Name: Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב Xenopus עוברים על ידי שבב Seq (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: חקור את שיטת ChIP-Seq למיפוי רגולטורים כרומטין ומצבי כרומטין בזחלי Xenopus. פרוטוקול זה מאפשר הבנה מעמיקה של ארכיטקטורת הכרומטין בפיתוח עוברי והחלתו במודלים ביולוגיים נוספים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לכריס בנר על הטמעת הגנום של X. tropicalis (xenTro2, xenTro2r) ב-HOMER ובמעבדת גילכריסט לדיונים על ניתוח לאחר ריצוף. I.P. סייע בניתוח המונחים של GO. G.E.G ו-J.C.S. נתמכו על ידי Wellcome Trust וכעת נתמכים על ידי המועצה למחקר רפואי (תוכנית מספר U117597140).

<ol><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li>
<li>Blythe, S. A., Reid, C. D., Kessler, D. S., Klein, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+in+early+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation in early Xenopus laevis embryos.</a> Dev Dyn. 238 (6), 1422-1432 (2009).</li>
<li>Gentsch, G. E., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+physical+chromatin+associations+across+the+Xenopus+genome+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Investigating physical chromatin associations across the Xenopus genome by chromatin immunoprecipitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Imoto, S., Nolan, J., Bioinformatics Miyano, S. 20 (9), 1453-1454 (2004).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10, 421(2009).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast2GO%3A+a+universal+tool+for+annotation%2C+visualization+and+analysis+in+functional+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2000).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+factors+influencing+ChIP-seq+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity.</a> Nat Methods. 9 (6), 609-614 (2012).</li>
<li>Sharov, A. A., Ko, M. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhaustive+search+for+over-represented+DNA+sequence+motifs+with+CisFinder%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Exhaustive search for over-represented DNA sequence motifs with CisFinder.</a> DNA Res. 16 (5), 261-273 (2009).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEME+SUITE%3A+tools+for+motif+discovery+and+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEME SUITE: tools for motif discovery and searching.</a> Nucl Acids Res. 37 (2), W202-W208 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Gentsch, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+T-box+transcription+factor+profiling+reveals+joint+regulation+of+embryonic+neuromesodermal+bipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo T-box transcription factor profiling reveals joint regulation of embryonic neuromesodermal bipotency.</a> Cell Rep. 4 (6), 1185-1196 (2013).</li>
<li>Barabasi, A. L., Oltvai, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+biology%3A+understanding+the+cell%27s+functional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Network biology: understanding the cell's functional organization.</a> Nat Rev Genet. 5 (2), 101-113 (2004).</li>
<li>Biggin, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+transcription+networks+as+highly+connected%2C+quantitative+continua%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Animal transcription networks as highly connected, quantitative continua.</a> Dev Cell. 21 (4), 611-626 (2011).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland. New York & London. (1994).</li>
<li>Akkers, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+H3K4me3+and+H3K27me3+acquisition+in+spatial+gene+regulation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in Xenopus embryos.</a> Dev Cell. 17 (3), 425-434 (2009).</li>
<li>Yoon, S. J., Wills, A. E., Chuong, E., Gupta, R., Baker, J. C. HEB and E2A function as SMAD/FOXH1 cofactors. Genes Dev. 25 (15), 1654-1661 (2011).</li>
<li>Jallow, Z., Jacobi, U. G., Weeks, D. L., Dawid, I. B., Veenstra, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+and+redundant+roles+of+TBP+and+a+vertebrate-specific+TBP+paralog+in+embryonic+gene+regulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specialized and redundant roles of TBP and a vertebrate-specific TBP paralog in embryonic gene regulation in Xenopus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (37), 13525(2004).</li>
<li>Buchholz, D. R., Paul, B. D., Shi, Y. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-specific+changes+in+promoter+occupancy+by+thyroid+hormone+receptor+during+frog+metamorphosis.+Implications+for+developmental+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene-specific changes in promoter occupancy by thyroid hormone receptor during frog metamorphosis. Implications for developmental gene regulation.</a> J Biol Chem. 280 (50), 41222-41228 (2005).</li>
<li>Wills, A. E., Guptaa, R., Chuonga, E., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+deep+sequencing+in+Xenopus+tropicalis+and+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and deep sequencing in Xenopus tropicalis and Xenopus laevis.</a> Methods. 66 (3), 410-421 (2014).</li>
<li>Metz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+formaldehyde-induced+modifications+in+proteins%3A+reactions+with+model+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactions with model peptides.</a> J Biol Chem. 279 (8), 6235-6243 (2004).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-based+mapping+of+developmental+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs.</a> Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).</li>
<li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18 (6), 1030-1040 (2010).</li>
<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד לבצע ולנתח פרופילי הכרומטין הגנום מעוברי צפרדעים. היא משתרעת על כל צעד מחלבונים cross-linking ללוקוסי אנדוגני in vivo לעיבוד מיליוני כניסות המייצגים אתרים הגנומי מועשרות בסיליקון ו. מכיוון שמספרים גדלים והולכים של טיוטות הגנום זמינים, פרוטוקול זה צריך להיות ישים לאורגניזמים מודל ולא מודל אחרים. הסעיף הניסיוני החשוב ביותר, הקובע פרוטוקול זה מלבד העבודה קודמת 8,31,33,34, הוא ההליך שלאחר הקיבוע-לחלץ גרעינים צולבים. זה מקל solubilisation יעיל הכרומטין וגז וupscaling קל. יחד עם יעילות משופרת של הכנת ספריית פרוטוקול זה מאפשר הבנייה של ספריות שבב Seq גבוהות מורכבות מחצי עד שני מיליון תאים המבטאים את epitope הקשורים הכרומטין של עניין. בניסויים שבב qPCR, כמה עשרה אלף תאים אלה הם בדרך כלל מספיקכדי לבדוק להעשרת DNA באולי שישה לוקוסים הגנומי מובחנים. מספרים אלה הם הערכות שמרניות, אך עשוי להשתנות בהתאם לרמת ביטוי חלבון, איכות נוגדן, cross-linking יעילות, ונגישות epitope. כמדריך, עובר Xenopus אחת מכיל כ -4,000 תאים בשלב אמצע blastula (8.5 לאחר Nieuwkoop וFaber 29), 40,000 תאים בשלב gastrula מאוחר (12) ו100,000 תאים בשלב מוקדם tailbud (20). זמן הקיבעון המדויק לimmunoprecipitation היעילה צריך להיקבע באופן אמפירי על ידי שבב qPCR (סעיף 10). באופן כללי, פעמים קיבעון יותר נדרשות אם הניסוי כרוך X. laevis עוברים, שלבי התפתחות מוקדמים, ומאפיינים המחייבים DNA חלשים (או עקיפים). עם זאת, זה לא מומלץ תיקון עוברי Xenopus יותר מ -40 דקות, או עיבוד נוסף עוברי מכפי שצוין (סעיף 3), כגז הכרומטין הופך להיות פחות יעיל. חשוב לאלהשתמש בכל גליצין לאחר הקיבוע כצעד משותף זה למרווית פורמלדהיד יכול לעשות מיצוי גרעיני מעוברי חלמון עשיר מאוד קשים. נכון לעכשיו, הסיבה לכך אינה ידועה. זה מתקבל על הדעת כי adduct פורמלדהיד-גליצין מגיב נוסף עם N-מסוף אמינו-קבוצות או שאריות ארגינין 35. הנוגדן הוא מפתח לכל ניסוי שבב ובקרות מספיקות צריכה להתבצע כדי להראות את ייחודה לepitope של עניין (ראה הנחיות בLandt et al. 36). אם אין נוגדני כיתה שבב נגיש, כניסתה של מקביל חלבוני היתוך מתויג epitope עשויה להיות חלופה לגיטימית כחלבונים אלה יכולים לכבוש endogeneous אתרי קישור 37. במקרה זה, עובר uninjected הם הטובים ביותר לשימוש כביקורת שלילית ולא שבב עם סרום שאינו ספציפי. אסטרטגיה זו יכולה גם להיות מיושמת אם החלבון של העניין בא לידי ביטוי ברמות נמוכות וכתוצאה מכך עני ההתאוששות של enriDNA CHED. כלהכנת ספריות שבב Seq, בגלל הכמות הנמוכה של ה- DNA בשימוש, מומלץ לבחור בנהלים המפחיתים את מספר צעדי ניקוי ולשלב תגובות כדי לשמור על כל אובדן של DNA במינימום. המתאמים ופריימרים צריכים להיות תואם עם רצף זמנית ופלטפורמת NGS (ראו טבלה של חומרים / ציוד ספציפי). אם אתה משתמש Y-מתאמים (המכיל נשק חד-גדילים ארוכים), זה הוא קריטי מראש להגביר את הספרייה עם 04:57 סבבים של PCR לפני מוסיף DNA בחירה בגודל (למשל., 100 עד 300 נ&quot;ב) על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה. קצוות חד-גדילים לגרום שברי DNA להעביר הטרוגני. מבחנים שנערכו עם כמויות שונות של DNA קלט (למשל, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 ו -20 ng) מומלצים לקבוע את המספר הכולל של מחזורי PCR (פחות או שווה ל -18 מחזורים) הנדרש כדי להפוך את גודל ספריית -selected של 100 עד 200 ng. צמצום מספר מחזורי PCR הופך את הרצף של redundant קורא פחות סביר. חרוזים קיבוע הפיכים שלב מוצק טובים לנקות ריאגנטים לשחזר ביעילות את ה- DNA של עניין ובאמינות להסיר כל מתאמים והדימרים חופשיים מקשירה ותגובות PCR. במונחים של מספר, סוג ואורך של קורא, סביב 20-30,000,000 חד-הסוף קורא של 36 נ&quot;ב הוא מספיק עבור רוב ניסויי שבב Seq כדי לכסות את הגנום Xenopus השלם עם עומק מספיק. מכונות NGS הנפוצות ביותר הן מסוגלים לעמוד בקריטריונים אלה באופן שוטף. עם זאת, זה עשוי להיות מועיל כדי להגדיל את מספר קורא אם הפצות רחבות של קורא צפויות, כפי שנצפה בשינויים היסטון, ולא בפסגות חדות. בניסויים שבב Seq רבים, ניתן ונקווה 4-5 ספריות שונות צמודות ורצף בנתיב תא זרימה חד באמצעות מכונה NGS עתיר ביצועים. לפעמים כן, מומלץ להאריך את אורך הקריאה ורצף בשני הקצוות של תבנית ה- DNA (לזווג-end) כדי להגדיל את mappability wניתוח תרנגולת הכרומטין בתוך אזורים הגנומי חוזר על עצמו. פרוטוקול זה יושם בהצלחה במגוון רחב של תכונות הכרומטין כגון גורמי שעתוק, מתווכי איתות ושינויי היסטון לאחר translational. עם זאת, עובר לרכוש תואר הולך וגדל של ההטרוגניות סלולרית כפי שהם מפתחים ופרופילי הכרומטין להיות קשים יותר לפרש. צעדים מבטיחים נעשו בארבידופסיס ותסיסנית לנופי הכרומטין רקמות ספציפי פרופיל על ידי מיצוי גרעיני סוג ספציפי תא 38,39. הפרוטוקול שלנו כולל שלב חילוץ גרעיני, אשר יכול לסלול את הדרך לרקמות ספציפיות שבב Seq בעוברים אחרים.

הניסיונות הראשונים לאפיין אינטראקציות חלבון-DNA in vivo דווחו לפני כ-30 שנה במאמץ להבין את שעתוק הגנים בתיווך RNA פולימראז בחיידקים ובזבוב הפירות1,2. מאז, השימוש במשקעים חיסוניים להעשרת תכונות כרומטין מובחנות (ChIP) אומץ באופן נרחב כדי ללכוד אירועי קשירה ומצבי כרומטין ביעילות גבוהה3. לאחר מכן, עם הופעתן של טכנולוגיות מיקרו-מערך חזקות, שיטה זו הובילה לאפיון נופי כרומטין ברחבי הגנום4. לאחרונה, פרופיל כרומטין הפך למקיף עוד יותר וברזולוציה גבוהה, מכיוון שניתן כעת לרצף מיליוני תבניות DNA בעלות משקעים חיסוניים במקביל ולמפות אותן לגנום (ChIP-Seq)5. ככל שמספר הולך וגדל של מכלולי גנום זמינים, ChIP-Seq היא גישה אטרקטיבית ללמוד עוד על ויסות הגנום העומד בבסיס תהליכים ביולוגיים. 
כאן אנו מספקים פרוטוקול לביצוע ChIP-Seq על עוברים עשירים בחלמון, כמו אלה של הצפרדע Xenopus. טיוטות של הגנום של שני מיני הקסנופוס הנפוצים - X. tropicalis ו- X. laevis - שוחררו כעת על ידי הקונסורציום הבינלאומי לגנום קסנופוס 6. העוברים של מיני קסנופוס חולקים תכונות רצויות רבות המקלות ומאפשרות פירוש של מחקרי כרומטין ברחבי הגנום, כולל ייצור מספר רב של עוברים באיכות גבוהה, גודלם הגדול של העוברים עצמם והתפתחותם החיצונית. בנוסף, העוברים ניתנים למניפולציות קלאסיות וחדשניות כמו מעקב אחר שושלת תאים, הכלאה שלמה באתר, ביטוי יתר של RNA וטכנולוגיית נוקאאוט בתיווך TALEN/CRISPR.
הפרוטוקול הבא מתבסס על עבודתם של Lee et al., Blythe et al. ו-Gentsch et al. 7-9. בקצרה, עוברי קסנופוס מקובעים בפורמלדהיד בשלב ההתפתחותי המעניין לקשור קוולנטית (קישור צולב) חלבונים ל- DNA הגנומי הקשור אליהם. לאחר מיצוי גרעיני, כרומטין צולב מקוטע כדי למקד את הריצוף הבא באתרי קשירה או שינוי גנומיים ספציפיים, וכדי למזער את התרומות של רצפי DNA מאגפים. לאחר מכן, שברי הכרומטין עוברים חיסון עם נוגדן בדרגת ChIP כדי להעשיר את אלה המכילים את החלבון המבוקש. ה-DNA המשקע החיסוני מופשט מהחלבון ומטוהר לפני יצירת ספריית אינדקס (קצה מזווג) לריצוף הדור הבא (NGS). בסוף, מוצעות שורות פקודה פשוטות לניתוח לאחר ריצוף של נתוני ChIP-Seq.

<table><tbody><tr><td>מיקרוטיפ מחודד בגודל 1/16 אינץ'</td><td>Qsonica</td><td>4417</td><td>מיקרוטיפ זה תואם ל-Sonicator 3000 מבית Misonix ו-Q500/700 מ-Qsonica.</td></tr><tr><td>בקבוקון דגימת זכוכית 8 מ"ל עם מכסה</td><td>Wheaton</td><td>224884</td><td>בקבוקוני דגימת זכוכית שקופים 8 מ"ל לדגימות מימיות עם מכסי בורג מרופדים בגומי פנולי בגודל 15-425.</td></tr><tr><td>מתאם</td> למשל, מתאם אוניברסלי <td>IDT או Sigma</td><td>NA</td><td>TruSeq, 
AATGATACGGCGACCACCGAG 
ATCTACACTCTTTCCCTACAC 
GACGCTCTTCCGATC*T. מתאם אינדקס של TruSeq, 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC 
TGAACTCCAGTCAC &#8208; NNNNNN&#8208; 
ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, קבוצת פוספורותיואט בונדפוספט ב-5' קצה. NNNNNN, אינדקס (ראה מדריך הכנת דגימת TruSeq ChIP לרצף DNA). מתאמי הזמנה HPLC מטוהרים. ניתן להכין מתאמים על ידי שילוב כמויות שוות ערך (כל אחד 100 & #181; M) של האוניברסלי והמתאם האינדקס וקירור איטי מ-95 ו-#176; C לטמפרטורת החדר. השתמש ב-1.5 pmol לכל גרם של קלט DNA. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>b2g4pipe (תוכנה)</td> <td>Blast2GO</td><td>לא מסחרי</td><td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td></tr><tr><td>BLAST+ (תוכנה)</td> <td>Camacho et al.</td><td>לא מסחרי</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&amp; DOC_TYPE=הורד</td></tr><tr><td>Bowtie (תוכנה)</td><td>Langmead et al.</td><td>לא מסחרי</td><td></td></tr><tr><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml cisFinder (תוכנה)</td><td>Sharov et al.</td>שבב <td>http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/ לא מסחרי</td><td></td></tr> <tr><td>לאלקטרופורזה נימית</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td>טען את השבב הזה עם 1 ומיקרו; l DNA לבקרת איכות ספרייה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה נימית מבוססת שבב</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td>ה-Agilent 2100 BioAnalyzer משמש לבדיקת האיכות של ספריות ChIP-Seq. שמור על ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ערכת הכנת ספריית ChIP-Seq (ערכת KAPA Hyper Prep)</td>ערכת <td>KAPA Biosystems</td><td>KK8504</td><td>מכילה תיקון קצה KAPA ותערובת אנזימים A-tailing, מאגר תיקון קצה וזנב A, DNA ליגאז, מאגר קשירה, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) ותערובת פריימר הגברה של ספריית KAPA (10X) (ראה גם פריימרים PCR). מתאמים אינם כלולים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ערכת הכנת ספריית ChIP-Seq (אלטרנטיבית, ערכת הכנה ThruPLEX-FD)</td>ערכת <td>Rubicon Genomics</td><td>R40048</td><td>משתמשת במתאמי לולאת גזע ופריימרים משלהם. ערכה זו מבטלת שלבי טיהור ביניים והיא רגישה כמו ערכת KAPA Hyper Prep. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Cluster3 (software)</td><td>de Hoon et al.</td><td>לא מסחרי</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster</td></tr><tr><td>FastQC (תוכנה)</td><td>סיימון אנדרוז</td> לא <td>מסחרי</td><td></td></tr><tr><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc טכנולוגיות חיים</td><td>פלואורומטר</td><td>Q32866</td><td>Qubit 2.0 פלואורומטר</td></tr><tr><td>פלואורומטר</td><td>ריאגנטים טכנולוגיות חיים</td><td>Q32851</td><td>הערכה מספקת ריאגנט בדיקה מרוכז, מאגר דילול ותקני DNA מדוללים מראש עבור הפלואורומטר של קיוביט. אחסן תקני DNA ב-4 מעלות; C, חוצץ וצובע בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>F8775-4X25ML</td><td>תמיסת פורמלדהיד, לביולוגיה מולקולרית, 36.5-38% ב-H2O, מיוצב עם 10-15% מתנול. יש לאחסן בטמפרטורת החדר. זהירות: פורמלדהיד הוא קורוזיבי ורעיל מאוד.</td></tr><tr><td>ג'ל (E-Gel EX agarose, 2%)</td><td>life technologies</td><td>G4010</td><td>ג'ל יצוק מראש עם 11 בארות, פורמט הניתן לפתיחה. השאירו נתיב אחד בין הסולם לספרייה ריק כדי למנוע זיהום צולב. אחסן ג'לים בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td> של <td>מערכת אלקטרופורזה ג'ל</td><td>G6465</td><td>E-Gel iBase ו-E-Gel Safe Imager ערכה משולבת לבחירת גודל ספריות ChIP-Seq.</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>אחסן את כל הריאגנטים בטמפרטורת החדר. השתמש ב-500 ומיקרו; l של מאגר QG לכל 100 מ"ג של פרוסת ג'ל אגרוז 2% למיצוי DNA. השתמש בעמודות MinElute (מתוך ערכת טיהור PCR של MinElute) כדי לנטרל DNA פעמיים.</td></tr><tr><td>HOMER (תוכנה)</td><td>כריס בנר</td><td>תנור</td><td></td></tr><tr><td>היברידיזציה</td> לא מסחרי http://homer.salk.edu/homer/index.html <td>Techne</td><td>FHB1D</td><td>Hybridizer HB-1D</td></tr><tr><td>IGV (תוכנה)</td><td>רובינסון ואחרים.</td><td>מסנן איכות לא מסחרי</td><td></td></tr><tr><td>http://www.broadinstitute.org/igv/home Illumina CASAVA-1.8 (תוכנה)</td><td>אסף גורדון</td><td>לא מסחרי</td><td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td></tr><tr><td>Java TreeView (תוכנה)</td><td>אלוק סלדניה</td><td></td><td>שקע מעבדה לא מסחרי</td></tr><tr><td>http://jtreeview.sourceforge.net Edu-Lab</td><td></td><td>CH0642</td><td>שקע זה משמש להעלאת הדגימה במארז הקול לסוניקציה.</td></tr><tr><td>סולם, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231</td><td>שמור תמיסה 1x בטמפרטורת החדר. אחסן מלאי ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>סולם, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232</td><td>שמור תמיסה 1x בטמפרטורת החדר. אחסן מלאי ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה בעלי שימור נמוך 1.5 מ"ל</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>AM12450</td><td>צינורות מיקרופוגה ללא הידבקות, ללא RNase, 1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>MACS2 (תוכנה)</td> <td>טאו ליו</td><td>לא מסחרי</td><td>https://github.com/taoliu/MACS</td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td><td>של חרוזים מגנטיים</td><td>11201D</td><td>חרוזים אלה הם חרוזים סופר-פרמגנטיים עם זיקה מטוהרת כבשים פוליקלונליות נגד עכבר IgG הקשורים קוולנטית למשטח החרוז. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td> <td>של חרוזים מגנטיים</td><td>11203D</td><td>Dynabeads אלה הם חרוזים סופר-פרמגנטיים עם זיקה מטוהרת כבשים פוליקלונליות נגד ארנב IgG הקשורים קוולנטית למשטח החרוז. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td> <td>של חרוזים מגנטיים</td><td>10001D</td><td>Dynabeads אלה הם חרוזים סופר-פרמגנטיים עם חלבון רקומביננטי A הקשור קוולנטית למשטח החרוז. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td> <td>של חרוזים מגנטיים</td><td>10003D</td><td>Dynabeads אלה הם חרוזים סופר-פרמגנטיים עם חלבון רקומביננטי G הקשור קוולנטית למשטח החרוז. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td> <td>מתלה מגנטי</td><td>12321D</td><td>מגנט DynaMag-2</td></tr><tr><td>MEME</td><td>Bailey et al.</td><td>לא מסחרי</td><td></td></tr> <tr><td>http://meme.nbcr.net/meme/ Na3VO4</td><td>New England BioLabs</td><td>P0758</td><td>נתרן אורתוואנדאט (100 מ"מ) הוא מעכב כללי נפוץ לחלבון פוספוטירוזיל פוספטאזות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>NaF</td><td>New England BioLabs</td><td>P0759</td><td>נתרן פלואוריד (500 מ"מ) משמש בדרך כלל כמעכב כללי של פוספוסריל ופוספותראוניל פוספטאזות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מכונת NGS</td><td>Illumina</td><td>SY-301-1301</td><td>Genome Analyzer IIx</td></tr><tr><td>מכונת NGS (ביצועים גבוהים)</td> <td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>HiSeq</td></tr><tr><td>סרום רגיל (בקרת נוגדנים)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2028</td><td>השתמש כבקרה לנוגדני IgG רב-שבטיים של עזים בניסויי ChIP-qPCR. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>סרום רגיל (בקרת נוגדנים)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td>השתמש כבקרה לנוגדני IgG רב-שבטיים של עכברים בניסויי ChIP-qPCR. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>סרום רגיל (בקרת נוגדנים)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td>השתמש כבקרה לנוגדני IgG רב-שבטיים של ארנב בניסויי ChIP-qPCR. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמיסת צביעת חומצות גרעין</td><td>iNtRON</td><td>21141</td><td>השתמש בתמיסת צביעת חומצות גרעין RedSafe ב-1:50,000. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>כתום G</td><td>Sigma</td><td>O3756-25G</td><td>1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-חומצה דיסולפונית מלח דיסודיום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>פריימרים PCR</td><td>למשל, IDT או Sigma</td><td></td><td>Primers להעשרת שברי DNA קשורים במתאם על ידי PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G ו-CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, קשר פוספורותיואט. פריימרים שתוכננו על ידי איתן פורד. שלבו פריימרים ב-5 ומיקרו; M כל אחד. שימוש ב-5 ובמיקרו; l ב-50 ומיקרו; l תגובת PCR. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR של MinElute&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td>לטיהור דגימות בדיקת ChIP-qPCR וגזירה. אחסן עמודי סיבוב MinElute ב-4 מעלות; C, כל שאר המאגרים וצינורות האיסוף בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25:24:1, pH 7.9)</td> <td>טכנולוגיות חיים</td><td>AM9730</td><td>פנול: כלורופורם: IAA (25:24:1) מעורבב מראש ומסופק ב-pH 6.6. השתמש במאגר טריס אלקליין כדי להעלות את ה-pH ל-7.9. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זהירות: פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל הוא מאכל, רעיל מאוד ודליק.</td></tr><tr><td>Primer3 (תוכנה)</td><td>סטיב רוזן & הלן סקלצקי</td><td>טבליות מעכבי</td><td>פרוטאז http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</td>לא</tr><tr><td>מסחריות</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>cOmplete, Mini, ללא EDTA. יש להשתמש בטבליה אחת לכל 10 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>טבליות מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>cOmplete, ללא EDTA. יש להשתמש בטבליה אחת לכל 50 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td> <td>של פרוטאינאז K</td><td>AM2548</td><td>פרוטאינאז K (20 ומיקרו; g/&micro; l). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>12091-039</td><td>RNase A (20 ומיקרו; g/&micro; l). יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td>Rotator SB3</td></tr><tr><td>SAMtools (software)</td><td>Li et al.</td><td>לא מסחרי</td><td>http://samtools.sourceforge.neta</td></tr><tr><td>חרוזי קיבוע הפיכים בשלב מוצק</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63882</td><td>חרוזי Agencourt AMPure XP משמשים למזעור זיהום דימר המתאם בספריות ChIP-Seq. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr>דגמים חדשים יותר של <td>Sonicator 3000</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>זמינים כעת. Q125, Q500 או Q700 מתאימים כולם לגזירת כרומטין צולב.</td></tr><tr><td>מארז סאונד</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>אופציונלי: עקוב אחר המלצת היצרן כדי להשיג את מארז הקול הנכון.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>eppendorf</td><td>22670000</td><td>Thermomixer לצינורות 24 x 1.5 מ"ל. בקרת טמפרטורה מדויקת מ-4 מעלות; צלזיוס מעל טמפרטורת החדר עד 99 מעלות צלזיוס.</td></tr></tbody></table>

snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

גיוס מווסתי כרומטין והקצאת מצבי כרומטין למיקומים גנומיים ספציפיים הם חיוניים להחלטות גורל התא ולהיווצרות רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. קביעת המיקומים והרמות של תכונות כרומטין כאלה in vivo תספק מידע רב ערך על הבקרה המרחבית-זמנית של אלמנטים גנומיים, ותתמוך בשאיפות לחקות התפתחות רקמה עוברית במבחנה. השיטה הנפוצה ביותר לפרופיל גנומי ברזולוציה גבוהה היא כרומטין אימונו-משקעים ואחריו ריצוף מהדור הבא (ChIP-Seq). פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לעבד עוברים עשירים בחלמונים כמו אלה של הצפרדע Xenopus עבור ניסויי ChIP-Seq, והוא מציע שורות פקודה פשוטות לניתוח לאחר ריצוף. בגלל היעילות הגבוהה שבה הפרוטוקול מחלץ גרעינים מרקמה קבועה בפורמלדהיד, השיטה מאפשרת הגדלה קלה כדי להשיג מספיק חומר ChIP לפרופיל כלל-גנומי. הפרוטוקול שלנו שימש בהצלחה למיפוי חלבונים קושרי DNA שונים כגון גורמי שעתוק, מתווכי איתות, רכיבים של מנגנון השעתוק, משני כרומטין ושינויים בהיסטון לאחר התרגום, וכדי לעשות זאת בשלבים שונים של האמבריוגנזה. לבסוף, פרוטוקול זה אמור להיות ישים באופן נרחב על אורגניזמים מודלים אחרים ושאינם מודלים ככל שיותר ויותר מכלולי גנום הופכים לזמינים.

תוצאות שווה ערך לאלו שהוצגו כאן צפויות אם הפרוטוקול מבוצע היטב והנוגדנים בשימוש הוא באיכות כיתה שבב (ראה דיון). פרוטוקול זה מאפשר מיצוי של גרעינים מעוברי Xenopus-קבוע פורמלדהיד וגז יעיל של הכרומטין ידי sonication (איור 1 א-ג). הכרומטין טעון תערוכות הפצת א-סימטרית של שברי DNA בעיקר נע בין 100 ל -1,000 נקודות בסיס והגיעו לשיא בין 300 ל -500 נ&quot;ב (איור 1 ג). 50 pg מינימאלי של DNA immunoprecipitated נדרש כדי להפוך את ספריית שבב Seq לזווג-סוף באינדקס עם מוסיף בגודל דומה DNA (איור 2 א) בהצלחה. הספרייה צריכה להיות נטול במידה רבה של הדימרים מתאם, אשר ניתן לראות על electropherogram בכ -120 נ&quot;ב. על הרצף-ידי-סינתזה, מראש מעובד-קורא ממופה הגנום (איור 2 ב, ג). בניסוי מוצלח עם <eמ &#39;&gt; X. עוברי tropicalis, בדרך כלל 50 עד 70% מאחת-הסוף קוראים של 40 נ&quot;ב יכולים להיות ממופים באופן ייחודי להרכבת הגנום של v7.1 עם שני חוסר התאמה מקסימאלי. בעוד קלט קורא ליישר די אחיד על פני הגנום, היישור של שבב קורא תוצאות במוספים לגדיל ספציפי כי האגף תכונת הכרומטין של עניין. זאת משום שכל שברים הם רצף מהקצה 5 &#39;(איור 2 ג) 25. הארכת היישור בקריאת כיוון לגודל שבר ממוצע מייצרת פרופילים מדויקים לתכונות הכרומטין בודדות כגון אירועים גורם שעתוק מחייבים. תפוסות DNA אלה מופיעים כפסגות כאשר דמיינו בIGV או כל דפדפן הגנום תואם אחר. מתקשרי שיא כמו MACS משמשים כדי לקבוע את המיקום של הפסגות הללו (איור 3 א). בדרך זו עשרות אלפי אתרי קישור נקבעה בX. tropicalis הגנום לגורמי שעתוק T-box כגון VegT 26. התנסות שבב qPCRמפעלים צריכים לאשר את ההעשרה המקומית שנמצאה על ידי שבב Seq (איור 3). ניסויי שבב Seq מאפשרים לחקור מאפייני הגנום של תכונות הכרומטין. לדוגמא, חישוב חלוקת הקריאה מעל אלמנטים הגנומי כגון תחילת שעתוק ואתרי סיום עשוי לסמן כל העדפות מרחבי מחייבות סביב גנים (איור 3 ג). באופן דומה, Heatmap של הפצות קריאה במקומות שיא משמשת להשוואת תכונות הכרומטין שונות בקנה מידת הגנום (איור 3D). גורמי שעתוק מסוימים להיקשר רצף במיוחד. ניתוח מוטיב DNA De novo של פסגות שבבסיס הדנ&quot;א הגנומי יכולים לאחזר מידע כוללים מוטיבים מועשרים שיתוף של שיתוף גורמים פוטנציאליים (איור 3E) מסוג זה. הרוב הגדול של גני המטרה להראות תפוסת DNA בנמוך ולא ברמה גבוהה יותר (איור 3F). נראה תכונה ללא קנה מידה זה להיות די נפוץ בקרב trהגורמים וanscription מצביעים על כך שרק חלק קטן של גני המטרה מוסדרים ישירות עם הרלוונטיות ביולוגיות 27,28. הניתוח של תנאים מועשרים GO או תכונות אחרות כגון ביטוי ההפרש של גני המטרה עשויה לחשוף עוד תובנות הפונקציה הביולוגית של תכונת הכרומטין בעובר Xenopus (איור 3G). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" /> איור 1. הליך immunoprecipitation הכרומטין לעוברי צפרדעים. עוברים () נמצאים בשלב ההתפתחותי של עניין לאגד קוולנטית (קישור צולב) כל חלבונים הקשורים להדנ&quot;א הגנומי-קבוע פורמלדהיד. על המיצוי גרעיני (B), הכרומטין הצולב מפוצל כדי לצמצם את הדנ&quot;א הגנומי מחייב או אתרי שינוי הכרומטין ידי מזעור DN האיגוףרצף (C). בהמשך לכך, שברי הכרומטין הם immunoprecipitated עם נוגדן כיתה שבב להעשיר אלה המכילים epitope של עניין (D). DNA-immunoprecipitated שיתוף הוא פשט את החלבון ומטוהר (E) לפני יצירת ספריית בר השבב לNGS (איור 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" /> איור 2. הכנת ספריית שבב Seq, רצף-ידי-סינתזה, מיפוי ושיחות שיא. (א) electropherogram מציג ספריית שבב Seq טובה עם תבניות DNA של 250-450 נקודות בסיס. תבניות אלה כרוכות להכניס DNA של העניין מוקף (נ&quot;ב 58) האוניברסלי ומתאם באינדקס (63 נ&quot;ב). (ב) </strong&gt; מיליוני אשכולות, עם כל אשכול המכיל תבניות זהות, הם בסיס רצף של בסיס בנוכחות כל ארבעת נוקלאוטידים בעלי fluorophore הפיך, מובחן ומאפייני סיום זהים. תמונות ניאון מעובדות בזמן אמת לקרוא בסיסים מקבילים, שסופו של דבר הם התאספו לקוראים. (C) קורא רק שהמפה ייחודית להגנום Xenopus נשמרות. כפי שכולם שברי רצף מהקצה &#39;5, המיפוי של שבב קורא תוצאות בפסגות גדיל ספציפי כי האגף תכונת הכרומטין של עניין. וכך, למתקשרים שיא לזהות את ההעשרה שמקורו בimmunoprecipitation ולהאריך את קורא לאורך קטע ממוצע למקם במדויק תכונות הכרומטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,535 / 52535fig3highres.jpg&quot; /&gt; איור 3. דוגמא של ניתוח שלאחר רצף-ונתונים להדמיה באמצעות גורם שעתוק T-תיבת zygotic VegT (zVegT). כל קריאת סעיפים המוצגים כאן הם מנורמלים 10 מ&#39;ייחודיים ממופה ולא מיותר קורא. () קטע של פרופיל הגנום של zVegT מחייב בX. עוברי gastrula tropicalis (שלב 11-12.5 לאחר Nieuwkoop וFaber 29). שיא כל, ערימה-מהוארך קורא, מייצג אתר אחד מחייב. פסגות אלה נקראות על ידי MACS2 עם שיעור גילוי שווא (FDR) של פחות מ -1%. כל גן mesp תערוכות zVegT מאוד הפרוקסימלי ובמעלה הזרם מחייב, אבל רק mespa וmespb באים לידי ביטוי בשלב זה (נתוני RNA-Seq 30). (ב) רמות תפוסת DNA של zVegT כפי שנקבעו על ידי שבב qPCR בכמה לוקוסים (כולל לא confi אזור -bound 0.5 kb במעלה הזרם של -actin β)RM ההעשרה הספציפית שנמצאה על ידי שבב Seq. להשוות את התוצאות לmespa עם שיא נקרא (פס אדום) ב (א). רמת תפוסת DNA היא מדמיין כאחוז מקלט עבור שניהם, השבב עם נוגדן VegT (ארנב polyclonal של אלוטיפ IgG) והשבב עם שליטת הנוגדנים (IgG ארנב הרגיל). ברים שגיאה משקפים את סטיית התקן של שני משכפל ביולוגי. (C) Metagene ניתוח מראה zVegT המועדף המחייב (תגים זרקו לפח מעל 25 נ&quot;ב) לאמרגן ביחס לכל אזור גנומי אחר סביב ובתוך גופי גן. (ד) Heatmap תערוכות k-ממוצע רמות (k = 5) תפוסת DNA התקבצו (תגים זרקו לפח מעל 25 נ&quot;ב) של (נתונים שבב Seq 31) zVegT וSmad2 / Smad3 ביחס לכל האזורים מחויבים-zVegT בשלב gastrula. Heatmap היא להיכנס 2 מבוססים ומרוכז בשעה 5 תגים לנ&quot;ב. (E) De novo ניתוח המוטיב מגלה גורם שעתוק הקנונית T-התיבה מחייב מוטיב ב -38% מzVegT-אזורים מחויבים אם ציון המוטיב הבסיסי הוא מנורמל לשיעור גילוי של 5% ברצפי רקע. מפת צפיפות תערוכות ההעשרה הגבוהה ביותר למוטיב T-התיבה במרכז אתרי קישור zVegT, ואילו מוטיב Smad2 / Smad3 מחייב הקנונית כמעט ואינו מועשר. (F) היסטוגרמה מראה רמות תפוסת DNA של zVegT, אשר מחושבות עבור כל גן היעד מכל הפסגות (+/- 200 נ&quot;ב) בין 5 kb במעלה הזרם [-]. ו[ +] 1 kb במורד הזרם של מקביל אתרי תחילת שעתוק (G) 300 גנים למעלה עם הרמות הגבוהות ביותר תפוסת DNA בתוך -5 קילו ו+1 kb הם מועשר לתהליכים ביולוגיים של התפתחות עוברית המוקדמת. אלה GO מונחים עולים בקנה אחד עם התפקוד המשוער של zVegT. FDR מבוסס על בדיקה המדויקת של פישר שני זנב ותיקן לבדיקה מרובה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

מטרת הליך זה, הידוע בכינויו ChIP-seq, קיצור של כרומטין אימונו-משקעים, ואחריו ריצוף הדור הבא, היא לקבוע את המיקום הגנומי של מווסתי כרומטין ומצבי כרומטין בעובר האופוס. זה מושג על ידי קיבוע עוברי zap ובכך קישור קוולנטי של החלבונים הקשורים ל-DNA לגנום. לאחר מכן, הגרעינים מופקים והכרומטין שלהם מסיס ומשותף על ידי סוניקציה.בשלב זה, החלבון המעניין המקושר ל-DNA מטוהר על ידי משקעים חיסוניים ושטיפה נרחבת. השלב האחרון הוא יצירת ספריית ChIP-seq באינדקס מקטעי ה-DNA המטוהרים. בסופו של דבר, מיליוני חמשת המינים הראשוניים של מקטעי הדנ"א הללו, מה שנקרא res, מרוצפים במקביל, מיושרים לגנום ומורחבים לאורך השבר הממוצע.העשרה מקומית של מה שנקרא פסגות נחושות לזהות את כל תפוסות ה-DNA הספציפיות לאתר של החלבון המבוקש, ובכך להרחיב את המחקר של המאפיינים הגנומיים שלו. כך שפרוטוקול זה יכול לספק תובנות מפורטות לגבי ארכיטקטורת הכרומטין הכלל-גנומית של עוברי אמו. ניתן ליישם אותו גם על אורגניזמים אחרים עם גנומים מרוצפים.התחל עם עוברי השטר. פרטים עד לנקודה זו מסופקים בפרוטוקול הטקסט. העבירו אותם בבקבוקון זכוכית של שמונה מיליליטר ושטפו אותם עם 0.01 XMMR.לאחר הכביסה יש לתקן את העוברים עם 1% פרה פורמלדהיד ו- 0.01 XMMR. אפשר לתיקון להימשך לפחות 15 עד לא יותר מ-40 דקות בטמפרטורת החדר. סיים את התיקון על ידי שטיפת העוברים שלוש פעמים בקור 0.01 XMMR.מנע מהעוברים לגעת במשטח התמיסה מכיוון שמתח פנים יוביל לקרע. לאחר שטיפת הקיבוע, הכינו 250 עוברים בצינורות אשפה זעירים. לאחר מכן שקלו כמה שיותר מה-0.01 XMMR, והמשיכו עם מיצוי הכרומטין כדי להשהות.כאן משווים את העוברים ב -250 מיקרוליטר של מאגר HEG קר. לאחר שהתייצבו במאגר, ניתן להקפיא את העוברים בחנקן נוזלי ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. התחל בהומוגניזציה של העוברים הקבועים במאגר E אחד.פרטים על הגדלה והכנת מאגר מסופקים בפרוטוקול הטקסט. הצנטריפוגה הבאה. ההומוגנטים בארבע מעלות צלזיוס שואפים ומשליכים את הסט ומשהים מחדש את הכדורים ב-E אחד.שוב, שמור את הדגימה על קרח למשך 10 דקות. חזור על הצנטריפוגה והפעם ריס, השהה את הפלטה ב- E שתיים. המתן 10 דקות בזמן שההומוגנט מתקרר על הקרח.לאחר מכן חזור על הצנטריפוגה שוב, וריס תשעה את הכדור ב-E שלוש. הפעם, לאחר צינון של 10 דקות נוספות, המתלה אמור להיראות שקוף למדי מכיוון שבשלב זה, חומר הניקוי האוניקי הופך את רוב טסיות החלמון הנותרות למסיסות. כעת, חזור על הצנטריפוגה. אנדרה.השעו את הכדורים באחד עד שלושה מיליליטר של E שלוש. במידת הצורך, השתמש בשלב הצנטריפוגה האחרון כדי למשוך את כל הכדוריות מהגרעינים הצולבים הרצויים. תרחיף זה מכיל גם גרגירי פיגמנט וכמה שאריות טסיות חלמון.גרגירים וטסיות חלמון אלה יופרדו מהכרומטין לאחר סוניקציה על ידי צנטריפוגה. כעת שמור את הדגימה על הקרח והמשך בפיצול כרומטין. לחלופין, הצמד, הקפיאו את הדגימה לאחסון זמני.התחל בהעברת הדגימה ב-E שלוש לצינור פוליסטירן שנבנה בהתאמה אישית. עבור הסוניקט, חבר את הצינור לכוס של 800 מיליליטר עם מי קרח באמצעות מהדק מדחום קצר כך שיישאר נקרא במהלך סוניקציה. הנח את הכוס על שקע והתאם את השקע כך שקצה הצליל יטבול כשני שליש מהדרך לתוך הדגימה.קצה הסוניקט לא אמור לגעת בדופן הצינור. בצע אופטימיזציה של הסוניקציה, החל מהפרמטרים המומלצים של היצרן מ- Sonic Sonicate 3000 שלי המצויד במיקרו קצה מחודד בגודל 16 אינץ' סוניקט שבע דקות בסך הכל. 30 שניות בכל פעם בין סוניקציה.תנו לדגימה לנוח דקה. התחל כל סוניקציה בחזקת אחד והגדל אותה בהדרגה בין שתיים לארבע. אם הדגימה מתחילה להקציף, מקם מחדש את הצינור ותן לקצף להתפזר לפני שתמשיך לאחר הסוניקציה, הכרומטין מסיס וגוזז.העבירו אותו לקירור מראש של 1.5 מיליליטר לצינורות אשפה מיקרו וצנטריפוגה במלוא המהירות. במשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס, אספו את ה-SNA והעבירו אותו לצינורות טרום קירור. השלך את הגלולה.השתמש ב-50 מיקרוליטר של SUP natant כדי להעריך חזותית את הפיצול ולשמור את השאר למשקעים חיסוניים. התחל בהעברת 10 עד 30 מיקרוליטר של כרומטין SUP לצינור חדש שישמש כדגימת קלט. לאחר מכן הוסף נוגדן בדרגת שבב בערך מיקרוגרם אחד למיליון תאים לכרומטין הנותר.דגרו על דגימת נוגדני הכרומטין למשך הלילה, גם בארבע מעלות צלזיוס, אך עם סיבוב של 10 סל"ד. למחרת, שטפו את החרוזים המגנטיים התואמים לנוגדנים ב-E שלוש למשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס. שימוש בריכוז החרוזים המוצע על ידי היצרן בחרוזים השטופים לנוגדנים כרומטין מודגר מראש בדגירה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב למשך ארבע שעות נוספות.לאחר מכן בעזרת מאגר מרטש צונן, שטפו את החרוזים 10 פעמים. השתמש במגנט למשך 20 עד 30 שניות כדי להפריד את החרוזים בין כביסות. הפתרון צריך להיות ברור.עקוב אחר שטיפות מאגר המרטש בכביסה אחת באמצעות מאגר 10 צונן. לאחר מכן העבירו את החרוזים בנפח קטן של 10 מאגר לצינור חדש. הפרד את החרוזים והשליך את המאגר השיורי.לנתק את הכרומטין המשקע החיסוני. ריס כופף את החרוזים ב-50 עד 100 מיקרוליטר של מאגר תמיסת SDS ומערבל את הצינור בעזרת מערבל תרמו. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור במלוא המהירות למשך 30 שניות ואספו את החנוך המכיל את הכרומטין המשקע החיסוני.חזור על פתרון ה-SDS, שלב אחד ושלב את כל ה-eluate. לאחר מכן המשך עם מיצוי ה-DNA, ChIP-seq, הכנת הספרייה וריצוף הדור הבא כמתואר בפרוטוקול הטקסט בעקבות פרוטוקול זה, כרומטין משותף מראה התפלגות אסימטרית של שברי DNA, בעיקר נעה בין 100 ל-1000 זוגות בסיסים ומגיעה לשיא בין 300 ל-500 זוגות בסיסים. נדרשים מינימום 50 פיקוגרם של DNA משקע חיסוני כדי ליצור בהצלחה ספריית N ChIP-seq מזווגת עם תוספות DNA בגודל דומה.הספרייה צריכה להיות נטולת דימרים מתאמים, אותם ניתן לראות באלקטרופרוגרמה בכ-120 זוגות בסיסים. ריצוף של ספריית ChIP-seq מפחית מיליוני רצפי DNA קצרים, מה שנקרא קריאות. אלה ממופים לגנום בזמן שקריאות הקלט מתיישרות באופן אחיד לאורך הגנום.קריאות השבב מציגות העשרה ספציפית לגדיל שמאגפת את תכונת הכרומטין המעניינת. הרחבת היישור בכיוון הקריאה לגודל שבר ממוצע מפחיתה פרופילים מדויקים עבור תכונות כרומטין בודדות כגון אירועי קשירה של גורם שעתוק. אלה מופיעים כפסגות בדפדפן גנום כפי שמוצג כאן עבור תה צמחי בשלב רשימת הגסטרו של העוברים הטרופיים של זנו.ניסויי ChIP-seq מאפשרים לחקור מאפיינים כלל-גנומיים של תכונות כרומטין כגון מוטיבים של רצף DNA מועשר העומדים בבסיס הפסגות, או ניתוח אונטולוגיה של גנים של מטרות גנים, כפי שמוצג כאן, אינטראקציות TDNA בספסל הממופה לאחר התפתחותו. שיטה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור את נוף הכרומטין העוברי, הן בקנה מידה רחב של הגנום, ברזולוציה גבוהה מאוד.

genome-wide-snapshot-chromatin-regulators-states-xenopus-embryos-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

תקנת כוונון עדינה של שעתוק גנים בבסיס החלטת גורל תא עוברי. בזאת, אנו מתארים מבחני immunoprecipitation הכרומטין לשמש כדי לחקור תקנה אפיגנטיים של שני בידול הלב של תאי גזע ופיתוח הלב של עוברי עכברים.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

כאן, אנו מתארים, אופטימיזציה תפוקה גבוהה שבב-רצף פרוטוקול ו ניתוחים חישובית צינור מצפני הגנום כולו כרומטין דפוסי המדינה בין קפוא גידול רקמות שורות תאים.

פלטפורמה משולבת עבור מיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית באמצעות שבב בתפוקה גבוהה-רצף ברקמות הגידול

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע שבב-Seq ומפות CARIP-Seq, כולל ספריית לקראת הדור הבא רצפי, ליצירת epigenomic הכללית ו- RNA הקשורים כרומטין תאים ES.

CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

קביעה מדויקת של מיקומים מחייבי חלבון ברחבי הגנום חשובה להבנת ויסות הגנים. כאן אנו מתארים שיטת מיפוי גנומית המטפלת בדנ"א כרומטין-אימונו-חיסוני עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) ואחריו רצף תפוקה גבוהה. שיטה זו מזהה אינטראקציות בין חלבון לדנ"א עם רזולוציית מיפוי קרובה של זוג בסיס ויחס אות לרעש גבוה בנוירונים של יונקים.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

פרוטוקול זה מספק צינור חישובי יעיל לכימות תמלילי משפרים מתהווים. על ידי שילוב נגישות כרומטין, תכונת כרומטין ונתוני שעתוק, הוא מאפשר זיהוי מדויק וניתוח ספציפי לגדיל של פעילות משפר באזורים תוך-גניים מורכבים, תוך שהוא נשאר נגיש לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטית נרחבת.

צינור חישובי לכימות RNA משפר אינטרגני/תוך-גני בתאי גזע עובריים של עכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ATAC-seq מהיר ופשוט שיושם בתולעת שלמה בשלב L4 Caenorhabditis elegans באמצעות 30 מיקרו-ליטר של כדור תולעת בלבד.

פרופיל נגישות כרומטין בזחלים שלמים של Caenorhabditis elegans L4

חקור את שיטת ChIP-Seq למיפוי רגולטורים כרומטין ומצבי כרומטין בזחלי Xenopus. פרוטוקול זה מאפשר הבנה מעמיקה של ארכיטקטורת הכרומטין בפיתוח עוברי והחלתו במודלים ביולוגיים נוספים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב

גלה סרטונים נוספים