית משמשים לקביעת הרכב היסודות של תמיסת הדגימה או התאים בתרחיף. היתרונות העיקריים של הטכניקה המיקרופלואידית שלנו על פני השיטות הקיימות הם גודל הטיפות המתכוונן, צריכת הדגימה הנמוכה והסיכון הנמוך לחוסר רישום בעבודה עם תרחיפי תאים או תמיסות מלח מרוכזות. יתר על כן, השבב המיקרופלואידי החד פעמי בעלות נמוכה מונע זמן ניקוי ומבטל זיהום צולב.
מדגימים את ההליך כולו vin sc, דוקטורנט ממעבדת פרופסור GTAs ופסקל פבריקה, דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בתהליך המיקרו-פבריקציה, מדוד 40 גרם PDMS וארבעה גרם חומר ריפוי PDMS בכלי פלסטיק גדול. מערבבים את שני החלקים באופן שווה בעזרת מרית ומניחים את המנה בתוך מייבש ואקום למשך 20 עד 30 דקות כדי לנקות את כל הבועות מהתערובת.
תוך כדי הסרת גז. הנח תבנית יציקה על גבי פרוסת סיליקון מיקרו מובנית והשתמש במבנה המנחה סביב העיצוב כדי להצמיד אותה למקומה על פרוסת סיליקון שטוחה. מניחים תבנית יציקה נוספת מעל בחופשיות.
יוצקים כשלושה עד ארבעה גרם מתערובת Degas PDMS על שתי תבניות היציקה. מעבירים את שני פרוסות הסיליקון לפלטה חמה. רפאו את ה-PDMS ב-150 מעלות צלזיוס למשך שש דקות, ולאחר מכן התקררו.
מבני ה- PDMS המוצקים על הספסל בטמפרטורת החדר בעזרת מרית מתכת. הפרד בזהירות את גושי ה-PDMS המוצקים מהתבניות. הגן על משטחי ההדבקה של שני הבלוקים מפני זיהום חלקיקים וטביעות אצבע.
על ידי מריחת שכבה של סקוטש שקוף, ניתן כעת לטפל בחלקי ה-PDMS ולקצץ אותם לגודל בעזרת מספריים. לאחר החיתוך, הסר את הסרט מבלוק ה-PDMS המיקרו-מובנה והשתמש באגרוף חור ביופסיה כדי ליצור את יציאות הכניסה המיקרופלואידיות. זה משלים את תהליך הייצור של המחצית המיקרו-מובנית של המכשיר, וכעת הוא מוכן להדבקה ולהרכבה עם מקבילו השטוח.
כדי להכין את השירותים לחיבור PDMS ל-PDMS, התחל בציפוי סיבוב של שכבה של חומר ריפוי PDMS על פרוסת סיליקון ריקה ב-6,000 סל"ד למשך 30 שניות כשחומר הריפוי עדיין רטוב, הבא את ממשק ההדבקה של בלוק ה-PDMS המיקרו-מובנה למגע עם הפרוסה והפעל בעדינות לחץ על גבי ה-PDMS ליצירת אטימה חלקה ללא בועות. בשלב נפרד, הסר את סרט המגן מהמקביל השטוח. לאחר מכן הפרד לאט את ה-PDMS המיקרו-מובנה מפרוסת הסיליקון.
יישר בזהירות את שני חלקי ה-PDMS והבא את שני ממשקי ההדבקה למגע. סחטו בעדינות את שני הבלוקים כדי להסיר בועות פנים ולרפא את שבב ה-PDMS המורכב למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר באמצעות סכין שירות ומכשיר יישור, בצע חתך לאורך קו החיווי אורתוגונלי לפיית היציאה. בדוק את השבב במיקרוסקופ לאיתור פגמים וזיהום חלקיקים הסמוכים לפיית היציאה החשופה.
לאחר הערכת איכות הייצור, המשטחים הפנימיים של המיקרו-ערוץ PDMS מוכנים לסילו. במכסה מנוע כימי חבר קצה אחד של בקבוק זאב למקור חנקן יבש וחבר את הקצה השני של הבקבוק לכניסות שבב ה-PDMS. בעזרת מספר צינורות המחוברים לסעפת מרכזית, ואז פיפטה 50 מיקרוליטר של סלין לתוך בקבוק הזאב ואטום את המכסה העליון.
הפעל את זרם נושא החנקן ושטוף את תעלות המיקרו בתמיסת מלח המכילה אדים למשך 20 דקות בקצב זרימה של כמיליליטר לשנייה. לבסוף, נתק את צינורות הכניסה מבקבוק הזאב. שבבי ה-PDMS המצופים מוכנים לניסויים בספקטרומטריית מסה למדידות ספקטרומטריית מסה של תא בודד.
ראשית, יש לדלל את דגימת הקלט עם מאגר מתאים כך שהריכוז הסלולרי האפקטיבי יהיה פחות מ-10 מיליון תאים למיליליטר כהכנה לספקטרומטריית מסה, התחל בהצמדת צינורות למזרקי הדגימה. טען שני מזרקים של חמישה מיליליטר עם ה-PFH וטען את דגימת הקלט במזרק נפרד של מיליליטר אחד. הסר את כל הבועות הכלואות בתוך המזרקים והצינורות וטען את שני המזרקים על משאבת מזרק.
ודא שצינור ההובלה מיושר כהלכה וכל צינורות הגז מחוברים. לאחר מכן, חבר את צינורות המזרק ליציאות הכניסה של שבב ה-PDMS והפעל את משאבת המזרק למשך שלוש עד חמש דקות. במהלך תהליך ייצוב זרימה זה, הסר את כל הנוזלים העודפים מיציאת היציאה בעזרת רקמה.
אם הנוזל יוצא, השבב אינו יוצר סילון ישר. לאחר חמש דקות, נסה לנגב את כל החסימות הפוטנציאליות בשקע השבב בעזרת רקמה נקייה. אם לא הצליח, השלך את השבב הקיים והחלף את החיבור בשבב חדש.
הסר את התקע ממתאם המרסס הציקלוני והכנס בזהירות את שבב ה-PDMS מיוצב הזרימה למתאם. שנה את קצב הזרימה בהתאם להגדרות המומלצות, וייצב מחדש את הזרימה למשך שתיים עד חמש דקות. במקביל, התאם את קצבי הזרימה עבור כל הגזים עד להשגת עוצמת האות המקסימלית של האנליט המעניין.
כמו כן, כוונן את עוצמת הפלזמה ואת מתח עדשת המיקוד בספקטרומטר המסה כדי לשפר עוד יותר את עוצמת האות בעת אופטימיזציה של האות. הגדר את ספקטרומטר המסה לזמן שהייה של 10 אלפיות השנייה והתחל ברכישת נתונים. לאחר המדידות, העבר את הנתונים הגולמיים לתוכנית ניתוח נתונים.
בשגרת ניתוח נתונים טיפוסית, כל המדידות מופרדות תחילה לפחי נתונים כאשר כל סל מייצג את מספר הספירות לכל 10 אלפיות השנייה של זמן השהייה, ולאחר מכן נוצרת תרשים היסטוגרמה עבור כל הפחים ומצויד בפונקציית ההתפלגות הגאוסית. הממוצע וההתפשטות של התאמות בודדות מייצגים הן את עוצמת האות הממוצעת והן את סטיית התקן ביחס מסה למטען מסוים. כדי להתחיל בתהליך הכיול, ראשית, מדוד תמיסה סטנדרטית באותו קצב זרימה כמו הדגימה שלך.
באמצעות שבב PDMS ליצירת טיפות, הגדר שני מזרקים של חמישה מיליליטר ל-PFH ומזרק אחד של מיליליטר אחד לפתרון הסטנדרטי. לאחר מכן השתמש בצלחת פטרי כמחזיק דגימת מיקרוסקופ, הנח את שבב ה-PDMS בצלחת פטרי והביא את השבב למיקוד בהגדלה נמוכה המשקפת את שלבי הפרוטוקול הקודמים. ייצב את יצירת הטיפות במיקרו-ערוץ PDMS למשך שלוש עד חמש דקות עם מצלמה במהירות גבוהה.
התחל להקליט תמונות של טיפה מימית על שבב בצומת המשני כדי לקבל את קוטר הטיפה הממוצע מההקלטות. השתמש בתוכנה לניתוח תמונות עם חבילת שינוי צורה ייעודית, אופטומטריה וסימטריית velo. בהנחה שניתן לעצב כל טיפה כאובייקט כדורי, ניתן להעריך את נפח הטיפה הממוצע באמצעות קוטר הטיפה הממוצע המתקבל על ידי התוכנה.
לאחר מכן, חלקו את ריכוז האנליט הידוע של הדגימה בנפח הטיפה הממוצע כדי לקבל את מסת האנליט הכלולה בטיפה אחת. לאחר מכן המר את המסה המתקבלת למספר האטומים. לבסוף, חשב את יעילות הזיהוי הכוללת על ידי חלוקת מספר היונים הנמדדים לטיפה בתוצאה הקודמת.
יעילות זיהוי זו יכולה לשמש כעת ככמות כיול כדי לברר את מספר האטומים בדגימה לא ידועה. באמצעות מחולל טיפות מיקרופלואידי, ניתן לעטוף תאים בודדים בתוך טיפות מימיות מפוזרות מונו בקוטר ממוצע של פחות מ-50 מיקרון, ולנתח אותם על ידי I-C-P-M-S. ניתן להסיר בקלות את מעטפת ה-PFH האורגנית המקיפה את הטיפה המימית לפני שהדגימה מגיעה לגלאי I-C-P-M-S.
בעת מדידת פתרונות, ניתן לראות את פיזור הטיפות הגבוה כשונות נמוכה בין קבוצות של אותות המגיעים מספירת טיפות כפולה או משולשת בתוך זמן שהייה נתון. לאחר כיול נכון, ניתן לברר את תכולת הברזל ממכלול של תאי דם אדומים בודדים, שכל אחד מהם תלוי בטיפות בודדות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ולהשתמש בשבבים המיקרופלואידיים הללו לניתוח יסודות כמותי של נפחי דגימה קטנים מאוד או חלקיקים ותאים בודדים.
ייצור השבבים הללו דורש פחות מ-15 דקות, זמן מעשי לכל שבב אם הוא מבוצע כראוי. בנוסף, השבבים הקלים לשינוי מאפשרים שילוב של מודולים מיקרופלואידיים נוספים לטיפול מקדים מתקדם בדגימה והחדרה בו זמנית של דגימות ותקנים לשיפור היעילות ותפוקת הדגימות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג מערכת להכנסת דגימות טיפות בדידות לספקטרומטריית מסה של פלזמה מצמדת אינדוקטיבית (ICPMS). המערכת משתמשת בשבב מיקרו-נוזלי חסכוני כדי ליצור טיפות חד-גרגריות בגודל של 40-60 מיקרומטר בתדרים של 90 עד 7,000 הרץ.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ספקטרומטריית מסה
- מיקרו-נוזלים
- כימיה אנליטית
רקע
- ספקטרומטריית מסה של פלזמה מצמדת אינדוקטיבית (ICPMS) היא טכניקה אנליטית רבת עוצמה.
- מערכות מיקרו-נוזליות מאפשרות שליטה מדויקת על הדינמיקה של הנוזלים.
- טיפות חד-גרגריות חיוניות לניתוח עקבי של הדגימות.
- PDMS נפוץ בייצור שבבים מיקרו-נוזליים.
מטרת המחקר
- ליצור ולנתח את ההרכב היסודי של טיפות מיקרו חד-גרגריות.
- להקל על ניתוח של תאים בודדים או פתרונות מימיים.
- לשפר את יעילות הכנסת הדגימות ב-ICPMS.
שיטות ששימשו
- ייצור שבב מיקרו-נוזלי באמצעות יציקה עם PDMS.
- חיבור משאבות מזרקים לספק דגימות מימיות ופאזות נושאות אורגניות.
- ייצור טיפות חד-גרגריות באמצעות פוקוס זרימה.
- אדפורציה של הטיפות והסרת ממיסים לפני יינון וזיהוי.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של טיפות חד-גרגריות בטווח הגודל הרצוי.
- הכנסת דגימות יעילה למערכת ICPMS.
- ניתוח כמותי של ההרכב היסודי הושג.
- הוכחת יעילות המערכת לניתוח תאים בודדים.
מסקנות
- המערכת שפותחה משפרת את יכולות ICPMS.
- טכנולוגיית מיקרו-נוזלים מספקת פתרון בר ביצוע ליצירת טיפות.
- יישומים פוטנציאליים בתחומים שונים של כימיה אנליטית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This microfluidic droplet generation system enables precise, reproducible sample introduction for ICPMS, addressing a key bottleneck in high-throughput elemental analysis of biological samples. By producing monodisperse droplets with tunable size and frequency, the technology supports quantitative single-cell analysis while minimizing sample consumption and cross-contamination risks. These capabilities enhance predictive confidence in target validation workflows where elemental composition serves as a mechanistic biomarker or phenotypic readout.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of elemental composition in single cells, supporting functional target validation through direct measurement of metalloprotein activity or ion homeostasis.
- Operational Value: Reduces sample consumption to picoliter volumes, allowing precious primary cell samples to be screened without depletion.
- Predictive Confidence: Monodisperse droplet generation ensures low signal variance, improving reproducibility of elemental readouts across replicates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized platform for generating consistent aqueous droplets, essential for assay standardization in metalloproteomics or nanoparticle tracking.
- Operational Value: Disposable PDMS chips eliminate cleaning steps and cross-contamination, increasing throughput in compound screening campaigns.
- Scalability: Droplet frequency tunable from 90 to 7,000 Hz enables adjustment to match instrument duty cycle and detection limits.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by quantifying elemental content (e.g., iron in red blood cells) as a disease-relevant readout in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Enables correlation of elemental composition with cellular phenotype, reducing ambiguity in target mechanism of action.
- Preclinical Model Relevance: Compatible with bovine and potentially human primary cells, facilitating cross-species translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The system integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, where elemental profiling informs mechanism of action and off-target risk assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct measurement of metal ion flux or storage in single cells, clarifying pathway involvement.
- Screening: Delivers assay-ready, monodisperse droplets with quantitative output, ensuring reliable compound evaluation in metallodrug screening.
- Analytics: Generates histogram-fitted signal intensity and standard deviation per mass-to-charge ratio, enabling statistical comparison of elemental content across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by providing disease-relevant elemental metrics (e.g., iron overload) that correlate with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Chip design allows integration of additional microfluidic modules for sample pretreatment, supporting platform reuse across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct, single-cell elemental analysis reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and low sample consumption enable scalable workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions via early detection of metalloprotein engagement or ion dysregulation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative elemental profiles in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic fabrication, ICPMS operation, and droplet-based sample preparation.
- Needs syringe pumps, PDMS molding equipment, plasma source, and mass spectrometer with droplet-compatible interface.
- Standardization across teams requires consistent chip fabrication, flow rate calibration, and desolvation efficiency.
- Adaptation to other cell types or sample matrices may require optimization of surfactant compatibility and droplet stability.
- Practical limitation: Organic carrier phase (PFH) must be fully removed to prevent signal interference, necessitating optimized desolvation conditions.
