אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified
8 באפריל 2015
מוצגת אסטרטגיה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקטעי רקמה מביאה לתמונות דו-ממדיות, המנותחות אוטומטית. ניתוחי לוקליזציה משותפת של סוגי תאים שונים מושווים לנתונים מתמונות מדומות, ונותנים מידע כמותי על אינטראקציות תאיות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את הקשרים בין תת-קבוצות תאים ספציפיות במח העצם. זה מושג על ידי איסוף תחילה של קטעי קריו היסטולוגיים מגידולי עצם הירך של העכברים. בשלב השני, החלקים מוכתמים לניתוח אימונו-פלואורסצנטי ונרכשות תמונות קונפוקליות.
לאחר מכן התמונות מנותחות באופן דיגיטלי. בסופו של דבר, ניתן לדמות את מיקומם של סוגי התאים השונים כדי לחשב את שיעורי ותדירות המגע בין התאים האימונולוגיים הספציפיים המעניינים לבין המיקרו-סביבה שלהם. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ניתחנו נישות מיקרו-סביבתיות עבור תאי פלזמה בעלי חיים ארוכים במח העצם, והיינו זקוקים לשיטה לכימות חד משמעי של האסוציאציות התאיות בתוך רקמת מח העצם.
RA מאיה תדגים עבורך את הנוהל כדי לשאוב עצמות עצם הירך מעכבר בוגר. ראשית, הגדר את טמפרטורת הדגימה והלהב של מיקרוטום סטנדרטי המצויד בלהב רקמה קשה ל-24 מעלות צלזיוס שליליות. לאחר התאקלמות של 15 דקות.
תקן בלוק מדגם למחזיק דגימת המתכת עם מדיום הטמעת קריו והתאם את כיוון הבלוק לפי הצורך. חתוך את הדגימה עד שהעצם נפתחת במלואה והמח נראה לעין. לאחר מכן התאם את עובי הקטע לשבעה מיקרון.
לאחר מכן, תקן חתיכת סרט דבק קוואמוטו עם הצד הדביק בחלק העליון של בלוק דגימה באמצעות מרית עץ מכוסה עור יקר חתך את הדגימה ובאמצעות מלקחיים. סובב את הקלטת כך שהחלק ימוקם בצד העליון. לאחר מכן העבירו את הקלטת לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
תקן את הקלטת למגלשת הזכוכית בעזרת סקוטש כאשר החלק האחרון נאסף. תנו לדגימות לנסוע לפחות 30 דקות ואחסנו את השקופיות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. שתי נשים מצלמות את הדגימות מכתימות את קטעי הקריו המופשרים על פי פרוטוקולי אימונופלואורסצנציה נפוצים.
הקפידו לכלול כתם גרעיני להמחשת שלמות הרקמה. לאחר שהחלקים הוכתמו, הוסף טיפה אחת של תושבת רצפה לכל דגימה, ואחריה החלקת כיסוי זכוכית מספר אחת במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר. בחר את עדשת האובייקט של 20 x והגדר שדה view של 708 נקודה 15 על 708 נקודה 15 מיקרון.
לאחר מכן דמיין את הדגימות אחת בכל פעם ב-2048 על 2048 פיקסלים לתמונה כדי לשמור על התוצאות ניתנות להשוואה. הקלטת התמונות בערוץ אחד להמחשת המבנים הסטרומליים, ערוץ אחד לגרעינים וערוצים נוספים לתאים ההמטופויאטיים המעניינים לפי הצורך. הקלט את התמונות באמצעות חישוב ממוצע קווים.
באופן אידיאלי ללכוד תמונות סמוכות בודדות כדי לכסות את כל קטע הירך. לאחר מכן שמור את התמונות בפורמט קובץ תמונה מיקרוסקופי. לאחר מכן ייצא קובץ JPEG אחד לכל ערוץ עבור כל אזור בתמונה, והשתמש בכלי ניתוח תמונה כדי לבצע את כימות פילוח התמונה של קולוקליזציה וניתוח שכונה לפני ביצוע הסימולציות של התא האקראי.
מיקום על תמונות מח העצם המנותחות עבור כל תמונה להדמיה. מקם את הקבצים הבאים בתיקיה אחת, קבצי ה- CSV הבודדים המסופקים על-ידי כלי יצירת הקשר עם התא. קובצי ה-JPEG המקוריים של ערוץ DPI וקובצי ה-JPEG המקוריים של ערוץ הסטרומה לביצוע הדמיות אצווה בסדרת התמונות מדגימת עצם הירך הבודדת היחידה כדי להעביר את כל קובצי ה-JPEG המקוריים וקובצי ה-CSV הבודדים המתאימים שלהם לתיקייה אחרת גם בשלב זה.
לאחר הרכבת כל הקבצים, הפעל את כלי הסימולציה. לאחר מכן סמן את התיבה טען אוטומטית נתוני תמונה. כאשר אפשרות זו מסומנת, קבצי ה-CSV המתאימים לתמונות המנותחות נפתחים אוטומטית.
לאחר מכן, הזן את התג המשותף עבור קבצי ה- CSV ואת מספר ערכות התמונות שיש להשתמש בהן להדמיית מצב אצווה. לאחר מכן טען את קובץ ה-J peg שנוצר מערוץ S stroma עם שם קובץ המסתיים בשלוש כדי ליצור את המסכה עבור ערוץ ה-DPI. סמן את התיבה החל מסכה והגדר את הסף להמרת תמונת ה-DPI למסכה בינארית ל-10.
סמן את תיבות שמונה הסיביות וההרחבה והגדר את דרגת ההתרחבות לחמישה פיקסלים. לאחר מכן סמן את תיבת שחיקת הרוחב. לאחר מכן הזן את הערך הרצוי עבור רדיוס הסביבה המשמש לניתוח התמונות המדומות, וסמן את התיבה השתמש ב-OSU כדי להשתמש באלגוריתם OSU לזיהוי אוטומטי של המבנים הסטרומליים עבור התאים ההמטופויאטיים.
מדומים כצורות מעגליות. מדוד את התפלגות גודל התא של סוגי התאים המנותחים עם כל תוכנת ניתוח תמונה הכוללת את פונקציות פילוח האובייקטים המתאימות, וקבע את הסיגמא עבור כל הסוגים ההמטופויאטיים ממדידות אלה. ניתן לקבוע את חתך גודל התא, כלומר הקוטר בפיקסלים המתאר את האובייקט הקטן ביותר שעדיין מזוהה כתא השלם על ידי כלי ניתוח התמונה.
לאחר מכן הזן את חתך גודל התא ואת הסיגמא בפיקסלים להדמיה של התפלגות גודל התא עבור התאים האדומים, הירוקים והכחולים. לאחר מכן, בכרטיסיה תאים ומסיכה, סמן את תיבת המחיקה כדי לאפשר לתוכנית לבחור מיקום חדש עבור תא אם הוא חופף לפיקסל אחד לפחות באזור אסור של המסיכה. תחת הכרטיסיה אי-הכללת תאים, סמן גם את התיבה הימנע מחפיפת תאים.
לאחר מכן הזן את המרחק המינימלי המותר בין מרכזי שני תאים בפיקסלים. אם החפיפה מוגדרת על ידי המרחק המינימלי ממרכז תא אחד למרכז תא אחר, הגדר את שטח החפיפה המרבי ל- 100% לאחר מכן הגדר את כלי הסימולציה ל- 1000 חזרות. לאחר מכן סמן את תיבת המכירה לשמירה אוטומטית כדי לשמור את הקואורדינטות של האובייקטים המדומים עבור כל החזרות של כל תמונה של האצווה כקבצים הרוסים בפורמט טקסט.
הזן תג משותף גם לקבצים השמורים. לבסוף, לחץ על הפעל סימולציה וקבע את תדרי המגע והסביבה הממוצעים של קבוצות של 1000 תמונות מדומות המתאימות לכל תמונה מוקלטת. עבור חלוקה זו, המגע והסביבה הממוצעים נספרים על ידי ספירת התאים המוקלטת לתמונה, ומשווים את התדרים לתוצאות ניתוח הקולוקליזציה האוטומטי של התמונה המוקלטת.
באיור זה מוצג ניתוח לוקליזציה של אאוזינופילים, תאי פלזמה ותאי B עם מיקרו-סביבה של תאי סטרומה עם מח עצם כימרי פלואורסצנטי. קבצי ה-CSV שנוצרו על ידי כלי המגע והסביבה של התא מכילים את ספירת התאים ואת השטח הכולל עבור כל אוכלוסיית תאים בפיקסלים, כמו גם את ספירת אנשי הקשר או הסביבה. לפני ביצוע סימולציה של מיקום התא האקראי, יש לקבוע את הפרמטרים המתארים את התפלגות גודל התא כהתפלגות גאוס בסימולציה זו, הערכים היחסיים של הסיגמא שנמדדו עבור שלוש אוכלוסיות התאים נשמרו.
בעוד שערכי הסיגמא שהוגדרו בפיקסלים הוגדרו כך שיתאימו למראה החזותי של התאים המוקלטים כדי להגדיר את האזורים שבהם ניתן למקם את התאים, נוצרה מסיכה מערוץ DAPI. לאחר מכן נקבע ערך של 10 כסף הצפיפות האופטימלי ליצירת התמונות הבינאריות. לאחר מכן נבדקה הרלוונטיות של המגעים של תאי הפלזמה, האאוזינופילים או תאי B עם תאי הסטרומה כצפוי.
ניתוח זה חשף שיעורי מגע גבוהים משמעותית בתמונות המוקלטות בהשוואה לסימולציה של תאי הפלזמה ותאי B. לעומת זאת, לא נצפה הבדל ברור במגע בין תאי סטרומה של אאוזינופילים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכל תחום הדורש ניתוח של מבנה הרקמה המורכב של מח העצם, כגון אימונולוגיה, המטולוגיה, פתולוגיה או ביולוגיה של תאי גזע.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הטכניקה כוללת צביעת חתכי רקמות וניתוח דיגיטלי של התמונות המתקבלות כדי להעריך אינטראקציות תאיות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- היסטולוגיה
רקע
- הבנת האינטראקציות התאיות במח העצם חיונית למחקר אימונולוגי.
- חתכי קריו היסטולוגיים משמשים לדמיית סוגי תאים שונים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת הדמיה מפורטת של תאים צבועים.
- ניתוח כמותי של אינטראקציות אלו יכול לספק תובנות לגבי תגובות חיסוניות.
מטרת המחקר
- כימות האסוציאציות בין תת-קבוצות תאים ספציפיות במח העצם.
- פיתוח שיטה לכימות ללא עמימות של אסוציאציות תאיות.
- סימולציה של מיקומי תאים לחישוב שיעורי המגע בין תאים חיסוניים.
שיטות בשימוש
- איסוף חתכי קריו היסטולוגיים מעצמות ירך של עכברים.
- צביעת חתכים לניתוח אימונופלואורסצנטי.
- רכישת תמונות קונפוקליות לניתוח.
- ניתוח דיגיטלי לקביעת אינטראקציות תאיות ושייכות למיקרו-סביבה.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של אסוציאציות תאיות במח העצם.
- זיהוי שיעורי מגע בין תאים חיסוניים ספציפיים.
- אימות השיטה באמצעות השוואה עם תמונות מדמות.
- תובנות לגבי הנישות המיקרו-סביבתיות לתאי פלזמה ארוכי-חיים.
מסקנות
- השיטה שפותחה מספקת גישה חזקה לניתוח אינטראקציות תאיות.
- נתונים כמותיים יכולים לשפר את ההבנה של הדינמיקה של תאי חיסון.
- שיטה זו יכולה לשמש במחקרים שונים הכוללים מח עצם ותגובות חיסוניות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantifying cellular co-localization in bone marrow addresses a critical challenge in immunology and hematology research: distinguishing true biological associations from random cell positioning. This method provides reproducible, quantitative analysis of hematopoietic-stromal interactions, reducing rater-dependent bias and enhancing interrater reliability. The approach supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery by enabling data-driven assessment of cellular microenvironment dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying direct contacts between hematopoietic and stromal cells in complex tissues.
- Operational Value: Provides unbiased measurement of cellular associations, reducing variability from manual counting and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing preferential cell associations from random co-localization through statistical simulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized quantitative outputs (contact and vicinity frequencies) for hematopoietic cell subsets within the bone marrow microenvironment.
- Operational Value: Enables high-resolution image acquisition and digital analysis workflows compatible with confocal microscopy platforms.
- Scalability: Facilitates batch processing of multiple femoral sections via automated simulation tools for consistent data generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase cellular interaction data to preclinical validation by characterizing microenvironmental niches for long-lived plasma cells and other immune subsets.
- Mechanistic De-risking: Uses simulation tools to test whether observed co-localization reflects biological preference versus random positioning, strengthening target confidence.
- Disease-Relevant System: Applicable to studies in immunology, hematology, pathology, and stem cell biology where bone marrow microenvironment analysis is critical.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, supporting hypothesis testing and biological de-risking in hematopoietic and stromal cell interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying cellular associations and microenvironmental context in bone marrow tissues.
- Screening: Enables assay readiness through standardized image acquisition, segmentation, and colocalization quantification workflows.
- Analytics: Delivers quantitative readouts (contact rates, vicinity frequencies) and simulation-based statistical comparison to assess biological significance.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by characterizing cellular niches relevant to immune cell function and persistence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for quantitative histological analysis across multiple bone marrow studies and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing objective, simulation-backed quantification of cellular interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated image analysis and batch simulation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in cellular association data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitatively validated microenvironmental interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy, and digital image analysis for hematopoietic and stromal cell detection.
- Dependent on laser scanning confocal microscopy with appropriate objectives and line averaging for comparable image acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of image file formats, CSV data handling, and simulation tool parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types and tissue sections, including cell size cutoff and sigma determination for accurate simulation.
- Practical limitation: Simulation accuracy depends on precise measurement of cell size distribution and mask generation from DAPI channel for stromal structure definition.
