Name: TH17 דגם דלקת של לוע תחתון פטרת בעכברים immunodeficient (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: למדו ליצור דגם של דלקת פה תלויה זיהום המתווה על ידי תאי Th17 פתולוגיים בעכברים immunodeficient. השיטה משתמשת בזריקת תאי Th17 וזיהום Candida albicans לחקירת אימונופתולוגיה של תאי T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר הלן ברנשטיין על שסיפקה לנו גישה לציטומטר הזרימה שלה. אנו מודים גם למתקן ציטומטריית הזרימה CFAR על שירותי ציטומטריית הזרימה. פרויקט זה נתמך בחלקו על ידי מימון ניצול הליבה של CTSC ומענק תאגיד STERIS/בתי חולים אוניברסיטאיים-המחלקה למחלות זיהומיות ל-PP.

הערה: הניסויים באמצעות עכברים בוצעו בהתאם לועדת רווחת בעלי החיים המוסדיים (IACUC) הנחיות. 1. לשחזר את סמרטוט-1 - / - העכברים עם תאים אני n חוץ הגופייה בתרבית TH17 (שלושה ימים לפני זיהום) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקמת תאי TH17, תרבות תאי T מסוג CD4 + הנאיבי CD44low CD62Lhigh CD25- (3 x 104) ב 96 צלחות U-תחתונה גם לבד, או שיתוף תרבותם יחד עם 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs בנוכחות מסיסה α-CD3, α-CD28 (2 מיקרוגרם / מיליליטר) נוגדנים ותאי הצגת אנטיגן, בתנאי TH17 (מקוטב באמצעות IL-6 (25 ng / ml), β TGF- (2 ng / ml) (1 מיקרוגרם / מיליליטר) , Α-IFN-γ (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ו-IL-4 α (2 מיקרוגרם / מיליליטר)) לשלוש עד ארבעה ימים. הערה: תאים נאיביים ובתקנות T מוינו באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS)ד נהלי בידוד תא מגנטי ותרבותי כפי שתואר לעיל 19-22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, לאחר resuspending תאי TH17 באמצעות פיפטה, לאסוף אותם מתרבויות, וצנטריפוגות בתנאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot קטן של תאים אלה לבחינת הכדאיות שלהם ועבור phenotyping. Resuspend אותם 500 μl של מדיום RPMI, להוסיף יודיד propidium (200 ng / ml) ולהעריך את הכדאיות שלהם באופן מיידי על ידי cytometry זרימה. בצע phenotyping ידי cytometry זרימת ההערכה של ייצור IL-17 א לאחר restimulation (ראה סעיף 6.3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ולשטוף את הנפח העיקרי של התאים בPBS סטרילי ב 480 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C בכל השלבים, אלא אם כן צוין אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתאים אלה להעברת מאמצת לCD45.2 Rag1 6-8 שבוע ישן - / - עכברי immunodeficient. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בצפיפות תאי 1 x 10 7 תאים / מיליליטר באמצעות PBS סטרילי הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק של התאים 100 μl ידי intrapהזרקת eritoneal, באמצעות 25 מחטים G על 1 מיליליטר מזרקים טוברקולין, כך שעכבר אחד מקבל 1 x 10 6 תאים. עכברים מסוימים יקבלו תאי PBS או TH17 בלבד, ועכברים אחרים יקבלו תאי TH17 שהיו שיתוף תרבותי עם תאי Treg. הערה: בצע את כל שלבי סביבה נקיה מחיידקים. </li></ol></li></ol> 2. גידול C. אלביקנס לזיהום (יום אחד לפני זיהום) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני החיסון, לפזר חמש מושבות של ג CAF2-1 זן אלביקנס מעבדה בהשעית PBS סטרילי 100 μl, ומוסיף את ההשעיה למרק סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מושבות של ג אלביקנס ב 50 מיליליטר של בסיס חנקן שמרים (YNB ללא חומצות אמינו) / Peptone / בינוני דקסטרוז מרק ודגירה בחממה שייקר ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15-18 שעות ב 130 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על המרק לעננות, כפי שהיא אינדיקציה לצמיחה של הפטרייה. </li></ol> 3. קנדידהקציר וסדר ספירה (ביום של זיהום) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 10 מיליליטר של מרק קנדידה ב 15 מיליליטר צינורות. לנפחים גדולים יותר, לאסוף קנדידה בצינורות 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה blastospores ב1,900 XG במשך 5 דקות בRT בכל השלבים, אלא אם כן צוין אחרת. גלולה blastospores ידי צנטריפוגה, ואחריו הסרת supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צינור אחד או יותר, בריכת blastospores קנדידה מצינורות מרובים, הוספת PBS סטרילי לכדורים וresuspend אותם 10 מיליליטר של PBS לספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 μl של blastospores בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge, להוסיף 20 μl של paraformaldehyde 2X ולדגור על RT במשך 15-20 דקות. רוזן blastospores הקבוע באמצעות hemocytometer מתחת למיקרוסקופ. הערה: Paraformaldehyde הוא מסרטנת. פתח את הפתרון חי רק במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לחזור על שטיפת blastospores לפחות פעמיים, על ידי צנטריפוגה tמכפלת בPBS, וpelleting blastospores. שמור את כדורים ב 15 מיליליטר צינורות ב RT, בשכונה ABSL1, מוכן לזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר כמה PBS סטרילי בRT לresuspending blastospores לזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ספירה, להוסיף PBS סטרילי לגלולת blastospore להתאים את מספרי תא השמרים blastospore עד 2 x10 8 תאים / מיליליטר שמרים. זה ההשעיה blastospore שישמש להדביק עכברים. הערה: בצע את כל שלבי סביבה נקיה מחיידקים. </li></ol> 4. זיהום עכברים (3-5 ימים לאחר העברת Cell) הערה: הליך הזיהום הבסיסי מבוצע כפי שתואר לעיל 19,23-25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את סמרטוט-1 - / - העכברים שקיבלו PBS או תאי שלושה ימים קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המינון של חומרי הרדמה באמצעות משקל גופם. להרדים את העכברים על ידי מתן קטמין / תערובת xylazine (16.1 מ&quot;ג / מיליליטר ו -1.6 מ&quot;ג / מיליליטר), באמצעות 25 מחטים G על 1 מיליליטר מזרקים טוברקולין, על ידי מילת קריאההזרקת aperitoneal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל 50 μl לכל 10 גרם של משקל גוף. (כלומר, 0.8 מ&quot;ג של קטמין ו0.08 מ&quot;ג של xylazine / 10 גרם של משקל גוף או 80 מ&quot;ג של קטמין ו -8 מ&quot;ג xylazine לכל קילוגרם של משקל גוף בהתאמה). שים לב לתגובת קמצוץ הבוהן כל 15 דקות לאחר הרדמה. הערה: מינון זה יגרום 60-90 דקות של הרדמה, וזה מספיק להליך הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל המשחה הסיכה עיניים בעיניים של העכברים כדי למנוע את הקרניות מהתייבשות. כחומר הסיכה העין עלולה להתייבש, לחזור על שימון עיניים כל 45 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1 מיליליטר של תמיסת מלח (0.9% NaCl) תת עורי בגב הצמוד לforelimb, כדי לסייע להחזרת נוזלים של העכברים במהלך הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג כלוב חדש, נקי. בצע את עכבר הליך אחד זיהום בזמן, הצבת כל עכבר לכלוב החדש הנגוע פעם. בצע את PBS / זיהום הדמה ראשון, ולאחר מכן להמשיך לGro זיהום קנדידהעליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את העכבר הרדים ולפתוח את הפה הרחב כדי לחשוף את בסיס הלשון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כותנה קוטר כדור 3 מ&quot;מ רווי עם 50 μl של PBS או blastospore השעיה, sublingually בחלל הפה למשך 90 דקות. הפוך את העכברים כל חזית 15 דקות וחזרתי למניעת גודש ריאה, על מנת להבטיח שכדורי צמר גפן לא זזו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת טיימר לכל עכבר כדי להבטיח 90 דקות של חיסון שאם או קנדידה בחלל הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור אותם בכלוב תחת מנורת החום (4 מטרים), וכל עכבר על כריות ג&#39;ל חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי הלשון תבוטל בתוך ומחוץ לשיניים, כדי למנוע את השיניים ופצעו את הלשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום 90 דקות, להסיר את כדור צמר גפן מפיו של העכבר. Watch עבור כל עכבר שעשוי להתאושש מהרדמה מוקדם מ -75 דקות. במקרה כזה, להרדים אותם שוב עם קטמין (40 מ&quot;ג / קילוגרם) בלבד. </li></ol> 5. ההודעה Procedurדואר ניטור (בהרדמת 90 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברפידות ג&#39;ל החום במהלך ההרדמה 90 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ולמנוע חנק, אל תאפשר עכברים להתאושש על מצעי עכבר התירס של הרגילים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתאוששות מהרדמה, לנהל 1 מיליליטר נוסף של 0.9% מתחת לעור NaCl סטרילי בשני מקומות על הגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור עד חמש PBS (דמה) עכברים מחוסן בכל כלוב. בית עכברים נגועים רק 1-2 בכל כלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את כרטיס ההליך בראשי תיבות בכל יום לאחר ההליך כדי לרשום את השינויים במשקל הגוף, טיפוח הרגלים ועל בריאות כללית. </li></ol> 6. הערכת הדלקת משקל 6.1) הפסד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את העכברים בכל יום במהלך הזיהום, החל מהיום לפני הליך זיהום. הערה: בדרך כלל, עכברי immunodeficient הוזרקו תאי TH17 וללא את תקנות T להיכנע עד 2030% ירידה במשקל עקב העלייה פטרייתי נטל 19 והחריפה את דלקת. </li></ol> 6.2) ניקוד היסטולוגיה של הלשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברים על ידי CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הלסתות ולנתח את הלשון עם מספריים ומלקחיים. שימוש במלקחיים בוטים להחזיק את הלשון, ובאמצעות המספריים להגיע לחלק האחורי של הפה כדי לחתוך את הקצה האחורי של הלשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לhematoxylin immunocytochemical וeosin מכתים (H &amp; E) של רקמות הלשון, לשטוף את רקמות לשון עם קרח הקר PBS. הוסף 5 מיליליטר של פורמלין 10% במשך 2-3 לשונות ולתקן אותם O / N ב 15 מיליליטר צינורות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר את פורמלין ולטבול את הרקמות ב 5 מיליליטר של אתנול 70% כדי למנוע היפר-קיבעון. שלח אותם לשירות מסחרי להמשיך עם הטבעת פרפין, חתך וצביעת חלקי פרפין. הערה: שירות היסטולוגיה מסחרי משמשת כדי לבצע שלבים אלה. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע השקופיות חזרו משירות היסטולוגיה המסחרי, הכיתה הדלקת על ידי התבוננות בסעיפי הרקמות תחת מיקרוסקופ אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון 0-5, עם 0 להיות לא דלקת, ו -5 להיות הדלקת החמורה ביותר. ציון הדלקת באמצעות טבלה 1. </li></ol></li></ol> 6.3) ייצור ציטוקינים על ידי תאי TH17 הערה: ייצור TNF-α מופרז היא אחד מהקריאות לimmunopathology מוגזם. כאשר עכברים מועברים adoptively עם תאי TH17 רק, זה גורם immunopathology המשויך לייצור TNF-α מוגזם בתאי TH17. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף השעיה תא בודדת מטחול, בלוטות לימפה בצוואר הרחם, lymphnodes בבית השחי, ולשון, תוך שימוש בשיטות שתוארו קודם לכן 19.26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Restimulate התאים עם אצטט myristate phorbol (PMA) (50 ng / ml) וionomycin (500 ng / ml) במשך שעה 4 עם Brefeldin (10 מיקרוגרם / מיליליטר) הוסיף בlAST שעה 2. לשטוף את התאים עם PBS ולתקן אותם באמצעות ערכת הקיבוע / permeabilization מסחרית בהתאם להוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים ציטוקינים סלולריים תוך שימוש באנטי TNF-α fluorochrome מצומדות, אנטי-IL-17 א ונוגדני ROR-γt כפי שתואר לעיל 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, resuspend תאי חיץ permeabilization 1X עם הקוקטייל של אנטי TNF-α, אנטי-IL-17 א ונוגדני ROR-γt, כל נוגדן ל 2 - 3 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם חיץ permeabilization 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 500 μl של PBS עם 0.5% אלבומין בסרום שור לניתוח cytometry זרימה. </li></ol>

<ol><li>Allam, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23-producing+CD68%28%2B%29+macrophage-like+cells+predominate+within+an+IL-17-polarized+infiltrate+in+chronic+periodontitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Periodontology%22%5BJournal%5D)">IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions.</a> Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).</li>
<li>Loesche, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%3A+link+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Compendium+Of+Continuing+Education+In+Dentistry%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease: link to cardiovascular disease.</a> Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).</li>
<li>Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+periodontal+disease+and+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Association between periodontal disease and stroke.</a> Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).</li>
<li>Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucocutaneous+candidiasis%3A+the+IL-17+pathway+and+implications+for+targeted+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy.</a> Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217(2012).</li>
<li>Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperplastic+candidosis%2Fcandidiasis+%28candidal+leukoplakia%29.+Critical+Reviews+In%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Biology+And+Medicine+%3A+An+Official+Publication+Of+The+American+Association+Of+Oral+Biologists%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In.</a> Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).</li>
<li>Canabarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+subgingival+colonization+of+Candida+albicans+and+other+yeasts+with+severity+of+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis.</a> Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).</li>
<li>Urzua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+diversity+in+the+oral+microbiota+of+subjects+with+periodontitis%3A+Candida+albicans+and+Candida+dubliniensis+colonize+the+periodontal+pockets%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets.</a> Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).</li>
<li>Ergun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+status+and+Candida+colonization+in+patients+with+Sjogren%27s+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+Oral%2C+Patologia+Oral+Y+Cirugia+Bucal%22%5BJournal%5D)">Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome.</a> Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).</li>
<li>Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+candidiasis+in+Sjogren%27s+syndrome%3A+prevalence%2C+clinical+correlations%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surgery%2C+Oral+Medicine%2C+And+Oral+Pathology%22%5BJournal%5D)">Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).</li>
<li>Gall, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+spp.+in+oral+cancer+and+oral+precancerous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions.</a> The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).</li>
<li>Grady, J. F., Reade, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+as+a+promoter+of+oral+mucosal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia.</a> Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).</li>
<li>Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunocompetent+murine+model+for+Candida+albicans-promoted+oral+epithelial+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia.</a> Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).</li>
<li>Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Candida+albicans+and+the+mammalian+innate+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense.</a> Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).</li>
<li>Marodi, L., Johnston, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+Candida+species+disease+in+infants+and+children%3A+occurrence%2C+risk+factors%2C+management%2C+and+innate+host+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms.</a> Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).</li>
<li>Kumamoto, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+gastrointestinal+Candida+colonization.+Current+Opinion+In%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In.</a> Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).</li>
<li>Kraneveld, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relation+between+oral+Candida+load+and+bacterial+microbiome+profiles+in+Dutch+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults.</a> PloS One. 7 (8), e42770(2012).</li>
<li>Hernandez-Santos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cells+confer+long-term+adaptive+immunity+to+oral+mucosal+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).</li>
<li>Hasina, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABT-510+is+an+effective+chemopreventive+agent+in+the+mouse+4-nitroquinoline+1-oxide+model+of+oral+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research%22%5BJournal%5D)">ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis.</a> Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).</li>
<li>Pandiyan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+promote+Th17+cells+in+vitro+and+enhance+host+resistance+in+mouse+Candida+albicans+Th17+cell+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model.</a> Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).</li>
<li>Pandiyan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IL-15+in+activating+STAT5+and+fine-tuning+IL-17A+production+in+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes.</a> J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).</li>
<li>Pandiyan, P., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival.</a> Biology Direct. 3 (6), (2008).</li>
<li>Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+induce+cytokine+deprivation-mediated+apoptosis+of+effector+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells.</a> Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).</li>
<li>Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+In+Immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models for candidiasis.</a> Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).</li>
<li>Conti, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cells+and+IL-17+receptor+signaling+are+essential+for+mucosal+host+defense+against+oral+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis.</a> J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).</li>
<li>Kamai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+model+of+oropharyngeal+candidiasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+And+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">New model of oropharyngeal candidiasis in mice.</a> Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).</li>
<li>Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+T+cells+from+mouse+oral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Isolation of T cells from mouse oral tissues.</a> Biological Procedures Online. 16 (1), 4(2014).</li>
<li>Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+IL-17-secreting+innate+lymphoid+cells+are+essential+for+host+defense+against+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection.</a> J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).</li>
<li>Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+functions+of+TNF-alpha+in+the+regulation+of+the+intestinal+epithelial+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation.</a> International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).</li>
<li>Bishu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+CARD9+is+required+for+adaptive+but+not+innate+immunity+to+oral+mucosal+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections.</a> Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).</li>
<li>Quintin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+NK+cells+against+Candida+albicans+infection+in+immunocompetent+or+immunocompromised+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice.</a> Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).</li>
<li>Ramirez-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+cancer%3A+Can+this+yeast+induce+cancer+development+or+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression.</a> Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מודל זה מבוסס על גרימת ג האוראלי זיהום אלביקנס דלקת TH17 תלויה. בגלל העדר את תקנות T, דלקת תא TH17 המושרית היא חסרת מעצורים ומובילה לimmunopathology גרוע נפתר. במבחנה נגזרת תאי CD4 נאיביים מקוטבים כמו תאי TH17 שמשו להעברת המאמצת. 40 - 50% מCD4 + תאים בתרבית להראות ביטוי לגילוי IL-17 א סביב יום 3 (תאי TH17), ולכן שמשו להזרקה בעכברים. היתרון העיקרי של המודל הוא שתאי TH17 לגרום immunopathology ספציפי זיהום שיכול להשתפר ביעילות עם הזרקת reg</...

זיהומים ודלקות בפה נקשרו לסרטן ולמחלות לב וכלי דם, ויש להם השפעה דרמטית על בריאות האדם הכללית2,3. זיהומים אופורטוניסטיים ודלקת הנגרמים על ידי C. albicans קשורים לחסרים חיסוניים ראשוניים (PID)4,5, הפרעות דלקתיות כגון דלקת חניכיים 6,7, תסמונת סיוגרן ומחלת בלוטות הרוק8,9, כמו גם קרצינומה של תאי קשקש בפה 10-12. C. albicans היא פטרייה קומנסלית דימורפית המיישבת את פיהם של 60% מבני האדם הבריאים ללא תסמינים, אך היא הפתוגן הפטרייתי הנפוץ ביותר הגורם לזיהומים כאשר ההגנה של המארח נחלשת13-15. הוא גורם לזיהומים חוזרים וכרוניים ודלקות בחולים עם איידס ו-PID, וגם אצל אנשים מדוכאי חיסון אחרים. כקומנסל, עומס הקולוניזציה שלו קשור לשינוי במגוון המיקרוביום האוראלי הכולל16. כפתוגן הוא גורם למספר צורות של קנדידה אורו-לוע כגון פסאודומברני חריף, אטרופי חריף, אטרופי כרוני, היפרטרופי כרוני/היפרפלסטי ודלקת זוויתית. 
הגנה מפני C. albicans נקבעת לא רק על ידי עמידות חיסונית של המארח, אלא גם על ידי היכולת לשלוט כראוי באימונופתולוגיה הנגרמת על ידי קנדידה. למרות שקומנסלים כגון C. albicans תורמים לאפנון והחמרה של מצבים דלקתיים אחרים בפה, המנגנונים שבאמצעותם מתרחשת דיסביוזה במהלך זיהומים אופורטוניסטיים אינם ברורים. מלבד התפקיד הידוע של תאי Th17 אדפטיביים בתגובת הזיכרון ל-C. albicans17, תפקידם בהתחלה והנצחה של פתולוגיה דלקתית במהלך זיהומים כרוניים נותר לא ברור. יתר על כן, מחלות דלקתיות בפה כגון תסמונת סיוגרן ודלקת חניכיים קשורות לפתולוגיה מתווכת Th17. מעניין שמחלות אלה קשורות מאוד גם ל-OPC תכוף. עם זאת, האינטראקציות בין תאי Th17, אימונופתולוגיה אוראלית של OPC ומחלות דלקתיות אחרות בפה אינן נחקרות. 
למרות שקיימים מודלים עכבריים של זיהום ראשוני ומשני של קנדידה דרך הפה, מודל עכבר לחקר זיהום קנדידה הקשור לדלקת Th17, במיוחד בהקשר של כשל חיסוני אינו זמין. מחקר זה מציג שיטה לביסוס דלקת Th17 דרך הפה הקשורה לזיהום קנדידה דרך הפה בעכברים. זיהום קנדידה בעכברים מאופיין בנגעים פטרייתיים, דלקת בלשון, ירידה בצריכת מזון, ירידה במשקל ובסופו של דבר מצב גוסס. פתולוגיה אוראלית דומה לנגעים כרוניים של זיהום קנדידלי, כמו גם דיספלזיה אפיתל במודלים של סרטן הפה בעכברים12,18.

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td><td>אוניברסיטת פיטסבורג (שרה גפן)</td><td>-</td><td>תרבית קנדידה</td></tr><tr><td>U-bottom 96 צלחות באר&nbsp;</td><td>פישר</td><td>055588</td><td>משמש לתרבית תאים</td></tr><tr><td>a-CD3&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>קיטוב תאים לתנאי Th17</td></tr><tr><td>a-CD28&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>קיטוב תאים לתנאי Th17</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>קיטוב תאים לתנאי Th17</td></tr><tr><td>h-TGF-b&nbsp;</td><td>מו"פ D</td><td>240-B</td><td>קיטוב של תאים לתנאי Th17</td></tr><tr><td>a-IFN-g&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>קיטוב תאים לתנאי Th17</td></tr><tr><td>a-IL-4&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>קיטוב תאים לתנאי Th17</td></tr>&<tr><td>alpha;-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>משמש לתרבית תאים - 1:50</td></tr><tr><td>&alpha;-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>משמש לתרבית תאים - 1:100</td></tr><tr><td>&alpha;-RORgt PE&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td><td>משמש לתרבית תאים - 1:50</td></tr><tr><td>YNB ללא חומצות אמינו)/פפטון/דקסטרוז מדיום ציר&nbsp;</td><td>ביו בייסיק</td><td>S507. SIZE</td><td>מדייום לגידול קנדידה</td></tr><tr><td>חממת שייקר&nbsp;</td><td>ניו ברונסוויק Scientific</td><td>Innova 4300</td><td>גידול דגירה לקנדידה</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות</td><td>Bio Basic</td><td>BT888-SY</td><td>משמש לתרבית תאים וגידול קנדידה</td></tr><tr><td>צינורות 50 מ"ל</td><td>Bio Basic</td><td>CT 788-YS</td><td>משמש לתרבית תאים וגידול קנדידה</td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>VWR International LLC</td><td>82017-654</td><td>לכדורי קנדידה -900 גרם</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td> <td>אלגרהתרבית תאים 392302 בקמן קולטר</td><td></td><td>- 480 גרם</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל שפופרות אפנדורף</td><td>ביו בייסיק</td><td>BT620-NS</td><td>הכנת ריכוז סופי של קנדידה</td></tr><tr><td>2x פרפורמלדהיד</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי</td><td>15710</td><td>קיבוע קנדידה לספירת</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>PBS - פוספט מאגר מלח</td><td>ביו בייסיק</td><td>PD8117</td><td>הכנת בופרי</td></tr><tr><td>קטמין/קסילזין&nbsp;</td><td>אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב - מרכז משאבי בעלי חיים</td> <td>-</td> <td>מתקבל מפרוטוקול מאושר על ידי ARC להרדמה</td></tr><tr><td>משחת סיכה עיניים &nbsp;</td><td>משחת Allergan-Eye</td><td></td> <td>לבעלי חיים למניעת יובש</td></tr><tr><td>תמיסת מלח (0.9% NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td><td>ניתנת לבעלי חיים למניעת התייבשות</td></tr><tr><td>כדור צמר גפן בקוטר 3 מ"מ&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BP7603</td><td>כדורי 3 מ"מ לזיהום בקנדידה</td></tr><tr><td>רפידות ג'ל חום</td><td>אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב - מרכז משאבי בעלי חיים</td> <td>-</td> <td>לשמירה על טמפרטורת הגוף והחלמה מהירה</td></tr><tr><td>המטוקסילין ואיוזין צביעת</td><td>Histoserv - MD</td><td></td> - <td>היסטולוגיה של רקמות</td></tr><tr><td>10% פורמלין&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>JC1111/MC</td><td>היסטולוגיה של רקמות</td></tr><tr><td>70% אתנול&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490</td><td>מטרת עיקור</td></tr><tr><td>PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>גירוי מחדש של תאים</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Life Technologies</td><td>124222 1mg</td><td>Restimulation of Cells</td></tr><tr><td>ערכת חדירות קיבוע</td><td>eBiosciences</td><td>E16913-106</td><td>קיבוע תאים</td></tr><tr><td>למזרקי טוברקולין</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>הזרקת עכברים</td></tr><tr><td>25 גרם x 3/8 מחטים</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>הזרקת עכברים</td></tr><tr><td>Rag1 -/- עכברי</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>מס' מלאי: 002216</td><td>עכברים מושתלים</td></tr><tr><td>CD45.1 עכברים קונגניים</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>מס' מלאי:002014&nbsp;</td><td>תאי Th17 תורמים</td></tr><tr><td>עכברי CB17-SCID</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>מס' מלאי: 001303</td><td>עכברי נמען</td></tr><tr><td>עכברי Balb/c</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>מס' מלאי: 000651</td><td>תאי תורם Th17</td></tr></tbody></table>

th17 דגם דלקת של לוע תחתון פטרת בעכברים immunodeficient

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

מחלת קנדידה אורו-לוע (OPC) נגרמת לא רק בשל היעדר עמידות חיסונית למארח, אלא גם בהיעדר רגולציה מתאימה של אימונופתולוגיה הנגרמת על ידי זיהום. למרות שתאי Th17 מעורבים בהגנה אנטי-פטרייתית, תפקידם באימונופתולוגיה אינו ברור. מחקר זה מציג שיטה לביסוס אימונופתולוגיה של Th17 דרך הפה הקשורה לזיהום קנדידלי דרך הפה בעכברים חסרי חיסון. השיטה מבוססת על בנייה מחדש של עכברים לימפופנים עם תאי Th17 בתרבית מבחנה, ולאחר מכן זיהום אוראלי בקנדידה אלביקנס (C. albicans). התוצאות מראות שתאי Th17 לא מרוסנים גורמים לדלקת ופתולוגיה, וקשורים למספר קריאות מדידות כולל ירידה במשקל, ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים, היסטופתולוגיה של הלשון ותמותה, מה שמראה שמודל זה עשוי להיות בעל ערך בחקר אימונופתולוגיה של OPC. העברה מאמצת של תאים רגולטוריים (Tregs) שולטת ומפחיתה את התגובה הדלקתית, מה שמראה שניתן להשתמש במודל זה כדי לבחון אסטרטגיות חדשות לנטרול דלקת בפה. מודל זה עשוי להיות ישים גם בחקר אימונופתולוגיה של Th17 דרך הפה באופן כללי בהקשר של מחלות פה אחרות.

במודל זה, שני עכברי קנדידה -infected ועכברים נגוע בסמרטוט-1 - / - רקע immunodeficient הועבר adoptively עם תאי TH17 3-5 ימים לפני הזיהום. בסך הכל 10-12 עכברים שימש לניסויים, עם 2 עכברים בכל קבוצות שאם נגוע, ו4-5 בכל אחת מהקבוצות נגועות קנדידה. תאים נאיביים נגזרו מעכברי Thy1.1 או CD45.1 congenic, כך שתאי TH17 הזריקו אותרו in vivo באמצעות Thy1.1 או CD45.1 צביעת בהתאמה (איור 1 א). את תקנות T-הועבר Co נגזרו מעכברי CD45.2...

למרות שמודלים של זיהום קנדידה זמינים לחקר עמידות חיסונית של מארחים, מודל לחקר אימונופתולוגיה מתווכת של תאי T בהקשר של זיהום קנדידה נעדר. כאן אנו מתארים שיטה לביסוס אימונופתולוגיה של Th17 הקשורה לזיהום קנדידה דרך הפה בעכברים חסרי חיסון.

TH17 דגם דלקת של לוע תחתון פטרת בעכברים immunodeficient

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח מודל של דלקת פה תלוית-זיהום המתווכת על ידי תאי TH17 פתולוגיים. הדבר מושג תחילה על ידי הזרקת תאי TH17 לעכברים עם חסר חיסוני. השלב הבא הוא גידול הפטרייה *Candida albicans*, איסוף הבלסטוספורות (blastospores) והכנתן ב-PBS.השלב הסופי הוא הזרקה פומית של נגעי blasto לעכברים כדי להניע את השגשוג של תאי th 17 המוזרקים ולהשריות דלקת פומית. התוצאות מראות כי עכברים שהוזרקו TH 17 סובלים מירידה במשקל ומדלקת בלשון, בהתבסס על ניתוחי flow cytometry ו-immunohistochemistry של הלשון. לפיכך, השלכות טכניקה זו משתרעות לכיוון של אימונותרפיה פומית באמצעות מודל עכברים זה.ניתן להשתמש במודל דלקת TH17 גם כדי לחקור דלקת TH17 בהקשר של מחלות חלל פה אחרות. הפרוצדורה תודגם על ידי עמית פוסט-דוקטורט במעבדתי. פרוצדורה זו דורשת תאי T נאיביים ממוינים, ובאופן אופציונלי תאי treg, כדי להקים תרבית תאי TH17. יש לזרע תאי T נאיביים CD4 positive, CD44 low, CD62L high, CD25 negative בלוחיות UBO 96-well, בריכוז של 30,000 תאים לבאר, בתנאי TH17 למשך שלושה עד ארבעה ימים. כביקורת, ניתן לתרבת תאי T נאיביים יחד עם 30,000 תאי treg מסוג CD4 positive, CD25 positive, FOX P3 positive באותם תנאי תרבית כדי להפיק תאי TH17. לאחר ארבעה ימי תרבית, יש לאסוף את תאי ה-TH17 באמצעות פיפטה.הפרידו מנה קטנה (aliquot) כדי לבחון את חיוניות התאים. השעו תאים אלו בחצי מיליליטר של RPMI והוסיפו להם 100 nanograms של propidium iodide. לצורך אנליזת fax, קוצרו את עיקר התאים והכינו אותם להזרקת תאים.יש לשטוף את עיקר התאים ב-PBS, לסובב אותם בצנטריפוגה ולאחר מכן להכינם להזרקה לעכברים. הזרק לעכברים 100 µL של תרחיף התאים בריכוז של 10 מיליון תאים למילילטר ב-PBS קר, באופן תוך-פערי (intraperitoneal), באמצעות מחט במידה 25 gauge. לעכברים אחרים יש להזריק PBS או תאי בקרה של TH 17 treg שגודלו בתרבית משותפת (co-cultured). תכנן להדביק את העכברים ב-C. albicans בתוך שלושה עד חמישה ימים, יום לפני.להדבקת העכברים ב-C albicans, פזרו חמש מושבות של זן המעבדה CAF two dash one ב-100 µL של PBS סטרילי והוסיפו את התרחף ל-20 mL של ציר סטרילי. השאירו את המצע המוחדר לצמוח למשך לילה ב-30 °C עם ערבול של 130 RPM. למחרת, אספו 10 mL מהתרבית לשפופרת של 15 mL, ולאחר מכן סבבו את הנוזל בצנטריפוגה ב-1900 G למשך חמש דקות.בטמפרטורת החדר, המשקע מכיל את הבלסטוספורות ויש להשליך את הנוזל שמעליו. רכזו את כל הבלסטוספורות שנאספו לתוך 10 milliliters של PBS סטרילי והעבירו 20 microliter של Eloqua לשפרועת מיקרו-צנטריפוגה. הוסיפו 20 microliters של two XPFA ל-Eloqua, ולאחר 15 עד 20 דקות של קיבוע, ספרו את הבלסטוספורות באמצעות המוציטומטר במהלך זמן הקיבוע.שטפו את מרבית הבלסטוספורות ב-PBS לפחות פעמיים נוספות. אחסנו את משקעי הבלסטוספורות במכסה בטיחות ביולוגית (BSL-1) בטמפרטורת החדר עד להגעה לתוצאות הספירה. לאחר מכן, השעו שוב את הבלסטוספורות ב-PBS בטמפרטורת החדר בריכוז של 200 מיליון תאים למילליטר.שמרו את התאים מוכנים להדבקת העכברים. שיטה זו נסקרה בעבר, אך היא תיבחן שוב בקצרה בסעיף זה. ראשית, הרדימו את העכברים, ודאו שהם במצב של הרדמה והנחילו משחה עינית.יש לחזור על היישום לאחר 45 דקות. לאחר מכן, יש לבצע הזרקה תת-עורית. יש להזריק מיליליטר אחד של סליין להידרציה, תוך טיפול בעכבר אחד בכל פעם.ראשית הדביקו את קבוצת השם (sham) ולאחר מכן את קבוצת הקנדידה. הכינו פתיר כותנה בקוטר של 3 מילימטרים על ידי השרייתו ב-50 µL של PBS או של תרחיף נבגי blasto. לאחר מכן, גשו לבסיס הלשון והניחו שם את פתיר הכותנה.ודאו שהלשון נסוגה פנימה והיא רחוקה מהשיניים כדי שלא תיקרע. לאחר מכן, העבירו את העכבר לכלוב התאוששות נפרד על משטח חימום. אין להשתמש במצע קוביצות תירס בכלוב, שכן במקרה כזה משטח החימום לא יעביר חום מספיק. מקמו מנורת חימום בגובה של ארבע רגליים מעל מיקום כלוב ההתאוששות.על כדור הצמר להישאר במקומו למשך 90 דקות. לכל עכבר צריך להיות טיימר ספירה לאחור נפרד של 90 דקות. במהלך זמן זה, יש להפוך כל עכבר מצד לצד מדי 15 דקות כדי למנוע גודש ריאתי.לפיכך, השלב הקריטי ביותר בכל הפרוצדורה הוא לוודא שכדור הצמר נשאר במקומו לאורך כל זמן ההחדרה. אם עכבר מתחיל להתעורר מההרדמה בטרם עת, יש להרדימו שוב תוך שימוש ב-ketamine בלבד. לאחר 90 דקות, הסירו את כדור הצמר ועקבו אחר התאוששות בעל החיים.לאחר ההתאוששות, יש להחדיר מיליליטר נוסף של תמיסת סליין בשני מיקומים על הגב למשם הידרציה נוספת. לאחר הפרוצדורה, ניתן להעביר עד חמישה עכברים שקיבלו הזרקה דמה (sham) לאותו כלוב, תוך שימוש בתאי T נאיביים שהופקו מעכברי thigh 1.1 או CD 45.1. הפרוצדורה המתוארת בוצעה, ותאי ה-T שהוחדרו עוקבו באמצעות הסמנים המתאימים להם.Tregs שהועברו במקביל הופקו מעכברים מסוג CD 45.2 ונמעכבו על פי סמן זה בלבד. העכברים שהודבקו בקנדידה הראו גיוס והתרחבות של תאי TH 17 המוזרקים. לאחר ההדבקה, נמדוד ירידה במשקל.העכברים שהוזרקו עם תאי TH 17 בלבד איבדו משקל באופן פרוגרסיבי וחלקם נאלצו לעבור הריגה הומנית. לעומת זאת, הירידה במשקל בקבוצות האחרות פסקה בסופו של דבר. עכברים שהוזרקו עם תרבית משולבת של Tregs הראו מספר רב יותר של תאים המייצרים TNF alpha ארבעה ימים לאחר ההדבקה.נוכחות ממושכת של תאים המייצרים TNF Alpha מעידה על כך שבעכברים שהוזרקו תאי TH 17 בלבד היו זיהומים ודלקות שלא חלפו. לשונות של העכברים שהוזרקו Tregs הראו גם הרבה פחות תסננויות דלקתיות ופחות צמיחה פטרייתית. באותה נקודת זמן, נוכחות ממושכת של תסננויות דלקתיות מעידה על כך שבעכברים שהוזרקו תאי TH 17 בלבד היו זיהומים ודלקות שלא חלפו. ברגע שתהליך זה יישלט, ניתן לבצע טכניקת זיהום זו בשלוש שעות עבור ארבעה עכברים, בתוספת של 15 דקות נוספות עבור כל עכבר שיוחדר לזיהום.

th17-inflammation-model-oropharyngeal-candidiasis-immunodeficient

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מפתח טכניקות כדי לשמש...

הפרוטוקולים עבור הרכבת חיסון וגינלי אוסף דוגמאות במודל ניסיוני של עכבר קנדידה דלקת הנרתיק

עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

Mellonella גלריה (galleria) משמש מודל הגעה עבור המופץ קנדידה. כאן, אנחנו מפרטים את הזיהום פרוטוקול ולספק נתונים התומכים לאפקטיביות של הדגם.

לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה ויעילה להזרקות ורידים בזנב מכרסם באמצעות מכשיר התחממות /הרחקה שתוכנן באופן ייחודי. על ידי ייעול ייזום תהליכי ויתור וריסון, פרוטוקול זה מאפשר זריקות מדויקות ותוך ורידי בזמן של קבוצות גדולות של בעלי חיים עם מצוקה מינימלית.

מכשיר התחממות/ריסון עכשווי להזרקות יעילות של וריד זנב במודל אלח דם פטרייתי מורין

זיהום מפרק פריפרוסתטי (PJI) הנגרם על ידי פתוגנים מסוכנים נפוץ באורתופדיה קלינית. מודלים קיימים של בעלי חיים אינם יכולים לדמות במדויק את המצב האמיתי של PJI. כאן, הקמנו מודל עכבר PJI הקשור לביופילם קנדידה אלביקנס כדי לחקור ולפתח טיפולים חדשים עבור PJI.

מודל זיהום במפרק פריפרוסתי קנדידה אלביקנס בעכבר

אנו מבססים מודל עכברי של זיהום הקשור לצנתר C.albicans (CRI), שבו נוצר ביופילם על הצנתר, והאינטראקציה בין C.albicans למארח מתואמת היטב עם CRI הקליני. מודל זה מסייע לסנן טיפולים עבור CRI הקשור לביופילם של C.albicans , ומניח בסיס לשינוי קליני.

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

פרוטוקול זה מתאר את היישום של טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) במודל מורין של קנדידה אוראלית. aPDT בוצע באמצעות תערובת מסיסה במים של כורכומינואידים ואור LED כחול.

טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי בתיווך כורכומינואיד על מודל מורין של קנדידאזיס פומי

פרוטוקול זה מתאר את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתאי Th17 פתוגניים במבחנה. באופן ספציפי, בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים, ניתן לקבל 90% טוהר של תאי Th17 פתוגניים מתאי T נאיביים CD4+ באמצעות שיטת התמיינות זו.

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4+ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היישום של מודלים של רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה. באופן ספציפי, מערכת המודל המתוארת משתמשת באפיתל אוראלי רב שכבתי החשוף למיקרואורגניזמים הקשורים לביופילמים (רובד שיניים) בהקשר של בריאות הפה לעומת מחלות.

מערכות מודל רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה

למדו ליצור דגם של דלקת פה תלויה זיהום המתווה על ידי תאי Th17 פתולוגיים בעכברים immunodeficient. השיטה משתמשת בזריקת תאי Th17 וזיהום Candida albicans לחקירת אימונופתולוגיה של תאי T.

TH17 דגם דלקת של לוע תחתון פטרת בעכברים immunodeficient

גלה סרטונים נוספים