ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד סוגי תאים עצביים בודדים מרקמת המוח לצורך ניתוח לאחר מכן. זה מושג על ידי פירוק רקמה עצבית תחילה לתרחיף תא בודד. בשלב השני, המיאלין מוסר מהתרחיף ואז התאים נצבעים לנוגדנים ספציפיים לסוג התא.

בשלב האחרון, אוכלוסיות התאים הבודדות ממוינות לפי ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, שיטה זו של בידוד ספציפי לסוג התא תאפשר למשתמשים לבחון שינויים בביטוי גנים או חלבונים או שינויים אפיגנטיים באופן ספציפי לסוג התא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון אילו סוגי תאים מבטאים קולטנים מסוימים, המבטאים חלבונים מסוימים, ואילו מבטאים שינויים אפיגנטיים מסוימים כדי שנוכל להבין טוב יותר מנגנונים ספציפיים לסוג התא במוח.

התחל את הדיסוציאציה העצבית על ידי שימוש בסכיני גילוח סטריליים כדי לחתוך לקוביות כל דגימה שנאספה מרקמות מוח בוגרות לחתיכות קטנות של 30 עד 400 מיליגרם על מכסה של צלחת תרבית שש בארות. לאחר מכן טבלו את הרקמה במיליליטר אחד של HBSS ללא סידן ומגנזיום והשתמשו בפיפטה כדי להעביר את הדגימות לצינורות צנטריפוגה סטריליים של שני מיליליטר לאחר שכל הרקמות נאספו. צנטריפוגה את הדגימות ושואב את הסופרנטנטים.

הוסף 1,900 מיקרוליטר אנזים חם. מערבבים אחד ומדגרים את הדגימות למשך 15 דקות. באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, הפוך את הצינור מספר פעמים כל חמש דקות כדי להשעות מחדש את פיסות הרקמה המיושבות.

בתום הדגירה מוסיפים 30 מיקרוליטר אנזים טרי שהוכן מראש. מערבבים שניים לכל דגימה והופכים בעדינות את הצינורות. לאחר מכן בעזרת פיפטה מזיקים המסומנת באחת, נתק כל דגימה עם 30 איטרציות למעלה ולמטה.

הקפדה להימנע מיצירת בועות. דגרו את הדגימות למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם היפוך כל חמש דקות, ולאחר מכן דיסוציאציה של הדגימות עם פיפטת מזיקים. מספר שתיים, כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן עברו לפיפטה מספר שלוש, חזרו על הדיסוציאציה ודגרו על הדגימות למשך 10 דקות נוספות. באמבט המים עם היפוך כל חמש דקות בסוף מסנן הדגירה מתרחף התא הבודד דרך מסננות תאים של 80 מיקרון לתוך צינורות פלקון של 15 מיליליטר. שטיפת כל מסננת עם 10 מיליליטר של HBSS ללא סידן ומגנזיום כדי לעצור את התגובות האנזימטיות לאחר סינון הדגימה האחרונה, סובבו את הצינורות ושאפו את הסופרנטנטים כדי לרוקן את המיאלין מהתא.

תרחיפים משהים ביסודיות את הכדורים ב-400 מיקרוליטר של מאגר להסרת מיאלין, ומוסיפים את הכמות המתאימה של חרוזי הסרת מיאלין לכל צינור. פיפטו את התמיסות למעלה ולמטה עד שהתאים והחרוזים מעורבבים היטב. לאחר מכן דגרו את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה, שטפו כל דגימה בחמישה מיליליטר של מאגר להסרת מיאלין בזמן שהתאים מסתובבים, הניחו עמודה אחת לכל דגימה בשדה המגנטי של סדרן מגנטי והניחו מסנן נקי של 80 מיקרון על גבי כל עמודה. שטפו כל מסנן ועמודה עם מיליליטר אחד של מאגר להסרת מיאלין שלוש פעמים ואספו את כל הזרימה במיכל פסולת. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו חמישה צינורות תחתונים עגולים מפוליסטירן מיליליטר ישירות מתחת לכל עמוד כדי לאסוף את הפליטה.

לאחר מכן שאפו את שם העל מהדגימות והשעו מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר של מאגר להסרת מיאלין. החל מיד את מתלי התאים על העמודים, ואסף את התאים בצינורות שמתחת. לאחר מכן שטפו כל מסנן ועמוד ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של הסרת מיאלין, חיץ לכל שטיפה.

לאחר השטיפה האחרונה, סובב את התאים ושאף את הסופרנטנטים כדי לצבוע את התאים למיון לפי ציטומטריית זרימה. מערבולת כל דגימה למשך כשתי שניות כדי לנתק את הכדורים ולהעביר מיקרוליטר אחד של תאים מכל צינור לצינורות בודדים. עבור בקרות הצביעה, הוסף מיד חמישה מיקרוליטר של בלוק FC לכל צינור, כולל בקרות הצביעה.

לאחר מכן מערבל שוב את הדגימות ודוגר אותן בארבע מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, הוסף 100 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים הראשוני המתאים. כסו את הצינורות כדי להגן על הנוגדנים מפני אור ודגרו על התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

בתום הדגירה, שטפו את הדגימות בשני מיליליטר של מאגר כביסה, ואז שאפו את הסופרנטנטים וסמנו כל דגימה ב-100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המתאים. מכסים את הצינורות ומניחים אותם על ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן שטפו את הדגימות בשני מיליליטר של צנטריפוגת מאגר כביסה את הדגימות, ולאחר מכן שאפו.

Supernatants Resus, תלו את הכדורים ב-250 מיקרוליטר של PBS סטרילי וממיינים את התאים כאן אוכלוסיות ממוינות בזרימה מייצגת של תאים עצביים מהיפוקמפוס זכרי יחיד מוצגות שהתאים היו מגודרים ראשונים מכל האירועים האפשריים על סמך תכונות הפיזור הקדמית והצדדית שלהם. לאחר מכן, התאים הבודדים או הסינגלטים גודרו מכל כפולות או גושי תאים גדולים יותר על סמך גודלם כדי לאפשר מיון מדויק של סוגי התאים הבודדים, התאים הבודדים מוינו לאחר מכן לאוכלוסיות תאים שליליים CD 11, B חיובי ו-CD 11 B שליליים עם מיון נוסף של התאים השליליים CD 11 B לתאים חיוביים GT 1 ו-TH 1. לאחר מכן נעשה שימוש בתוכנית הניתוח כדי לקבוע את המספר הכולל של האירועים בכל אוכלוסייה וכן את אחוז אוכלוסיות ההורים כדי לאשר את טוהר התאים הממוינים.

בדוגמה מסוימת זו, ביטוי הגנים היחסי של גנים ספציפיים לסוג תא חלופי נותח על ידי PCR בזמן אמת. כצפוי, נתונים אלה אישרו את טוהר התאים הממוינים, כמו גם זיהו כמה הבדלים מעניינים בין אזורי המוח שנחקרו. לאחר אישור טוהר הסוג, ניתן למדוד את הביטוי של גנים מעניינים אחרים כדי לקבוע את סוג התא הספציפי שבו הם באים לידי ביטוי, או האם הביטוי שלהם משתנה בעקבות טיפול באופן ספציפי לסוג התא.

לדוגמה, כאן נחקר הביטוי של קשירת פרה, חלבון קושר סידן המשמש לעתים קרובות לזיהוי נוירונים בהיפוקמפוס ובמוח הקטן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד סוגי עניין ספציפיים של תאים עצביים, כגון התא העצבי המוצג כאן באמצעות נוגדנים מתאימים על פני התא.