Name: ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו לבודד סוגי תאים עצביים מרקמת מוח בעכברים באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי (FACS). שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים ושינויים אפיגנטיים ספציפיים לסוג תא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ללין אופדנקר מהמרכז למחקר תרגומי באוניברסיטת דלאוור במרכז הסרטן הלן פ. גרהם על הסיוע הטכני, כמו גם לננסי מרטין ממכון הסרטן של אוניברסיטת דיוק Flow Cytometry Shared Resource, ולד"ר סוזן ה. סמית על הדרכה בשיטות ואיסוף נתונים.

1. הכנה לאיסוף רקמות (15 - 30 דקות)
<ol>
	<li>מלטשים באש שלוש סטים של פיפטות פסטר מזכוכית בקטרים הולכים ופוחתים ומספרים אותם "1" = קוטר של כ-1 מ"מ, "2" = קוטר של כ-0.75 מ"מ ו-"3" = קוטר של כ-0.50 מ"מ.</li>
	<li>השעו מחדש את אנזים A שעבר ליופיליזציה עם כל Buffer A בהתאם לפרוטוקול המסופק עם ערכת הדיסוציאציה העצבית (ראה טבלת חומרים). אין מערבולת. יש לצטט את התמיסה ל-50 מיקרוליטר ולשמור ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.</li>
	<li>הכינו 1 ליטר של מאגר להסרת מיאלין ומסנן ואקום לעיקור [מאגר להסרת מיאלין = 1,000 מ"ל של 0.1 M תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS), 2 מ"ל של 500 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), ו-10 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA)].</li>
	<li>חותכים יריעת רשת ניילון לריבועים קטנים בגודל 1 x 1 אינץ' (2.5 x 2.5 ס"מ) שישמשו לסינון פסולת סלולרית וחיטוי בכוס קטנה מכוסה בנייר אלומיניום.</li>
	<li>הכן 1 ליטר של מאגר כביסה [מאגר כביסה = 1,000 מ"ל של 0.1 M PBS, 2 מ"ל של 500 מ"מ EDTA ו-10 גרם BSA].</li>
</ol>
2. איסוף רקמות
<ol>
	<li>הפעל את אמבט המים ל -37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן את Buffer X מערכת הדיסוציאציה העצבית על ידי הוספת בטא-מרקפטואתנול ל-Buffer X לריכוז סופי של 0.067 מ"מ (עבור 4 דגימות, הוסף 13.5 מיקרוליטר של 50 מ"מ בטא-מרקפטואתנול ל-10 מ"ל של Buffer X).</li>
	<li>הכן את Enzyme Mix 1 על ידי ערבוב של 50 מיקרוליטר של אנזים P עם 1,900 מיקרוליטר של Buffer X עבור כל דגימה כמתואר בפרוטוקול של ערכת הדיסוציאציה העצבית לדוגמה, עבור 4 דגימות, ערבב 200 מיקרוליטר של אנזים P עם 7,600 מיקרוליטר של Buffer X.</li>
	<li>יש להניח את Buffer X באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הנח 2 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת קרה של האנק (HBSS) (ללא Ca++ ו-Mg++) לבאר אחת של צלחת תרבית סטרילית של 6 בארות עבור כל דגימה שתיאסף ותשמור על קרח לדיסקציה של רקמות.</li>
</ol>
3. דיסקציה של רקמות (45 דקות - שעה)
<ol>
	<li>יש להזריק לבעל החיים נפח מתאים של תמיסת המתת חסד (תמיסת ברביטורט מסחרית, למשל, Euthasol), בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), ולהזרים את כל הדם בתמיסת מלח קרה של 0.9%.
	<ol>
		<li>תן חולדות עם מנת יתר של תמיסת המתת חסד.</li>
		<li>יש לעקוב אחר ההרדמה באמצעות נשימה ובאמצעות צביטה בבוהן. כאשר החיה מורדמת מספיק (אין תגובה לצביטה בבוהן ולנשימה עמוקה ואיטית), ניתן לחלחל את החולדה.</li>
		<li>כדי לחלחל את החולדה, חתכו את חלל החזה בעזרת מספריים כבדים. חותכים את הסרעפת כדי לאפשר גישה עד הלב. חותכים את הצלעות משני הצדדים עד לכיוון החלק העליון של החזה, כדי לאפשר גישה מלאה ללב. בשלב זה, ניתן להחזיק את כלוב הצלעות הצידה באמצעות זוג המוסטטים.</li>
		<li>בצע זלוף לב על ידי החדרת מחט 18 גרם (לחולדות בוגרות) המחוברת למשאבה חשמלית לחדר השמאלי של הלב. המשאבה שואבת תמיסת מלח קרה של 0.9%.</li>
		<li>לאחר מכן חתכו את האטריום הימני עם מספריים קטנים כדי לאפשר לדם ולנוזל להתנקז מהגוף.</li>
		<li>להחדיר חולדות עם כ-10 מ"ל (לחולדות בוגרות) של 0.9% מלח כדי להסיר את כל התאים והגורמים החיסוניים ההיקפיים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>נתח את החלק הרצוי של אזור המוח באמצעות סכיני גילוח סטריליים ודיסקציה מתאימה, ולאחר מכן הנח את חלקי הרקמה לתוך HBSS הקר ללא Ca2+ ו- Mg2+. 
	הערה: הפרוטוקול דורש HBSS ללא Ca2+ ו-Mg2+ בשלבים המוקדמים של הפרוטוקול מכיוון שיונים אלה עלולים להפריע לאנזימים הנדרשים לדיסוציאציה עצבית.</li>
	<li>לאחר איסוף כל דגימות הרקמה, חזור לספסל הנקי או למכסה המנוע הסטרילי לעיבוד רקמות.</li>
</ol>
4. דיסוציאציה עצבית (1 שעה)
<ol>
	<li>חותכים כל דגימת רקמה לקוביות קטנות בעזרת סכיני גילוח סטריליים על מכסה צלחת התרבות בת 6 הבארות. פרוטוקול זה שימש לדגימות רקמה של כ-30 - 100 מ"ג, אך מאושר לדגימות רקמה של עד 400 מ"ג. עבור דגימות רקמה גדולות מ-400 מ"ג, יש להגדיל את נפחי המגיב בהתאם.</li>
	<li>השתמש ב-1 מ"ל של HBSS טרי ללא Ca2+ ו-Mg2+ כדי להעביר את חתיכות הרקמה החתוכות לקוביות עם פיפטה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 2 מ"ל. חזור על שלבים 4.1 ו-4.2 עבור כל הדגימה עד שכל הדגימות הועברו לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את הדגימות ב-300 x g למשך 2 דקות ב-RT ושאיבה סופרנטנט.</li>
	<li>הוסיפו 1,900 מיקרוליטר של תערובת אנזימים חמה 1, כפי שהוכן בשלבים 2.2 ו-2.3, לכל דגימה וסגרו את הצינורות.</li>
	<li>דגרו את הדגימות למשך 15 דקות באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס, והפכו את הצינורות מספר פעמים כל 5 דקות כדי להשעות מחדש את פיסות הרקמה המיושבות.</li>
	<li>בינתיים, הכינו את Enzyme Mix 2 על ידי ערבוב של 20 מיקרוליטר של Buffer Y עם 10 מיקרוליטר של אנזים A מופשר (עבור 4 דגימות, ערבבו 80 מיקרוליטר של Buffer Y עם 40 מיקרוליטר של אנזים A מופשר).</li>
	<li>הוסף 30 מיקרוליטר של Enzyme Mix 2 לכל דגימה והפוך בעדינות. אין מערבולת.</li>
	<li>נתק כל דגימת רקמה עם פיפטה פסטר "1", טריטורציה למעלה ולמטה 30 פעמים.</li>
	<li>דגרו את הדגימות למשך 15 דקות באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס; הפכו את הצינורות מספר פעמים כל 5 דקות כדי לתלות מחדש את פיסות הרקמה המיושבות.</li>
	<li>נתק כל דגימת רקמה עם פיפטה פסטר "2", טריטורציה למעלה ולמטה 30 פעמים. הימנע מיצירת בועות.</li>
	<li>נתק כל דגימת רקמה עם פיפטה פסטר "3", טריטורציה למעלה ולמטה 30 פעמים. הימנע מיצירת בועות.</li>
	<li>דגרו את הדגימות למשך 10 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס; הפכו את הצינורות מספר פעמים כל 5 דקות כדי לתלות מחדש את התאים המיושבים.</li>
	<li>יש למרוח תרחיף של תא בודד על זן תאים של 80 מיקרון המונח על גבי שפופרת בז של 15 מ"ל כדי להסיר חתיכות גדולות של פסולת ולשטוף את המסנן והתאים עם 10 מ"ל של HBSS (עם Ca2+ ו-Mg2+) כדי לעצור את תגובות האנזים. חזור על הפעולה עד שכל דגימה מועברת לתוך שפופרת בז נקייה של 15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את הדגימות ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-RT ושואבות מהסופרנטנט.</li>
</ol>
5. דלדול מיאלין (45 דקות)
<ol>
	<li>השעו מחדש ביסודיות את כדור התאים עם 400 מיקרוליטר של מאגר להסרת מיאלין.</li>
	<li>יש להוסיף כמות מוגדרת של חרוזי הסרת המיאלין ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. 
	הערה: נפח חרוזי הסרת המיאלין שנעשה בהם שימוש יהיה תלוי בגודל הרקמה, בגיל החיה ובכמות המיאלין הצפויה באותו אזור מסוים במוח. למשל, עבור דגימת היפוקמפוס של חולדה בוגרת (כ-300 מ"ג), דגרו על הדגימה עם 100 מיקרוליטר של חרוזים להסרת מיאלין.
	
</li>
	<li>דוגרים למשך 15 דקות במקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שטפו כל דגימה עם 5 מ"ל של מאגר להסרת מיאלין.</li>
	<li>צנטריפוגה את הדגימות ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-RT.</li>
	<li>בזמן צנטריפוגה של הדגימות, הנח עמודה אחת לכל דגימה בשדה המגנטי של הסדרן המגנטי והנח מסנן נקי של 80 מיקרון על גבי כל עמודה.</li>
	<li>הכן את העמודות וסנן על ידי שטיפת כל עמודה עם 1 מ"ל מאגר להסרת מיאלין, 3 פעמים (סה"כ 3 מ"ל). אסוף את כל הזרימה במיכל פסולת כגון תחתית קופסת קצה ריקה.</li>
	<li>מקם צינור תחתון עגול מפוליסטירן 5 מ"ל ישירות מתחת לכל עמודה כהכנה לאיסוף הדגימות.</li>
	<li>כאשר התאים סיימו את הצנטריפוגה, שאפו סופרנטנט והשעו מחדש ביסודיות 500 מיקרוליטר של מאגר הסרת מיאלין. החל מיד תרחיף תאים על העמודה ואסוף את התאים בצינור שמתחת.</li>
	<li>שטפו את המסנן והעמודה עם מאגר להסרת מיאלין של 1 מ"ל, 4 פעמים (סה"כ 4 מ"ל).</li>
	<li>צנטריפוגה את אוסף התאים ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-RT.</li>
	<li>שאפו את הסופרנטנט והתאים מוכנים כעת לצביעה.</li>
</ol>
6. צביעת תאים חיים עבור FACS (שעה אחת לצביעה)
<ol>
	<li>מערבולת קצרה (2 שניות) את התאים כדי להפריד את הגלולה ולהוסיף מיד 5 מיקרוליטר של בלוק Fc (אנטי-אשכולות של התמיינות 32, CD32), מערבולת שוב, ולדגור במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>בינתיים, הכינו את תערובת הנוגדנים העיקרית על ידי הוספת שלושת הנוגדנים העיקריים במאגר הכביסה באופן הבא: 0.125 מיקרוליטר של נוגדן CD11b מצומד (APC) (1:800), 1 מיקרוליטר של נוגדן נגד GLT1 (1:100), ו-0.4 מיקרוליטר של פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) - נוגדן Thy1 מצומד (1:250) לכל 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה. כל דגימה תקבל 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית לדגירה; עם זאת, אם הדגימה שלך גדולה בהרבה מ-400 מ"ג רקמה, ייתכן שתרצה לשקול להגדיל את נפח תערובת הנוגדנים העיקרית שלך בהתאם</li>
	<li>הכן צינורות לבקרות צביעה בודדות על ידי הסרת 2 מיקרוליטר תאים בלבד מכל צינור דגימה והוספתו לכל צינור בקרת כתמים בודד. בקרות "הכתם הבודד" כוללות: APC-CD11b בלבד, GLT1 בלבד, FITC-Thy1 בלבד, נוגדן משני PE בלבד, והבקרה ה"ריקה" או הלא מוכתמת. 
	הערה: יש לייצג את כל הדגימות בכל בקרות הצביעה, ולכן יש להוסיף 2 מיקרוליטר תאים מכל דגימה לכל צינור בקרת צביעה.</li>
	<li>מערבל בקצרה את הצינורות (2 שניות) והוסף 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית לכל צינור דגימה ו-100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מתאים לכל צינור בקרת מכתים, מערבל שוב את הצינורות, מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן על הנוגדנים הפלואורסצנטיים מכל אור, ודוגרים את הצינורות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. יש לשמור את הדגימות קרירות (בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) למשך שארית ההליך כדי לשמור על שלמות הדגימות והנוגדנים.</li>
	<li>מערבל בקצרה את הצינורות והוסף 2 מ"ל מאגר כביסה לכל צינור.</li>
	<li>צינורות צנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בינתיים, הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית על ידי הוספת 0.2 מיקרוליטר של נוגדן משני נגד ארנב מצומד PE לכל 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה. כל דגימה תקבל 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים משנית; עם זאת, אם הדגימה שלך גדולה בהרבה מ-400 מ"ג רקמה, ייתכן שתרצה לשקול להגדיל את נפח תערובת הנוגדנים העיקרית שלך בהתאם.</li>
	<li>לאחר השלמת הצנטריפוגה, זרוק את הסופרנטנט מכל דגימה לכיור ומחק את הצינורות הפוכים על מגבת נייר.</li>
	<li>מערבל בקצרה את הצינורות והוסף 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים משנית לכל צינור דגימה ואת הנוגדן המשני המתאים לכל בקרת צביעה, מערבל שוב את הצינורות, מכסה את הצינורות בנייר אלומיניום ודוגר את הצינורות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות><.
	הערה: צינור בקרת הצביעה GLT1 בלבד אמור לקבל את תערובת הנוגדנים המשנית.
	
</li>
	<li>לאחר הדגירה, מערבל בקצרה את הצינורות והוסף 2 מ"ל מאגר כביסה לכל צינור.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב -350 x גרם למשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר השלמת הצנטריפוגה, זרוק את הסופרנטנט מכל דגימה לכיור ומחק את הצינורות הפוכים על מגבת נייר.</li>
	<li>מערבל את הצינורות והוסף 0.25 מ"ל PBS סטרילי לכל צינור. הדוגמאות מוכנות למיון. 
	הערה: תאים נוספים עשויים לדרוש 0.5 מ"ל של PBS סטרילי; עם זאת, עדיף להתחיל בנפח נמוך יותר מכיוון שתמיד ניתן לדלל את הדגימה אם היא מרוכזת מדי בתאים. 
	הערה: אופציונלי להוסיף DNase לצינור כדי למנוע גוש של התאים ובכך סתימת הממיין. ניתן גם לסנן דגימות באמצעות פילטר סטרילי של 80 מיקרון ממש לפני המיון על מנת למנוע סתימת הממיין.
	
</li>
	<li>קח תאים לממיין על קרח. אסוף את אוכלוסיות התאים בצינורות צנטריפוגה נטולי נוקלאז של 2 מ"ל עם 0.5 מ"ל PBS סטרילי בכל צינור.</li>
	<li>לאחר המיון, סובב את התאים כלפי מטה ב-300 x g למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את רוב ה-PBS והקפיא את התאים במקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף למיצוי RNA (ראה 1 לפרטי פרוטוקול נוספים), מיצוי DNA (ראה 2 לפרטי פרוטוקול נוספים) או ליזיס תאים לניתוח חלבון.</li>
</ol>

<ol><li>Schwarz, J. M., Smith, S. H., Bilbo, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+analysis+of+neuronal-glial+interactions+in+the+nucleus+accumbens+following+morphine+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">FACS analysis of neuronal-glial interactions in the nucleus accumbens following morphine administration.</a> Psychopharmacology. 230 (4), 525-535 (2013).</li>
<li>Schwarz, J. M., Hutchinson, M. R., Bilbo, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+experience+decreases+drug-induced+reinstatement+of+morphine+CPP+in+adulthood+via+microglial-specific+epigenetic+programming+of+anti-inflammatory+IL-10+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early-life experience decreases drug-induced reinstatement of morphine CPP in adulthood via microglial-specific epigenetic programming of anti-inflammatory IL-10 expression.</a> J Neurosci. 31 (49), 17835-1523 (2011).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+identifies+unique+cocaine-induced+gene+regulation+in+selectively+activated+adult+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons.</a> J Neurosci. 31 (11), 4251-4259 (2011).</li>
<li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+gene+alterations+are+induced+in+FACS-purified+Fos-positive+neurons+activated+during+cue-induced+relapse+to+heroin+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking.</a> J Neurochem. 124 (1), 100-108 (2013).</li>
<li>Liu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+alterations+in+methamphetamine-activated+Fos-expressing+neurons+from+single+rat+dorsal+striatum+using+fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> J Neurochem. 128 (1), 173-185 (2013).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> J Neurosci Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li>
<li>Nolte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+promoter-controlled+EGFP-expressing+transgenic+mice%3A+a+tool+to+visualize+astrocytes+and+astrogliosis+in+living+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue.</a> Glia. 33 (1), 72-86 (2000).</li>
<li>Okana, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li>
<li>Bogdanović, O., Veenstra, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+methyl-CpG+binding+proteins%3A+developmental+requirements+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function.</a> Chromosoma. 118 (5), 549-565 (2009).</li>
<li>Iwamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+show+distinctive+DNA+methylation+profile+and+higher+inter-individual+variations+compared+with+non-neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Neurons show distinctive DNA methylation profile and higher inter-individual variations compared with non-neurons.</a> Genome Res. 21 (5), 688-696 (2011).</li>
<li>Nishioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+specific+DNA+methylation+patterns+of+the+Cacna1c+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type specific DNA methylation patterns of the Cacna1c gene.</a> Int J Dev Neurosci. 31 (2), 89-95 (2013).</li>
<li>Kozlenkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+DNA+methylation+between+human+neuronal+and+glial+cells+are+concentrated+in+enhancers+and+non-CpG+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Differences in DNA methylation between human neuronal and glial cells are concentrated in enhancers and non-CpG sites.</a> Nucleic Acid Res. 42 (1), 109-127 (2014).</li>
<li>Russo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor+kappa+B+signaling+regulates+neuronal+morphology+and+cocaine+reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor kappa B signaling regulates neuronal morphology and cocaine reward.</a> J Neurosci. 29 (11), 3529-3537 (2009).</li>
<li>Bhatt, D., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NF-%CE%BAB-Mediated+Transcription+of+Inflammatory+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NF-κB-Mediated Transcription of Inflammatory Genes.</a> Front Immunol. 5, 71(2014).</li>
<li>Okada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> J Cell Physiol. 226 (2), 552-558 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בדומה לרקמות ומערכות רבות אחרות, המוח מורכב מאוכלוסיית תאים הטרוגנית המתפקדת יחד כדי להשפיע על התנהגות. לניתוח ביטוי גנים, ביטוי חלבונים או שינויים אפיגנטיים מתאים בודדים בתוך אותה אוכלוסייה הטרוגנית יש פוטנציאל לחשוף מידע על תפקוד המערכת בכללותה, לזהות תהליכים תאיים המווסתים הן התנהגות נורמלית והן תהליכי מחלה, ולספק מטרות ספציפיות לסוג התא לטיפולים פוטנציאליים. ייתכן שבעתיד, שינוי התפקוד של סוג תא בודד במוח עשוי לפתוח את המפתח לטיפול מוצלח בהפרעות ניווניות או נוירו-פסיכיאטריות באופן ספציפי יותר, ולהפחית תופעות לוואי לא ...

מטרת הפרוטוקול המתואר להלן היא לבודד סוגי תאים בודדים מאוכלוסייה הטרוגנית של רקמה עצבית לצורך ניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפי לסוג התא, ביטוי חלבון או אפילו סמנים אפיגנטיים. המוח מורכב מסוגי תאים רבים שמקורם בתאי אב מובחנים, ושיש להם תכונות ותפקודים ספציפיים לסוג התא. למרות ההבדלים הללו, סוגי תאים עצביים מובהקים אלה יכולים לבטא קולטנים דומים ומולקולות איתות תוך-תאיות המקשות על הניתוח של חלבונים נפוצים יותר אלה למדידה או לפירוש באופן ספציפי לסוג התא בשיטות קונבנציונליות. מדעני מוח חייבים לזהות את התפקוד וההפעלה של סוגי התאים השונים הללו במוח וכיצד הם יכולים להשפיע באופן אינדיבידואלי על התנהגות מכיוון שבסופו של דבר זה יהיה הצעד הראשון לזיהוי תרופות ספציפיות יותר ומטרות טיפוליות למחלות נוירולוגיות ונוירו-פסיכיאטריות. למרות מטרת העל הזו של מחקר מדעי המוח, זה יכול להיות קשה לבודד סוגי תאים עצביים בודדים מהמוח לצורך ניתוח ביטוי גנים או חלבונים, הפעלת מולקולות איתות או שינוי סמנים אפיגנטיים על ה-DNA. מבין הטכניקות המשמשות כיום, אימונוהיסטוכימיה יכולה לזהות ביטוי של חלבונים באופן ספציפי לסוג התא בשילוב עם צביעה נוספת של סמן ספציפי לסוג התא, אם כי זה מסתמך על נוגדנים ספציפיים שיכולים לצבוע כראוי את החלבונים המעניינים וזה יכול להיות קשה לכמת. הכלאה באתרה יכולה לזהות את הלוקליזציה הספציפית של חומצה ריבונוקלאית שליח (mRNA) בתאים בודדים במוח, אך זהו תהליך מייגע שמגביל גם את הניתוח המשותף של סוגי תאים ספציפיים ומאפשר רק ניתוח של גן אחד או אולי כמה גנים מעניינים. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר משתמשת בלייזר כדי לבודד תת-אוכלוסיות של תאים המומחשים באמצעות מיקרוסקופיה; עם זאת, האופי הגוזל זמן של תהליך זה והתפוקה הנמוכה יחסית יכולים להגביל משמעותית את הניתוח הבא של חלבונים או רמות mRNA, במיוחד אם הביטוי של מולקולות אלו נמוך מלכתחילה. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) היא טכניקה חדשה יחסית בתחום מדעי המוח לבידוד סוגי תאים בודדים מהמוח לצורך ניתוח עוקב של ביטוי גנים1 ו/או מטרות אפיגנטיות2. תהליך זה יכול לשמש גם למיון סוגים ספציפיים של תאים עצביים לניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפי לסוג התא, ביטוי חלבון או סמנים אפיגנטיים. FACS שימש במספר תחומי מחקר רפואיים כגון סרטן ואימונולוגיה במשך עשרות שנים כדי לספור ולמיין תאים שונים על סמך מאפיינים פיזיקליים או ביוכימיים3. בנוסף, ציטומטריית זרימה שימשה באופן קלאסי לניתוח ביטוי חלבון על בסיס כל תא, באמצעות נוגדנים ספציפיים. ההליך המתואר להלן, מנצל טכניקות ציטומטריית זרימה קלאסיות כדי לבודד סוגי תאים בודדים לניתוח עוקב של נקודות קצה של ביולוגיה מולקולרית. ציטומטר הזרימה יכול לנתח כמה אלפי תאים בשנייה, מה שהופך אותו לחלופה מהירה ויעילה לטכניקות שתוארו לעיל. בנוסף, ניתן לבודד תאים על סמך ביטוי תאי של חלבון ספציפי (למשל קולטן נוירוטרנסמיטרים) או שילוב של שני חלבונים או יותר (קולוקליזציה של חלבונים מרובים בסוג תא ספציפי). זה מאפשר למשתמש לבודד סוגי תאים עצביים סלקטיביים מאוד על סמך התכונות המולקולריות שלהם כדי לזהות את תפקודם במוח.
כדי לבצע FACS, תאים עצביים מוכנים לתרחיף של תא בודד המועבר דרך תא זרימה הנושא ומיישר את התאים כך שהם עוברים קובץ יחיד דרך קרן אור ולייזרים לניתוח. מחשב רוכש את הנתונים מכל תא ומתווה אותם על היסטוגרמה לניתוח פרמטרים מוגדרים (גודל, גרעיניות ופלואורסצנטיות). על סמך פרמטרים אלה, ניתן למיין את התאים באופן מיידי לצינורות נפרדים לצורך זיכרונם וניתוח לאחר מכן של כל נקודת קצה רצויה. הפרוטוקול המתואר להלן משתמש בשלושה נוגדנים למיון נוירונים (באמצעות אנטיגן תימוציט 1, נוגדן Thy1), אסטרוציטים (באמצעות טרנספורטר גלוטמט גליה, נוגדן GLT1) ומיקרוגליה (באמצעות מקבץ של מולקולת התמיינות 11B, נוגדן CD11b). ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כמתואר להלן או לשנות אותו עם נוגדנים שונים בהתאם לסוג התא שאדם רוצה לבודד לניסויים שלו.
ישנן כמה אזהרות שיש לקחת בחשבון כאשר קובעים אם פרוטוקול זה מתאים לניסויים ספציפיים. אזהרה מרכזית אחת עשויה להתייחס לסוג התא הספציפי שרוצים לבודד. בפרוטוקול זה, שלושת הנוגדנים המשמשים הם נוגדנים חוץ-תאיים, המאפשרים לנסיין לשמור על סוגי התאים שלמים במהלך הליך הצביעה, ובכך לשמור על שלמות ה-RNA, ה-DNA והחלבונים שבתוכו. ייתכן שמישהו ירצה לבודד סוג תא עצבי ספציפי באמצעות נוגדן המזהה חלבון המתבטא רק בתוך אותו תא מסוים. לדוגמה, ייתכן שתרצו לבודד נוירונים דופמינרגיים באמצעות נוגדן לטירוזין הידרוקסילאז או לבודד נוירונים אצטילכולין באמצעות נוגדן לכולין אצטילטרנספראז. חלבונים אלה הם תוך-תאיים ולכן ידרשו קיבוע וחדירה של קרום התא לצביעה לאחר מכן עם הנוגדנים המתאימים. למרות שזה נעשה לפני 4,5, תהליך זה עשוי להפחית משמעותית את תפוקת ה-RNA או ה-DNA מהתאים החדירים הללו. אזהרה נוספת עשויה להיות שלא כל הנוגדנים מתאימים ל-FACS. לדוגמה, ניתן כיום להשתמש בנוגדנים שעובדים טוב מאוד עבור כתם מערבי, טכניקה הדורשת דנטורציה של חלבונים. ייתכן שהנוגדן הזה לא בהכרח מתאים לזיהוי סוגי תאים אלה באמצעות FACS בהתחשב בכך שהחלבונים אינם עוברים דנטורציה בשום שלב בפרוטוקול זה ולכן ייתכן שלנוגדנים לא תהיה דרך להיקשר לאנטיגן הטבוע בו. חברות מספקות דפי מפרט המזהים את היישומים שעבורם אושר נוגדן. אם נוגדן לא אושר לזרימה ציטומטרית, זה לא אמור להרתיע אותך מלנסות את הפרוטוקול הזה עם נוגדן מסוים; עם זאת, יש להיות מודעים לכך שלא מובטח שזה יעבוד עבור FACS. אזהרה שלישית של פרוטוקול זה קשורה למספר התאים שמנסים לבודד. FACS היא טכניקה מצוינת להניב כמה שיותר תאים אפילו מחתיכה קטנה של רקמה, אבל ייתכן גם שאם רוצים לבודד אוכלוסייה דלילה יחסית של תאים מאזור קטן יחסית במוח, התפוקה של בעל חיים אחד תהיה נמוכה מטבעה. במקרה זה, ייתכן שיהיה צורך לאסוף את רקמת המוח מכמה בעלי חיים באותה קבוצת טיפול על מנת להניב את מספר התאים הדרושים לניתוח שלאחר מכן; עם זאת, פרסום שפורסם לאחרונה השתמש בהגברה מוקדמת ממוקדת גנים של cDNA לניתוח עוקב של ביטוי גנים ממספר קטן של נוירונים מופעלים (5-6%) מקבוצה גדולה יותר של נוירונים ממוינים, מה שמצביע על כך שניתן לנתח ביטוי גנים אפילו מתת-קבוצות קטנות של תאים עצביים מבלי לאגד מספר רב של בעלי חיים6אזהרה אחרונה של טכניקה זו היא שצריכה להיות גישה לממיין תאים שאינו רחוק מדי. סדרן התאים הוא מכונה מסובכת הדורשת הכשרה משמעותית על מנת להשתמש בה כראוי. לפיכך, מכונות אלו מופעלות לרוב על ידי טכנאי מוסמך במתקן ליבה. בנוסף, מטרת הליך זה היא לנתק את הרקמה העצבית, לצבוע אותה לנוגדנים ספציפיים, ולקחת מיד את הדגימות הללו לממיין תוך פרק זמן קצר (אולי חצי יום). מסגרת זמן זו תעזור להגדיל את ההישרדות והתשואה של תאים מבודדים ולשמור על שלמות התאים לעיבוד וניתוח לאחר מכן. אם כל הפרמטרים הללו שתוארו לעיל מתקיימים, FACS היא שיטה מצוינת לניתוח ביטוי ספציפי לסוג התא של גנים וחלבונים מרקמה עצבית.
כל הניסויים בוצעו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דלאוור ומדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

<table><tbody><tr><td>ערכת דיסוציאציה עצבית (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים להסרת מיאלין II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מפריד QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>גיליון רשת ניילון</td><td>אמזון</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>רוחב 40 אינץ', רשת בגודל 80 מיקרון</td></tr><tr><td>Fc Block / anti-CD32</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>תגובתיות BDB550270 לחולדה</td></tr><tr><td>נוגדן CD11b מצומד APC</td><td>תגובתיות 201809 לחולדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-GLT1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20136</td><td>תגובתיות לחולדה או לאדם</td></tr><tr><td>מצומד PE אנטי ארנב נוגדן משני</td><td>eBioscience</td><td>1037259</td><td>נוגדן משני לאנטי-GLT1</td></tr><tr><td>מצומד FITC נוגדן נגד עכברים CD90 (Thy1)</td><td>תגובתיות 202504 Biolegend לחולדה</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

המוח מורכב מארבעה סוגי תאים עיקריים כוללים נוירונים, האסטרוציטים, מיקרוגלים וoligodendrocytes. למרות שהם לא סוג התא הנפוץ ביותר במוח, תאי עצב הם נחקרים ביותר של סוגי התאים אלה ניתנו תפקידם הישיר במשפיעים התנהגויות. סוגי תאים אחרים במוח גם להשפיע פונקציה והתנהגות עצביות באמצעות מולקולות האיתות שהם מייצרים. מדעני מוח צריך להבין את יחסי הגומלין בין סוגי התאים במוח כדי להבין טוב יותר איך אינטראקציות אלה משפיעות פונקציה ומחלות עצביות. עד כה, השיטה הנפוצה ביותר של ניתוח ביטוי חלבון או גן מנצלת את המגון של דגימות רקמה שלמות, בדרך כלל עם דם, וללא קשר לסוג תא. גישה זו היא גישה אינפורמטיבי לבחינת שינויים כלליים בגן או ביטוי חלבון שעשוי להשפיע על תפקוד והתנהגות עצביים; עם זאת, שיטה זו של ניתוח לא להשאיל את עצמה להבנה טובה יותר של תארווחים מסוג ספציפי ביטוי גנים וההשפעה של תקשורת תא אל התא בתפקוד עצבי. ניתוח של אפיגנטיקה התנהגות היה שטח של מוקד גדל שבוחן כיצד שינויים של החומצה דאוקסיריבונוקלאית ביטוי (DNA) השפעת מבנה לטווח ארוך גן והתנהגות; עם זאת, מידע זה עשוי להיות רלוונטי רק אם ניתח באופן תאים מסוג ספציפי נתון שושלת ההפרש וסמנים אפיגנטיים כך שעשויה להיות נוכחים בגנים מסוימים של סוגי תאים עצביים בודדים. תא הקרינה מיון פעיל טכניקה (FACS) המתוארת להלן מספק דרך פשוטה ויעילה לבודד תאים עצביים פרט לניתוח שלאחר מכן של ביטוי גנים, ביטוי חלבון, או שינויים אפיגנטיים של ה- DNA. טכניקה זו יכולה גם להיות שונה כדי לבודד סוגי תאים עצביים ספציפיים יותר במוח לניתוח שלאחר מכן תאים מסוג ספציפי.

החשיבות של דלדול מיאלין ופרפוזיה של רקמות
איור 1 ממחיש את החשיבות של סילוק המיאלין. סילוק המיאלין (שלבים 5.1 עד 5.12 בפרוטוקול לעיל) מתבצע כאשר תרחיף התאים הבודדים מדוגר עם Myelin Removal Beads, נשטף, ולאחר מכן עובר דרך העמודה בממיין המגנטי. מטרת שלבים אלו היא להפחית את כמות השאריות התאיות הנמצאות בכל דגימה. בעת פירוק והומגנציה של נוירונים, עלולים להיגזז שלוחות שהן בדרך כלל עטופות במיאלין, ולכן הן עשויות להראות צביעה חיובית עם הנוגדן Thy1. הדבר גורם ליצירת שאריות מיאליניות שעל...

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בטכניקת מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS) כדי למיין סוגים ספציפיים של תאים עצביים לניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפיים לסוג התא, סמנים אפיגנטיים ו/או ביטוי חלבון.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד סוגי תאי עצב בודדים מרקמת מוח לצורך אנליזה המשכה. דבר זה מושג תחילה על ידי פירוק (דיסוציאציה) של רקמת עצבים לתליה של תאים בודדים. בשלב השני, המיאלין מוסר מהתליה ולאחר מכן התאים נצבעים באמצעות נוגדנים ספציפיים לסוג התא.בשלב הסופי, אוכלוסיות התאים הבודדות מומינו באמצעות ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, שיטה זו לבידוד ספציפי של סוגי תאים תאפשר למשתמשים לבחון שינויים בביטוי גנים או חלבונים, או מודיפיקציות אפיגנטיות, באופן ספציפי לסוג התא. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום מדעי העצבים, כגון אילו סוגי תאים מבטאים רצפטורים מסוימים, אילו מבטאים חלבונים מסוימים, ואילו מבטאים מודיפיקציות אפיגנטיות מסוימות, כדי שנוכל להבין טוב יותר מנגנונים ספציפיים לסוגי תאים במוח.התחילו את הדיסוציאציה העצבית באמצעות להבי תער סטריליים כדי לחתוך כל דגימה שנלקחה מרקמות מוח של בוגרים לחתיכות קטנות של 30 עד 400 milligram על מכסה של פלטת תרבית בעלת שישה בארות. לאחר מכן, טבלו את הרקמה ב-1 milliliter של HBSS נטול סידן ומגנזיום, והשתמשו בפיפטה כדי להעביר את הדגימות למבחנות צנטריפוגה סטריליות של 2 milliliter לאחר שכל הרקמות נאספו. צנטריפוגו את הדגימות ושאבו את העל-נוזל (supernatants).הוסיפו 1,900 µL של אנזים חם. ערבבו פעם אחת והדגירו את הדגימות למשך 15 דקות. השתמשו במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C, והפכו את המבחנה מספר פעמים בכל חמש דקות כדי לתלה מחדש את חלקי הרקמה ששקעו.בסיום הדגירה, הוסף 30 µL של אנזים שהוכן טרי. ערבב היטב כל דגימה והפוך את המבחנות בעדינות. לאחר מכן, באמצעות פיפטה מסוג Pest המסומנת כ-1, בצע דיסוציאציה לכל דגימה באמצעות 30 חזרות של שאיבה ושחרור (up and down).הקפידו להימנע מיצירת בועות. דגרו את הדגימות למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 °C תוך היפוך כל חמש דקות, ולאחר מכן בצעו דיסוציאציה של הדגימות באמצעות פיפט פסט מספר 2, כפי שהודגם כעת.לאחר מכן עברו לפיפט מספר שלוש, חזרו על תהליך הדיסוציאציה והדגירו את הדגימות ל-10 דקות נוספות. במקבץ המים, עם היפוך בכל חמש דקות, ובסיום ההדגרה סננו את תרחיפי התאים הבודדים דרך מסנני תאים של 80 מיקרון לתוך מבחנות Falcon של 15 מיליליטר. שטפו כל מסנן עם 10 מיליליטר של HBSS נטול סידן ומגנזיום כדי להפסיק את התגובות האנזימטיות. כאשר הדגימה האחרונה סונננה, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה ושאבו את העלייה כדי להסיר את המיילין מהתאים.בשלב הסספנסיות, השביהו את המשקעים באופן יסודי ב-400 microliters של בופר להסרת מיאלין, והוסיפו לכל מבחנה את הכמות המתאימה של חרוזי הסרת מיאלין. שאיפו והנחיתו את התמיסות באמצעות פיפטה עד שהתאים והחרוזים מעורבבים היטב. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius למשך 15 דקות.לאחר הדגירה, שטפו כל דגימה בחמישה מיליליטר של בופר להסרת מיאלין בזמן שהתאים מסתובבים; הניחו עמודה אחת עבור כל דגימה בשדה המגנטי של מפריד מגנטי והניחו מסנן נקי של 80 מיקרון על גבי כל עמודה. שטפו כל מסנן ועמודה במיליליטר אחד של בופר להסרת מיאלין שלוש פעמים, תוך איסוף כל הנוזל שעבר למכל פסולת. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו מבחנות פוליסטירן בעלות תחתית עגולה של חמישה מיליליטר ישירות מתחת לכל עמודה כדי לאסוף את התסנין.לאחר מכן, שאבו את הנוזל העליון מהדגימות וסספנדו מחדש את המשקעים ב-500 µL של בופר להסרת מילין. העבירו מיד את סספנסיות התאים לעמודות, ואספו את התאים למבחנות שמתחתיהן. לאחר מכן, שטפו כל מסנן ועמודה ארבע פעמים עם 1 mL של בופר להסרת מילין בכל שטיפה.לאחר השטיפה האחרונה, סובבו את התאים בצנטריפוגה ושאיפו את העל-נוזלים (supernatants) לצורך צביעת התאים להפרדה באמצעות ציטומטריה של זרימה. ערבבו כל דגימה ב-Vortex למשך כשתי שניות כדי לפרק את המשקעים, והעבירו מיקרוליטר אחד של תאים מכל מבחנה למבחנות נפרדות. עבור בקרות הצביעה, הוסיפו מיד חמישה מיקרוליטר של FC block לכל מבחנה, כולל מבחנות בקרות הצביעה.לאחר מכן, ערבבו שוב את הדגימות במערבל (vortex) והדגירו אותן בטמפרטורה של 4°C. לאחר חמש דקות, הוסיפו 100 µL של תערובת הנוגדנים הראשוניים המתאימה. כסו את המבחנות כדי להגן על הנוגדנים מהאור והדגירו את התאים בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות.בסיום הדגירה, שטפו את הדגימות בשני מיליליטר של בופר שטיפה, לאחר מכן שאבו את העל-נוזל (supernatants) וסמנו כל דגימה ב-100 microliters של הנוגדן השני המתאים. כסו את המבחנות והניחו אותן בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את הדגימות בשני מיליליטר של בופר שטיפה, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה, ולאחר מכן שאבו את הנוזלים.סספנסיה של משקעים: השביה את המשקעים ב-250 µL של PBS סטרילי ובצע מיון תאים. כאן מוצגות אוכלוסיות מייצגות של תאי עצב מהיפוקמפוס של זכר בודד שמוינו בשיטת flow sorting. התאים סוננו תחילה מכלל האירועים האפשריים על בסיס תכונות ה-forward scatter וה-side scatter שלהם. לאחר מכן, תאים בודדים (singlets) סוננו מכל ה-doublets או מקבצי תאים גדולים יותר על בסיס גודלם כדי לאפשר מיון מדויק של סוגי התאים הבודדים. לאחר מכן, התאים הבודדים מוינו לאוכלוסיות תאים CD11b חיוביים ו-CD11b שליליים, עם מיון נוסף של התאים ה-CD11b שליליים לתאים GT1 ו-TH1 חיוביים. לאחר מכן נעשה שימוש בתוכנית הניתוח כדי לקבוע את המספר הכולל של האירועים בכל אוכלוסייה, וכן את האחוז מאוכלוסיות המקור, כדי לאשר את טוהר התאים הממוינים.בדוגמה ספציפית זו, ביטוי גנים יחסי של גנים ספציפיים לסוגי תאים חלופיים נחקר באמצעות real-time PCR. כצפוי, נתונים אלו אישרו את טוהר התאים הממוינים, וכן זיהו מספר הבדלים מעניינים בין אזורי המוח שנבדקו. לאחר אישור טוהר המיון, ניתן למדוד את הביטוי של גנים אחרים בעלי עניין כדי לקבוע את סוג התא הספציפי שבו הם מתבטאים, או האם ביטוים השתנה בעקבות טיפול באופן הספציפי לסוג התא.לדוגמה, כאן נבחן הביטוי של cow binding, חלבון קושר סידן המשמש לעיתים קרובות לזיהוי נוירונים בהיפוקמפוס ובמוחון. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד סוגים ספציפיים של תאי עצב רלוונטיים, כגון התא העצבי המוצג כאן, באמצעות נוגדנים מתאימים לפני השטח של התא.

using-fluorescence-activated-cell-sorting-to-examine-cell-type

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי עצב המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוח עכבר.

בידוד תאי עצב המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוח מורין

סרטון זה מדגים את הליך הבידוד והמיון של גרעינים מרקמת מוח אנושית טרייה וקפואה באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FANS), המאפשר חקר אוכלוסיות תאים שונות עבור יישומים נוירולוגיים שונים.

בידוד אוכלוסיות תאים מרקמת המוח באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד תאים מהיפוקמפי חולדה, כולל נוירונים, אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה.

קבלת אוכלוסיות תאים עצביים שונות מהיפוקמפוס של חולדה

סרטון זה מדגים את הדיסוציאציה של רקמת מוח קפואה של חולדה לתרחיף חד-תאי באמצעות עיכול אנזימטי וטריטורציה מכנית. התאים המוכנים מקובעים וחדירים באתנול ליישומים במורד הזרם כמו ציטומטריית זרימה או ניתוח ביטוי גנים.

השגת תרחיף של תא בודד מרקמת מוח של חולדה קפואה

מקור: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. שימוש בקרינה קרובה לאינפרא-אדום וסריקה ברזולוציה גבוהה למדידת ביטוי חלבון במוח המכרסמים. J. Vis. Exp. (2019) סרטון זה מדגים פלואורסצנציה קרובה לאינפרא-אדום ושיטת סריקה ברזולוציה גבוהה למדידת ביטוי חלבון במוח המכרסם.

מדידת ביטוי חלבונים במוח מכרסמים באמצעות פלואורסצנציה קרובה לאינפרא אדום וסריקה ברזולוציה גבוהה 

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

אנו מדווחים על שיטה מבוססת מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) לבידוד תאי גזע עצביים (NSCs) וצאצאיהם מהאזור התת-חדרי (SVZ) של מוח העכבר הבוגר. מיושם על עכברים טרנסגניים של אינדיקטור מחזור תא פלואורסצנטי (FUCCI), הוא מאפשר לחקור את התקדמות מחזור התא על ידי הדמיה חיה.

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

כאן אנו מציגים מיון תא הופעל קרינה (FACS) פרוטוקול ללמוד שינויים מולקולריים Fos להביע רכבים עצביים משתי רקמת מוח טריה וקפואה. שימוש רקמה קפוא מאפשר בידוד FACS של אזורי מוח רבים על פני פגישות מרובות כדי למקסם את השימוש בנושאי בעלי חיים בעלי ערך.

רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה-רדיוליגנד ורקמה מטופלת (FACS-RTT) הוא כלי רב עוצמה לחקר תפקידו של חלבון טרנסלוקטור 18 kDa או ביטוי קולטן סרוטונין 5HT2A במחלת אלצהיימר בקנה מידה תאי. פרוטוקול זה מתאר את יישום ex-vivo של FACS-RTT במודל חולדות TgF344-AD.

מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה-רקמה מטופלת רדיוליגנד (FACS-RTT) כדי לקבוע את המקור התאי של אותות רדיואקטיביים

מוצגת כאן שיטה לרצף גרעינים בודדים שבודדו מהפיתול המשונן של העכבר, שאינה כוללת את רוב תאי העצב באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FAN). גישה זו מייצרת פרופילי ביטוי איכותיים ומקלה על המחקר של רוב סוגי התאים האחרים המיוצגים בנישה, כולל אוכלוסיות נדירות כגון תאי גזע עצביים.

מיון שלילי של גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה של נוירונים בשילוב עם ריצוף RNA של גרעין יחיד כדי לחקור את הנישה הנוירוגנית של ההיפוקמפוס

למדו לבודד סוגי תאים עצביים מרקמת מוח בעכברים באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי (FACS). שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים ושינויים אפיגנטיים ספציפיים לסוג תא.

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

גלה סרטונים נוספים