אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified
8 באפריל 2015
מוצגת אסטרטגיה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקטעי רקמה מביאה לתמונות דו-ממדיות, המנותחות אוטומטית. ניתוחי לוקליזציה משותפת של סוגי תאים שונים מושווים לנתונים מתמונות מדומות, ונותנים מידע כמותי על אינטראקציות תאיות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת את הקשרים בין תתי-אוכלוסיות ספציפיות של תאים במח העצם. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף חתכים היסטולוגיים בהקפאה (cryo sections) מגידולי עצם הירך של עכברים. בשלב השני, החתכים נצבעים לצורך אנליזה של אימונופלואורסצנציה ותמונות קונפוקאליות נרכשות.
לאחר מכן, התמונות מנותחות באופן דיגיטלי. בשלב הסופי, ניתן לסמלץ את מיקומי סוגי התאים השונים כדי לחשב את קצב ותדירות המגע בין התאים האימונולוגיים הספציפיים הנבדקים לבין הסביבה המיקרוסקופית שלהם. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר ניתחנו נישות במיקרו-סביבה של תאי פלזמה ארוכי חיים במח עצם, והזדקקנו לשיטה לכמת באופן חד-משמעי את הקשרים התאיים בתוך רקמת מח העצם.
RA Maya תדגים עבורכם את הפרוצדורה לשבוב קריוגני (cryo suction) של עצמות הירך מעכבר בוגר. ראשית, הגדירו את טמפרטורת הדגימה והלהב של מיקרוטום סטנדרטי המצויד בלהב לרקמות קשות ל-24- מעלות צלזיוס. לאחר הסתגלות של 15 דקות.
קבעו בלוק דגימה למחזיק הדגימות המתכתי באמצעות מדיום להטמעה בקירור (cryo embedding medium) וכוונו את כיוונו של הבלוק לפי הצורך. גזרו את הדגימה עד שהעצם נחשפת לחלוטין ומח העצם נראה. לאחר מכן, כוונו את עובי החיתוך לשבעה מיקרונים.
בשלב הבא, הדביקו פיסת סרט דבק Kawamoto כאשר הצד הדביק פונה כלפי מעלה על גבי בלוק דגימה באמצעות שפכטל עץ מצופה עור. בצעו חיתוך של הדגימה והשתמשו בפינצטה כדי להפוך את הסרט כך שהחתך יהיה ממוקם בצד העליון. לאחר מכן, העבירו את הסרט לזכוכית של תבנית מיקרוסקופ.
במידה וכל השבבים נאספו, הצמידו את הסרט לפסית הזכוכית באמצעות סרט דביק. הניחו לדגימות להתייבש במשך 30 דקות לפחות ושמרו את הפסיתים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. צבעו את שבבי הקריו שהופשרו באמצעות דימות של הדגימות בהתאם לפרוטוקולי אימונופלואורסצנציה נפוצים.
יש לוודא שכלול צביעה גרעינית לצורך ויזואליזציה של שלמות הרקמה. לאחר צביעת החתכים, הוסיפו טיפה אחת של מדיום קיבוע לכל דגימה, ולאחר מכן הניחו זכוכית כיסוי מספר 1, עבור מיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקה בלייזר. בחרו בעדשה עם הגדלה של 20x והגדירו שדה ראייה של 708.15 על 708.15 microns.
לאחר מכן, דמיינו את הדגימות אחת אחת ברזולוציה של 2048 על 2048 פיקסלים לתמונה כדי לשמור על תוצאות ניתנות להשוואה. הקליטו את התמונות בערוץ אחד להדמיית מבני הסטרומה, בערוץ אחד עבור הגרעינים ובערוצים נוספים עבור תאי ההמטופואזה הרלוונטיים לפי הצורך. הקליטו את התמונות תוך שימוש בממוצע שורות (line averaging).
באופן אידיאלי, יש לצלם תמונות סמוכות בודדות כדי לכסות את כל חתך הפמור. לאחר מכן שמור את התמונות בפורמט קובץ של תמונות מיקרוסקופיה. לאחר מכן ייצא קובץ JPEG אחד לכל ערוץ עבור כל אזור שצולם, והשתמש בכלי לניתוח תמונות כדי לבצע כימות של סגמנטציית התמונה עבור קולוקליזציה וניתוח שכנות לפני ביצוע הסימולציות של התא האקראי.
מיקום על תמונות מח העצם שנותחו עבור כל תמונה שיועמדה לסימולציה. מקמו את הקבצים הבאים בתיקייה אחת: קבצי ה-CSV הבודדים שסופקו על ידי כלי מגע התאים, קבצי ה-JPEG המקוריים של ערוץ ה-DPI וקבצי ה-JPEG המקוריים של ערוץ הסטרומה, כדי לבצע סימולציות אצווה על סדרת תמונות מדגימה פמורלית אחת; העבירו בשלב זה את כל קבצי ה-JPEG המקוריים וקבצי ה-CSV הבודדים התואמים להם לתיקייה אחרת.
לאחר שכל הקבצים אותספו, הפעילו את כלי הסימולציה. לאחר מכן, סמנו את תיבת הבחירה auto load image data. כאשר אפשרות זו מסומנת, קבצי ה-CSV המתאימים לתמונות שנותחו ייפתחו באופן אוטומטי.
בשלב הבא, הזינו את התגית המשותפת לקבצי ה-CSV ואת מספר מערכי התמונות שיש להשתמש בהם לסימולציה במצב אצווה (batch mode). לאחר מכן, טענו את קובץ ה-JPEG שנוצר מערוץ ה-S stroma עם שם קובץ המסתיים בשלוש כדי להפיק את המסכה עבור ערוץ ה-DPI. סמנו את תיבת ה-apply mask והגדירו את הסף להמרת תמונת ה-DPI למסכה בינארית ל-10.
סמנו את תיבות ה-eight bit וה-dilate והגדירו את דרגת הדילציה (dilation) לחמישה פיקסלים. לאחר מכן, סמנו את תיבת ה-width erosion. כעת, הזינו את הערך הרצוי עבור רדיוס הסביבה (vicinity radius) המשמש לניתוח התמונות הסימולטיביות, וסמנו את תיבת ה-use OSU כדי להשתמש באלגוריתם OSU לזיהוי אוטומטי של מבני הסטרומה עבור תאי ההמטופואזה.
סומללו כצורות מעגליות. מדדו את התפלגות גודל התאים של סוגי התאים המנותחים באמצעות כל תוכנה לניתוח תמונות הכוללת פונקציות מתאימות לסגמנטציה של אובייקטים, וקבעו את ערך הסיגמא עבור כל הסוגים ההמטופויטיים על סמך מדידות אלה. ניתן לקבוע את סף גודל התא, שהוא הקוטר בפיקסלים המתאר את האובייקט הקטן ביותר שעדיין מזוהה כתא שלם על ידי הכלי לניתוח תמונות.
לאחר מכן, הזינו את ערך הסף לגודל התא (cell size cutoff) ואת ערך הסיגמא בפיקסלים עבור סימולציית התפלגות גודל התאים עבור התאים האדומים, הירוקים והכחולים. בשלב הבא, בלשונית cells and mask, סמנו את תיבת ה-delete כדי לאפשר לתוכנה לבחור מיקום חדש עבור תא במידה והוא חופף לפחות לפיקסל אחד בתוך אזור אסור (no-go area) של המסכה. תחת לשונית cell exclusion, סמנו גם את תיבת avoid cell overlap.
לאחר מכן, הזן את המרחק המינימלי המותר בין מרכזיהן של שני תאים בפיקסלים. אם החפיפה מוגדרת על ידי המרחק המינימלי ממרכז של תא אחד למרכז של תא אחר, הגדר את שטח החפיפה המקסימלי ל-100%. לאחר מכן, הגדר את כלי הסימולציה ל-1000 חזרות. לבסוף, סמן את תיבת הבחירה לשמירה אוטומטית (auto save sales) כדי לשמור את הקואורדינטות של האובייקטים המסומולצים עבור כל החזרות של כל תמונה במגבלה כקבצים בפורמט טקסט.
הזן גם תגית משותפת לקבצים השמורים. לבסוף, לחץ על run simulation וקבע את תדרי המגע (contact) והסמיכות (vicinity) הממוצעים של קבוצותי 1000 התמונות הסימולטיביות המתאימות לכל תמונה שהוקלטה. לשם כך, חלק את ספירות המגע והסמיכות הממוצעות במספר התאים שהוקלטו לכל תמונה, והשווה את התדרים לתוצאות ניתוח הקולוקליזציה האוטומטי של התמונה שהוקלטה.
באיור זה מוצג ניתוח לוקליזציה שלאוזינופילים, תאי פלזמה ותאי B עם המיקרו-סביבה של תאי הסטרומה במוח עצם כימרי פלואורסצנטי. קבצי ה-CSV שהופקו באמצעות כלי מגע התאים והסמיכות (cell contact and vicinity tools) מכילים את מספר התאים ואת השטח הכולל של כל אוכלוסיית תאים בפיקסלים, וכן את ספירות המגע או הסמיכות. לפני ביצוע סימולציה של מיקום תאים אקראי, יש לקבוע בסימולציה זו את הפרמטרים המתארים את התפלגות גודל התאים כהתפלגות גאוסיאנית; בסימולציה זו נשמרו הערכים היחסיים של הסיגמא שנמדדו עבור שלוש אוכלוסיות התאים.
בעוד שערכי ה-Sigma שהוגדרו בפיקסלים נקבעו כך שיתאימו למראה הוויזואלי של התאים שהוקלטו כדי להגדיר את האזורים שבהם ניתן למקם את התאים, נוצרה מסכה מערוץ ה-DAPI. לאחר מכן נקבע ערך של 10 כסף תרגיש הצפיפות האופטימלי ליצירת התמונות הבינאריות. לאחר מכן נבחנה הרלוונטיות של המגעים של תאי פלזמה,אוזינופילים או תאי B עם התאים הסטרומליים, כצפוי.
ניתוחים אלו חשפו שיעורי מגע גבוהים משמעותית בתמונות שהוקלטו בהשוואה לסימולציה עבור תאי פלזמה ותאי B. לעומת זאת, לא נצפה הבדל ברור במגע בין אאוזינופילים לתאי הסטרומה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בכל תחום הדורש ניתוח של מבנה הרקמה המורכב של מחול השומח, כגון אימונולוגיה, המטולוגיה, פתולוגיה או ביולוגיה של תאי גזע.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הטכניקה כוללת צביעת חתכי רקמה וניתוח דיגיטלי של התמונות שהתקבלו להערכת אינטראקציות תאיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- היסטולוגיה
רקע
- הבנת האינטראקציות התאיות במח העצם היא קריטית למחקר אימונולוגי.
- חתכים היסטולוגיים בהקפאה (cryo sections) משמשים להדמיה של סוגי תאים שונים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת הדמיה מפורטת של תאים צבועים.
- ניתוח כמותי של אינטראקציות אלו יכול לספק תובנות לגבי תגובות חיסוניות.
מטרת המחקר
- לכימות קשרי גומלין בין תתי-אוכלוסיות ספציפיות של תאים במח עצם.
- לפיתוח שיטה לכימות חד-משמעי של קשרי גומלין תאיים.
- לסימולציית מיקומי תאים לצורך חישוב שיעורי מגע בין תאים אימונולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף חתכים היסטולוגיים קריוגניים מעצמות ירך של עכברים.
- צביעת חתכים לצורך אנליזה אימונופלואורסצנטית.
- רכישת תמונות קונפוקאליות לצורך אנליזה.
- אנליזה דיגיטלית לקביעת אינטראקציות תאיות וקשרי מיקרו-סביבה.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של קשרי תאים במח העצם.
- זיהוי שיעורי המגע בין תאים אימונולוגיים ספציפיים.
- תיקוף של השיטה באמצעות השוואות לתמונות סימולציה.
- תובנות לגבי הנישות של המיקרו-סביבה עבור תאי פלזמה ארוכי חיים.
מסקנות
- השיטה שפותחה מספקת גישה חסונה לניתוח אינטראקציות תאיות.
- נתונים כמותיים יכולים לשפר את ההבנה של דינמיקה של תאי חיסון.
- ניתן להחיל טכניקה זו על מחקרים שונים הכוללים מח עצם ותגובות חיסוניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות קו-לוקליזציה תאית במח עצם נותן מענה לאתגר קריטי במחקר בתחומי האימונולוגיה וההמטולוגיה: ההבחנה בין קשרי ביולוגיה אמיתיים לבין מיקום תאי מקרי. שיטה זו מספקת ניתוח כמותי הניתן לשחזור של אינטראקציות המטופוייטיות-סטרומליות, מפחיתה הטיות תלויות-בוחן ומשפרת את המהימנות בין בוחנים. גישה זו תומכת בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלב הגילוי הפרה-קליני, על ידי מתן אפשרות להערכה מבוססת נתונים של הדינמיקה בסביבה המיקרו-תאית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של מגעים ישירים בין תאים המטופויטיים לתאי סטרומה ברקמות מורכבות.
- ערך תפעולי: מספק מדידה לא מוטה של קשרי תאים, ובכך מפחית שונות הנובעת מספירה ידנית ומשפר את השחזוריות של הבדיקה.
- ערך חיזוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי הבחנה בין קשרי תאים מועדפים לבין קולוקליזציה אקראית באמצעות סימולציה סטטיסטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטים כמותיים סטנדרטיים (תדרי מגע וקרבה) עבור תתי-אוכלוסיות של תאי המטופואזיס בתוך המיקרו-סביבה של מוח העצם.
- ערך תפעולי: מאפשר רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה ותהליכי עבודה של ניתוח דיגיטלי התואמים לפלטפורמות של מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- יכולת הרחבה: מקל על עיבוד של קבוצות חתכי עצם ירך באמצעות כלי סימולציה אוטומטיים ליצירת נתונים עקביים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת נתוני אינטראקציה תאית משלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אפיון נישות של מיקרו-סביבה עבור תאי פלזמה ארוכי חיים ותתי-אוכלוסיות חיסוניות אחרות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: משתמשת בכלי סימולציה כדי לבחון האם קו-לוקליזציה שנצפתה משקפת העדפה ביולוגית לעומת מיקום אקראי, ובכך מחזקת את הביטחון במטרה.
- מערכת רלוונטית למחלה: ישימה למחקרים באימונולוגיה, המטולוגיה, פתולוגיה וביולוגיה של תאי גזע, שבהם ניתוח של מיקרו-סביבת מח העצם הוא קריטי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מוקדם של מטרות ועד למחקר פרה-קליני, ותומכת בבדיקת היפותזות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים באינטראקציות בין תאים המטופויטיים לתאי סטרומה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות קשרי תאים והקשר מיקרו-סביבתי ברקמות מחיתית העצם.
- סריקה: מאפשר מוכנות של בדיקות באמצעות תהליכי עבודה סטנדרטיים של רכישת תמונות, סגמנטציה וכימות קולוקליזציה.
- אנליזה: מספק תוצאות כמותיות (שיעורי מגע, תדרי קרבה) והשוואה סטטיסטית מבוססת סימולציה להערכת מובהקות ביולוגית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי גילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי אפיון נישות תאיות הרלוונטיות לתפקוד התמדה של תאי חיסון.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת ניתנת לשימוש חוזר לניתוח היסטולוגי כמותי במגוון מחקרי מחיתית העצם ומודלים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי אספקת כימות אובייקטיבי של אינטראקציות תאיות המגובה בסימולציה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות ניתוח תמונות אוטומטי ופרוטוקולי סימולציה של סדרות (batches).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בנתוני אסוציאציה תאית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון על בסיס אינטראקציות של מיקרו-סביבה שעברו תיקוף כמותי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בצביעה אימונופלואורסצנטית, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונות דיגיטלי לזיהוי תאי המטופויזים ותאי סטרומה.
- תלוי במיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר, הכוללת עדשות מתאימות וממוצע קווים (line averaging) לרכישת תמונות ניתנות להשוואה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פורמטים של קובצי תמונה, טיפול בנתוני CSV ופרמטרים של כלי הסימולציה לצורך השגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי תאים וחתכי רקמה שונים, כולל קביעת סף לגודל תא וערכי sigma לסימולציה מדויקת.
- מגבלה מעשית: דיוק הסימולציה תלוי במדידה מדויקת של התפלגות גודל התאים וביצירת מסכה מערוץ ה-DAPI להגדרת מבנה הסטרומה.
