Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב Xenopus עוברים על ידי שבב Seq
26 בפברואר 2015
השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.
מטרת הליך זה, הידוע בכינויו ChIP-seq, קיצור של כרומטין אימונו-משקעים, ואחריו ריצוף הדור הבא, היא לקבוע את המיקום הגנומי של מווסתי כרומטין ומצבי כרומטין בעובר האופוס. זה מושג על ידי קיבוע עוברי zap ובכך קישור קוולנטי של החלבונים הקשורים ל-DNA לגנום. לאחר מכן, הגרעינים מופקים והכרומטין שלהם מסיס ומשותף על ידי סוניקציה.
בשלב זה, החלבון המעניין המקושר ל-DNA מטוהר על ידי משקעים חיסוניים ושטיפה נרחבת. השלב האחרון הוא יצירת ספריית ChIP-seq באינדקס מקטעי ה-DNA המטוהרים. בסופו של דבר, מיליוני חמשת המינים הראשוניים של מקטעי הדנ"א הללו, מה שנקרא res, מרוצפים במקביל, מיושרים לגנום ומורחבים לאורך השבר הממוצע.
העשרה מקומית של מה שנקרא פסגות נחושות לזהות את כל תפוסות ה-DNA הספציפיות לאתר של החלבון המבוקש, ובכך להרחיב את המחקר של המאפיינים הגנומיים שלו. כך שפרוטוקול זה יכול לספק תובנות מפורטות לגבי ארכיטקטורת הכרומטין הכלל-גנומית של עוברי אמו. ניתן ליישם אותו גם על אורגניזמים אחרים עם גנומים מרוצפים.
התחל עם עוברי השטר. פרטים עד לנקודה זו מסופקים בפרוטוקול הטקסט. העבירו אותם בבקבוקון זכוכית של שמונה מיליליטר ושטפו אותם עם 0.01 XMMR.
לאחר הכביסה יש לתקן את העוברים עם 1% פרה פורמלדהיד ו- 0.01 XMMR. אפשר לתיקון להימשך לפחות 15 עד לא יותר מ-40 דקות בטמפרטורת החדר. סיים את התיקון על ידי שטיפת העוברים שלוש פעמים בקור 0.01 XMMR.
מנע מהעוברים לגעת במשטח התמיסה מכיוון שמתח פנים יוביל לקרע. לאחר שטיפת הקיבוע, הכינו 250 עוברים בצינורות אשפה זעירים. לאחר מכן שקלו כמה שיותר מה-0.01 XMMR, והמשיכו עם מיצוי הכרומטין כדי להשהות.
כאן משווים את העוברים ב -250 מיקרוליטר של מאגר HEG קר. לאחר שהתייצבו במאגר, ניתן להקפיא את העוברים בחנקן נוזלי ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. התחל בהומוגניזציה של העוברים הקבועים במאגר E אחד.
פרטים על הגדלה והכנת מאגר מסופקים בפרוטוקול הטקסט. הצנטריפוגה הבאה. ההומוגנטים בארבע מעלות צלזיוס שואפים ומשליכים את הסט ומשהים מחדש את הכדורים ב-E אחד.
שוב, שמור את הדגימה על קרח למשך 10 דקות. חזור על הצנטריפוגה והפעם ריס, השהה את הפלטה ב- E שתיים. המתן 10 דקות בזמן שההומוגנט מתקרר על הקרח.
לאחר מכן חזור על הצנטריפוגה שוב, וריס תשעה את הכדור ב-E שלוש. הפעם, לאחר צינון של 10 דקות נוספות, המתלה אמור להיראות שקוף למדי מכיוון שבשלב זה, חומר הניקוי האוניקי הופך את רוב טסיות החלמון הנותרות למסיסות. כעת, חזור על הצנטריפוגה. אנדרה.
השעו את הכדורים באחד עד שלושה מיליליטר של E שלוש. במידת הצורך, השתמש בשלב הצנטריפוגה האחרון כדי למשוך את כל הכדוריות מהגרעינים הצולבים הרצויים. תרחיף זה מכיל גם גרגירי פיגמנט וכמה שאריות טסיות חלמון.
גרגירים וטסיות חלמון אלה יופרדו מהכרומטין לאחר סוניקציה על ידי צנטריפוגה. כעת שמור את הדגימה על הקרח והמשך בפיצול כרומטין. לחלופין, הצמד, הקפיאו את הדגימה לאחסון זמני.
התחל בהעברת הדגימה ב-E שלוש לצינור פוליסטירן שנבנה בהתאמה אישית. עבור הסוניקט, חבר את הצינור לכוס של 800 מיליליטר עם מי קרח באמצעות מהדק מדחום קצר כך שיישאר נקרא במהלך סוניקציה. הנח את הכוס על שקע והתאם את השקע כך שקצה הצליל יטבול כשני שליש מהדרך לתוך הדגימה.
קצה הסוניקט לא אמור לגעת בדופן הצינור. בצע אופטימיזציה של הסוניקציה, החל מהפרמטרים המומלצים של היצרן מ- Sonic Sonicate 3000 שלי המצויד במיקרו קצה מחודד בגודל 16 אינץ' סוניקט שבע דקות בסך הכל. 30 שניות בכל פעם בין סוניקציה.
תנו לדגימה לנוח דקה. התחל כל סוניקציה בחזקת אחד והגדל אותה בהדרגה בין שתיים לארבע. אם הדגימה מתחילה להקציף, מקם מחדש את הצינור ותן לקצף להתפזר לפני שתמשיך לאחר הסוניקציה, הכרומטין מסיס וגוזז.
העבירו אותו לקירור מראש של 1.5 מיליליטר לצינורות אשפה מיקרו וצנטריפוגה במלוא המהירות. במשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס, אספו את ה-SNA והעבירו אותו לצינורות טרום קירור. השלך את הגלולה.
השתמש ב-50 מיקרוליטר של SUP natant כדי להעריך חזותית את הפיצול ולשמור את השאר למשקעים חיסוניים. התחל בהעברת 10 עד 30 מיקרוליטר של כרומטין SUP לצינור חדש שישמש כדגימת קלט. לאחר מכן הוסף נוגדן בדרגת שבב בערך מיקרוגרם אחד למיליון תאים לכרומטין הנותר.
דגרו על דגימת נוגדני הכרומטין למשך הלילה, גם בארבע מעלות צלזיוס, אך עם סיבוב של 10 סל"ד. למחרת, שטפו את החרוזים המגנטיים התואמים לנוגדנים ב-E שלוש למשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס. שימוש בריכוז החרוזים המוצע על ידי היצרן בחרוזים השטופים לנוגדנים כרומטין מודגר מראש בדגירה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב למשך ארבע שעות נוספות.
לאחר מכן בעזרת מאגר מרטש צונן, שטפו את החרוזים 10 פעמים. השתמש במגנט למשך 20 עד 30 שניות כדי להפריד את החרוזים בין כביסות. הפתרון צריך להיות ברור.
עקוב אחר שטיפות מאגר המרטש בכביסה אחת באמצעות מאגר 10 צונן. לאחר מכן העבירו את החרוזים בנפח קטן של 10 מאגר לצינור חדש. הפרד את החרוזים והשליך את המאגר השיורי.
לנתק את הכרומטין המשקע החיסוני. ריס כופף את החרוזים ב-50 עד 100 מיקרוליטר של מאגר תמיסת SDS ומערבל את הצינור בעזרת מערבל תרמו. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור במלוא המהירות למשך 30 שניות ואספו את החנוך המכיל את הכרומטין המשקע החיסוני.
חזור על פתרון ה-SDS, שלב אחד ושלב את כל ה-eluate. לאחר מכן המשך עם מיצוי ה-DNA, ChIP-seq, הכנת הספרייה וריצוף הדור הבא כמתואר בפרוטוקול הטקסט בעקבות פרוטוקול זה, כרומטין משותף מראה התפלגות אסימטרית של שברי DNA, בעיקר נעה בין 100 ל-1000 זוגות בסיסים ומגיעה לשיא בין 300 ל-500 זוגות בסיסים. נדרשים מינימום 50 פיקוגרם של DNA משקע חיסוני כדי ליצור בהצלחה ספריית N ChIP-seq מזווגת עם תוספות DNA בגודל דומה.
הספרייה צריכה להיות נטולת דימרים מתאמים, אותם ניתן לראות באלקטרופרוגרמה בכ-120 זוגות בסיסים. ריצוף של ספריית ChIP-seq מפחית מיליוני רצפי DNA קצרים, מה שנקרא קריאות. אלה ממופים לגנום בזמן שקריאות הקלט מתיישרות באופן אחיד לאורך הגנום.
קריאות השבב מציגות העשרה ספציפית לגדיל שמאגפת את תכונת הכרומטין המעניינת. הרחבת היישור בכיוון הקריאה לגודל שבר ממוצע מפחיתה פרופילים מדויקים עבור תכונות כרומטין בודדות כגון אירועי קשירה של גורם שעתוק. אלה מופיעים כפסגות בדפדפן גנום כפי שמוצג כאן עבור תה צמחי בשלב רשימת הגסטרו של העוברים הטרופיים של זנו.
ניסויי ChIP-seq מאפשרים לחקור מאפיינים כלל-גנומיים של תכונות כרומטין כגון מוטיבים של רצף DNA מועשר העומדים בבסיס הפסגות, או ניתוח אונטולוגיה של גנים של מטרות גנים, כפי שמוצג כאן, אינטראקציות TDNA בספסל הממופה לאחר התפתחותו. שיטה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור את נוף הכרומטין העוברי, הן בקנה מידה רחב של הגנום, ברזולוציה גבוהה מאוד.
סקירה כללית
מאמר זה מתווה את שיטת ה-ChIP-Seq לבחינת מאפייני כרומטין בעוברים של Xenopus. הבנת הוויסות והמצבים של הכרומטין חיונית להשגת תובנות לגבי החלטות גורל התאים המוקדמות במהלך ההתפתחות העוברית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של כרומטין
- גנומיקה
- התפתחות עוברית
רקע
- ווסתי כרומטין ממלאים תפקיד משמעותי בביטוי גנים.
- שיטת ChIP-Seq מאפשרת מיפוי של אינטראקציות חלבון-DNA.
- עוברי Xenopus משמשים כמודל לחקר ההתפתחות המוקדמת.
- הבנת ארכיטקטורת הכרומטין יכולה לתרום לביולוגיה התפתחותית.
מטרת המחקר
- לקביעת המיקום ברחבי הגנום של רגולטורים של כרומטין בעוברי Xenopus.
- לספק תובנות לגבי מצבי כרומטין במהלך התפתחות עוברית מוקדמת.
- לביסוס פרוטוקול שניתן להחיל על אורגניזמים אחרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע של עוברים כדי לקשור חלבונים הקשורים ל-DNA לגנום.
- הפקה והמסה של כרומטין באמצעות סוניקציה.
- אימונופרסיפיטציה של החלבון הנבדק.
- ריצוף של מקטעי DNA מנוקים לזיהוי אינטראקציות בין חלבון ל-DNA.
תוצאות עיקריות
- מיפוי מוצלח של רגולטורים של כרומטין בגנום של Xenopus.
- זיהוי תפיסות DNA ספציפיות לאתר של חלבונים.
- תובנות לגבי ארכיטקטורת הכרומטין ברחבי הגנום של עוברים.
- פוטנציאל ליישום של השיטה באורגניזמים אחרים שגנומם ממופה.
מסקנות
- פרוטוקול ה-ChIP-Seq מספק גישה מפורטת לחקר דינמיקת כרומטין.
- הממצאים משפרים את ההבנה של בקרה גנטית במהלך ההתפתחות העוברית.
- ניתן להתאים את השיטה למגוון יישומים של מחקר ביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ריצוף של שיקוע חיסוני של כרומטין (ChIP-Seq) מאפשר מיפוי רחב-גנומי של אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA, ומספק תובנות קריטיות לגבי בקרה שעתוקית במהלך התפתחות מוקדמת. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי זיהוי וסתי כרומטין ואתרי הקישור שלהם, החיוניים להבנת הדינמיקה של ביטוי גנים במערכות הרלוונטיות למחלה. השיטה מגבירה את רמת הביטחון החזויה במודלים פרה-קליניים באמצעות הבהרת הקשרים מכניסטיים בין מצבי כרומטין לבין תוצאות פנוטיפיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מזהה תפיסות ברחבי הגנום של פקטורי שעתוק ומודיפיקטורים של כרומטין, ובכך תומך בבחינת היפותזות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות מיפוי ישיר של אינטראקציות חלבון-DNA במערכות עובריות.
- ערך מדעי: מבהיר את פעילות המסלולים על ידי קישור מצבי כרומטין לרשתות בקרה גנטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פרופילי כרומטין כמותיים ברזולוציה גבוהה, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולהערכת הדירות.
- ערך תפעולי: מייצר תכשירי כרומטין הניתנים להרחבה (scalable) התומכים בתהליכי סינון (screening) בשלבים הבאים.
- ערך מדעי: מקל על גילוי סמנים ביולוגיים על ידי קישור מאפייני כרומטין לאונטולוגיה של גנים ולדפוסי ביטוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק נופי כרומטין רלוונטיים למחלה, המאפשרים הפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולים התפתחותיים.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מנגנוני כרומטין שמורים.
- ערך מדעי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי חשיפת רגולטורים אפיגנטיים של התהוות רקמות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ChIP-Seq משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לבחינה מונחית-השערה של ווסתי כרומטין, תמיכה בזיהוי מולקולות מובילה (leads) באמצעות תובנות מכניסטיות, והנחיית עבודה פרה-קלינית באמצעות פרופיל אפיגנטי של מודלים התפתחותיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות מיפוי מצבי כרומטין לאורך האמבריוגנזה.
- סריקה: מספקת מקטעי כרומטין מוכנים לבדיקה עם התפלגות גודל מוגדרת לצורך שיקוע חיסוני וריצוף אמינים.
- אנליטיקה: מאפשרת זיהוי שיאים (peak calling) וניתוח העשרה של מוטיבים להשוואת תנאי קישור של חלבונים וזיהוי אלמנטים רגולטוריים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ארכיטקטורת כרומטין עוברית לתוכניות רגולציה של גנים הרלוונטיות להתפתחות ומחלות בבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לפרופילינג של כרומטין במודלים של אורגניזמים ככל ששיפורי האנוטציה של הגנום יתרחבו.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות תובנה מכניסטית לבקרה שעתוקית ולדינמיקה של כרומטין.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות מיצוי גרעינים חסון וגזירת כרומטין מעובריים עתירי חלמון.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות במעורבות המטרה ובמודולציית מסלולים.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף מטרות מותאם סיכון על בסיס נגישות כרומטין ופוטנציאל רגולטורי.
שיקולי יישום
- מומחיות בביולוגיה של כרומטין, שיבוט מולקולרי והכנת ספריות לריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing).
- מכשור לסוניקציה, הפרדה מגנטית ופלטפורמות לריצוף בעלת תפוקה גבוהה.
- סטנדרטיזציה בין-צוותית של תיקוף נוגדנים, תזמון הקיבוע ובקרת איכות (QC) לגודל הפרגמנטים.
- שיקולי התאמה עבור תכולות חלמון משתנות ונגישות כרומטין בין מינים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות דרישות לגבי תנובת DNA כניסה ורעש רקע מפיגמנטים של שאריות חלמון.
