שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS
5 במרץ 2015
אנו מציגים מערכת מבוא מדגם אגל דיסקרטית לספקטרומטריית מצמידים אינדוקטיבי פלזמה המונית (ICPMS). הוא מבוסס על שבב microfluidic זול וחד פעמי שיוצר טיפות monodisperse ביותר בטווח גודל של 40-60 מיקרומטר בתדרים בין 90 ל -7,000 הרץ.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ולנתח כמותית את הרכב היסודות של מיקרו טיפות מפוזרות מונו המכילות תאים בודדים או תמיסות מימיות על ידי I-C-P-M-S. זה מושג על ידי ייצור תחילה של שבב מיקרופלואידי, באמצעות יציקת העתק עם PDMS. השלב השני הוא חיבור משאבות מזרק לשבב המיקרופלואידי.
המשאבות יספקו את הדגימה המימית ואת ה-PFH הנדיף והקביל או האורגני PFH. כאשר משאבת המזרק מופעלת, השבב המיקרופלואידי מייצר טיפות מפוזרות מונו של תמיסת הדגימה המימית או מתלה תא על ידי זרימה, תוך התמקדות ב-PFH ופולט את הטיפות הללו עם PFH נוסף מהשבב כסילון נוזלי. השלב האחרון הוא הכנסת השבב למכלול הובלה המורכב ממחמם מחסנית שמאדה את הטיפות וממברנה דה סלבטור שמסיר את הממיסים לפני היינון וזיהוי תכולת הטיפות על ידי I-C-P-M-S.
בסופו של דבר, האותות המוקלטים ומדידת כיול עם תמיסה סטנדרטית משמשים לקביעת הרכב היסודות של תמיסת הדגימה או התאים בתרחיף. היתרונות העיקריים של הטכניקה המיקרופלואידית שלנו על פני השיטות הקיימות הם גודל הטיפות המתכוונן, צריכת הדגימה הנמוכה והסיכון הנמוך לחוסר רישום בעבודה עם תרחיפי תאים או תמיסות מלח מרוכזות. יתר על כן, השבב המיקרופלואידי החד פעמי בעלות נמוכה מונע זמן ניקוי ומבטל זיהום צולב.
מדגימים את ההליך כולו vin sc, דוקטורנט ממעבדת פרופסור GTAs ופסקל פבריקה, דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בתהליך המיקרו-פבריקציה, מדוד 40 גרם PDMS וארבעה גרם חומר ריפוי PDMS בכלי פלסטיק גדול. מערבבים את שני החלקים באופן שווה בעזרת מרית ומניחים את המנה בתוך מייבש ואקום למשך 20 עד 30 דקות כדי לנקות את כל הבועות מהתערובת.
תוך כדי הסרת גז. הנח תבנית יציקה על גבי פרוסת סיליקון מיקרו מובנית והשתמש במבנה המנחה סביב העיצוב כדי להצמיד אותה למקומה על פרוסת סיליקון שטוחה. מניחים תבנית יציקה נוספת מעל בחופשיות.
יוצקים כשלושה עד ארבעה גרם מתערובת Degas PDMS על שתי תבניות היציקה. מעבירים את שני פרוסות הסיליקון לפלטה חמה. רפאו את ה-PDMS ב-150 מעלות צלזיוס למשך שש דקות, ולאחר מכן התקררו.
מבני ה- PDMS המוצקים על הספסל בטמפרטורת החדר בעזרת מרית מתכת. הפרד בזהירות את גושי ה-PDMS המוצקים מהתבניות. הגן על משטחי ההדבקה של שני הבלוקים מפני זיהום חלקיקים וטביעות אצבע.
על ידי מריחת שכבה של סקוטש שקוף, ניתן כעת לטפל בחלקי ה-PDMS ולקצץ אותם לגודל בעזרת מספריים. לאחר החיתוך, הסר את הסרט מבלוק ה-PDMS המיקרו-מובנה והשתמש באגרוף חור ביופסיה כדי ליצור את יציאות הכניסה המיקרופלואידיות. זה משלים את תהליך הייצור של המחצית המיקרו-מובנית של המכשיר, וכעת הוא מוכן להדבקה ולהרכבה עם מקבילו השטוח.
כדי להכין את השירותים לחיבור PDMS ל-PDMS, התחל בציפוי סיבוב של שכבה של חומר ריפוי PDMS על פרוסת סיליקון ריקה ב-6,000 סל"ד למשך 30 שניות כשחומר הריפוי עדיין רטוב, הבא את ממשק ההדבקה של בלוק ה-PDMS המיקרו-מובנה למגע עם הפרוסה והפעל בעדינות לחץ על גבי ה-PDMS ליצירת אטימה חלקה ללא בועות. בשלב נפרד, הסר את סרט המגן מהמקביל השטוח. לאחר מכן הפרד לאט את ה-PDMS המיקרו-מובנה מפרוסת הסיליקון.
יישר בזהירות את שני חלקי ה-PDMS והבא את שני ממשקי ההדבקה למגע. סחטו בעדינות את שני הבלוקים כדי להסיר בועות פנים ולרפא את שבב ה-PDMS המורכב למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר באמצעות סכין שירות ומכשיר יישור, בצע חתך לאורך קו החיווי אורתוגונלי לפיית היציאה. בדוק את השבב במיקרוסקופ לאיתור פגמים וזיהום חלקיקים הסמוכים לפיית היציאה החשופה.
לאחר הערכת איכות הייצור, המשטחים הפנימיים של המיקרו-ערוץ PDMS מוכנים לסילו. במכסה מנוע כימי חבר קצה אחד של בקבוק זאב למקור חנקן יבש וחבר את הקצה השני של הבקבוק לכניסות שבב ה-PDMS. בעזרת מספר צינורות המחוברים לסעפת מרכזית, ואז פיפטה 50 מיקרוליטר של סלין לתוך בקבוק הזאב ואטום את המכסה העליון.
הפעל את זרם נושא החנקן ושטוף את תעלות המיקרו בתמיסת מלח המכילה אדים למשך 20 דקות בקצב זרימה של כמיליליטר לשנייה. לבסוף, נתק את צינורות הכניסה מבקבוק הזאב. שבבי ה-PDMS המצופים מוכנים לניסויים בספקטרומטריית מסה למדידות ספקטרומטריית מסה של תא בודד.
ראשית, יש לדלל את דגימת הקלט עם מאגר מתאים כך שהריכוז הסלולרי האפקטיבי יהיה פחות מ-10 מיליון תאים למיליליטר כהכנה לספקטרומטריית מסה, התחל בהצמדת צינורות למזרקי הדגימה. טען שני מזרקים של חמישה מיליליטר עם ה-PFH וטען את דגימת הקלט במזרק נפרד של מיליליטר אחד. הסר את כל הבועות הכלואות בתוך המזרקים והצינורות וטען את שני המזרקים על משאבת מזרק.
ודא שצינור ההובלה מיושר כהלכה וכל צינורות הגז מחוברים. לאחר מכן, חבר את צינורות המזרק ליציאות הכניסה של שבב ה-PDMS והפעל את משאבת המזרק למשך שלוש עד חמש דקות. במהלך תהליך ייצוב זרימה זה, הסר את כל הנוזלים העודפים מיציאת היציאה בעזרת רקמה.
אם הנוזל יוצא, השבב אינו יוצר סילון ישר. לאחר חמש דקות, נסה לנגב את כל החסימות הפוטנציאליות בשקע השבב בעזרת רקמה נקייה. אם לא הצליח, השלך את השבב הקיים והחלף את החיבור בשבב חדש.
הסר את התקע ממתאם המרסס הציקלוני והכנס בזהירות את שבב ה-PDMS מיוצב הזרימה למתאם. שנה את קצב הזרימה בהתאם להגדרות המומלצות, וייצב מחדש את הזרימה למשך שתיים עד חמש דקות. במקביל, התאם את קצבי הזרימה עבור כל הגזים עד להשגת עוצמת האות המקסימלית של האנליט המעניין.
כמו כן, כוונן את עוצמת הפלזמה ואת מתח עדשת המיקוד בספקטרומטר המסה כדי לשפר עוד יותר את עוצמת האות בעת אופטימיזציה של האות. הגדר את ספקטרומטר המסה לזמן שהייה של 10 אלפיות השנייה והתחל ברכישת נתונים. לאחר המדידות, העבר את הנתונים הגולמיים לתוכנית ניתוח נתונים.
בשגרת ניתוח נתונים טיפוסית, כל המדידות מופרדות תחילה לפחי נתונים כאשר כל סל מייצג את מספר הספירות לכל 10 אלפיות השנייה של זמן השהייה, ולאחר מכן נוצרת תרשים היסטוגרמה עבור כל הפחים ומצויד בפונקציית ההתפלגות הגאוסית. הממוצע וההתפשטות של התאמות בודדות מייצגים הן את עוצמת האות הממוצעת והן את סטיית התקן ביחס מסה למטען מסוים. כדי להתחיל בתהליך הכיול, ראשית, מדוד תמיסה סטנדרטית באותו קצב זרימה כמו הדגימה שלך.
באמצעות שבב PDMS ליצירת טיפות, הגדר שני מזרקים של חמישה מיליליטר ל-PFH ומזרק אחד של מיליליטר אחד לפתרון הסטנדרטי. לאחר מכן השתמש בצלחת פטרי כמחזיק דגימת מיקרוסקופ, הנח את שבב ה-PDMS בצלחת פטרי והביא את השבב למיקוד בהגדלה נמוכה המשקפת את שלבי הפרוטוקול הקודמים. ייצב את יצירת הטיפות במיקרו-ערוץ PDMS למשך שלוש עד חמש דקות עם מצלמה במהירות גבוהה.
התחל להקליט תמונות של טיפה מימית על שבב בצומת המשני כדי לקבל את קוטר הטיפה הממוצע מההקלטות. השתמש בתוכנה לניתוח תמונות עם חבילת שינוי צורה ייעודית, אופטומטריה וסימטריית velo. בהנחה שניתן לעצב כל טיפה כאובייקט כדורי, ניתן להעריך את נפח הטיפה הממוצע באמצעות קוטר הטיפה הממוצע המתקבל על ידי התוכנה.
לאחר מכן, חלקו את ריכוז האנליט הידוע של הדגימה בנפח הטיפה הממוצע כדי לקבל את מסת האנליט הכלולה בטיפה אחת. לאחר מכן המר את המסה המתקבלת למספר האטומים. לבסוף, חשב את יעילות הזיהוי הכוללת על ידי חלוקת מספר היונים הנמדדים לטיפה בתוצאה הקודמת.
יעילות זיהוי זו יכולה לשמש כעת ככמות כיול כדי לברר את מספר האטומים בדגימה לא ידועה. באמצעות מחולל טיפות מיקרופלואידי, ניתן לעטוף תאים בודדים בתוך טיפות מימיות מפוזרות מונו בקוטר ממוצע של פחות מ-50 מיקרון, ולנתח אותם על ידי I-C-P-M-S. ניתן להסיר בקלות את מעטפת ה-PFH האורגנית המקיפה את הטיפה המימית לפני שהדגימה מגיעה לגלאי I-C-P-M-S.
בעת מדידת פתרונות, ניתן לראות את פיזור הטיפות הגבוה כשונות נמוכה בין קבוצות של אותות המגיעים מספירת טיפות כפולה או משולשת בתוך זמן שהייה נתון. לאחר כיול נכון, ניתן לברר את תכולת הברזל ממכלול של תאי דם אדומים בודדים, שכל אחד מהם תלוי בטיפות בודדות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ולהשתמש בשבבים המיקרופלואידיים הללו לניתוח יסודות כמותי של נפחי דגימה קטנים מאוד או חלקיקים ותאים בודדים.
ייצור השבבים הללו דורש פחות מ-15 דקות, זמן מעשי לכל שבב אם הוא מבוצע כראוי. בנוסף, השבבים הקלים לשינוי מאפשרים שילוב של מודולים מיקרופלואידיים נוספים לטיפול מקדים מתקדם בדגימה והחדרה בו זמנית של דגימות ותקנים לשיפור היעילות ותפוקת הדגימות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מערכת להחדרת דגימות של טיפות בדיסקרטיות עבור ספקטרומטריית מסות עם פלזמה השראית (ICPMS). המערכת משתמשת בשבב מיקרופלואידייךיחסית בעלות נמוכה כדי להפיק טיפות מונו-דיספרסיות מאוד בטווח גדלים של 40−60 µm בתדרים של 90 עד 7,000 Hz.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ספקטרומטריה של מסות
- מיקרופלואידיקה
- כימיה אנליטית
רקע
- ספקטרומטריית מסה עם פלזמה מצומדת השראית (ICPMS) היא טכניקה אנליטית עוצמתית.
- מערכות מיקרופלואידיות מאפשרות בקרה מדויקת על דינמיקת נוזלים.
- טיפות מונו-דיספרסיות חיוניות לניתוח דגימות עקבי.
- PDMS משמש באופן נפוץ בייצור שבבים מיקרופלואידיים.
מטרת המחקר
- ליצירה ולניתוח של ההרכב האלמנטרי של מיקרו-טיפות מונו-דיספרסיביות.
- להקל על ניתוח של תאים בודדים או תמיסות מימיות.
- לשיפור יעילות הכנסת הדגימות ל-ICPMS.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של שבב מיקרופלואידי באמצעות יציקה של העתק עם PDMS.
- חיבור של משאבות מזרקים לאספקת דגימות מימיות ושלבי נשא אורגניים.
- יצירה של טיפות מונו-דיספרסיות באמצעות מיקוד זרימה.
- אידוי של טיפות והסרה של ממסים לפני יינון וזיהוי.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של טיפות מונו-דיספרסיות בטווח הגדלים הרצוי.
- החדרה יעילה של הדגימה למערכת ה-ICPMS.
- ביצוע אנליזה כמותית של ההרכב האלמנטרי.
- הדגמת יעילות המערכת לאנליזה של תא בודד.
מסקנות
- המערכת שפותחה משפרת את היכולות של ICPMS.
- טכנולוגיה מיקרופלואידית מספקת פתרון בר-קיימא ליצירת טיפות.
- יישומים פוטנציאליים בתחומים שונים של כימיה אנליטית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכת זו ליצירת טיפות מיקרופלואידיות מאפשרת הכנסה מדויקת וניתנת לשחזור של דגימות עבור ICPMS, ובכך פותרת צוואר בקבוק מרכזי בניתוח אלמנטרי בעוצמה גבוהה של דגימות ביולוגיות. באמצעות ייצור טיפות מונו-דיספרסיות עם גודל ותדירות ניתנים לכיוונון, הטכנולוגיה תומכת בניתוח כמותי של תא בודד תוך מזעור צריכת הדגימה והפחתת הסיכונים לזיהום צולב. יכולות אלו מגבירות את הביטחון החזוי בתהליכי עבודה של תיקוף מטרות, שבהם ההרכב האלמנטרי משמש כסמן ביולוגי מכניסטי או כקריאה פנוטיפית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של הרכב יסודות בתאים בודדים, ותומך בתיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות מדידה ישירה של פעילות חלבוני מתכת או הומאוסטזיס של יונים.
- ערך תפעולי: מפחית את צריכת הדגימה לנפחים של picoliter, ובכך מאפשר סריקה של דגימות תאי מקור יקרים ללא דלטורן.
- ביטחון חיזוי: יצירת טיפות מונו-דיספרסיות מבטיחה שונות נמוכה של האות, ובכך משפרת את השחזוריות של קריאות היסודות בין חזרות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספקת פלטפורמה סטנדרטית ליצירת טיפות מימיות עקביות, החיוניות לסטנדרטיזציה של בדיקות במטלופרוטאומיקה או במעקב אחר ננו-חלקיקים.
- ערך תפעולי: שבבי PDMS חד-פעמיים מבטלים את שלבי הניקוי ואת זיהום הצילוב, ובכך מגדילים את התפוקה במערכי סריקת תרכובות.
- יכולת הרחבה: תדר טיפות הניתן לכיוונון מ-90 עד 7,000 Hz מאפשר התאמה למחזור העבודה של המכשיר ולמגבלות הגילוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך בהתאמת סממנים ביולוגיים על ידי כימות התוכן האלמנטלי (למשל, ברזל בתאי דם אדומים) כמדד רלוונטי למחלה במודלים פרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר התאמה בין ההרכב האלמנטלי לפנוטיפ התאי, ובכך מפחית עמימות לגבי מנגנון הפעולה של המטרה.
- רלוונטיות למודלים פרה-קליניים: תואם לתאים ראשוניים של בקר ופוטנציאלית של בני אדם, מה שמקל על מחקרי תרגום בין מינים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
המערכת משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישוש מטרות מוקדם ועד לזיהוי מובילים (lead identification), כאשר פרופיל אלמנטים מספק מידע על מנגנון הפעולה והערכת סיכוני יעדים לא רצויים (off-target risk).
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות למדידה ישירה של שטף או אגירה של יוני מתכת בתאים בודדים, ובכך מבהירה את מעורבותם של נתיבים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת טיפות מונו-דיספרסיות המוכנות לבדיקה עם פלט כמותי, מה שמבטיח הערכה מהימנה של תרכובות בסריקה של תרופות מבוססות מתכת.
- אנליטיקה: מייצרת עצימות אות מותאמת להיסטוגרמה וסטיית תקן עבור כל יחס מס-מטען, המאפשרים השוואה סטטיסטית של תכני יסוד תחת תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מדדים אלמנטריים רלוונטיים למחלה (למשל, עומס ברזל) המתואמים עם תוצאות תפקודיות.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב השבב מאפשר שילוב של מודולים מיקרופלואידיים נוספים להכנה מוקדמת של דגימות, ובכך תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה לאורך פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה באמצעות ניתוח אלמנטרי ישיר של תא בודד, המפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות וצריכת דגימות נמוכה מאפשרים תהליכי עבודה ניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) באמצעות זיהוי מוקדם של מעורבות חלבונים מתכתיים או הפרעה בוויסות יונים, ובכך הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מטרות מותאם סיכון המבוסס על פרופילים אלמנטריים כמותיים במערכות הרלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בייצור מיקרופלואידי, תפעול ICPMS והכנת דגימות מבוססת טיפות.
- נדרשים משאבות מזרקים, ציוד ליצירת תבניות PDMS, מקור פלזמה וספקטרומטר מסות עם ממשק תואם טיפות.
- סטנדרטיזציה בין צוותים דורשת ייצור עקבי של שבבים, כיול קצב זרימה ויעילות דסולבציה (desolvation).
- התאמה לסוגי תאים אחרים או למטריצות דגימה שונות עשויה לדרוש אופטימיזציה של התאימות לחומרי פעילי-שטח ויציבות הטיפות.
- מגבלה מעשית: יש להסיר לחלוטין את הפאזה הנושאת האורגנית (PFH) כדי למנוע הפרעות באות, דבר המחייב תנאי דסולבציה אופטימליים.
